运动对大鼠胸主动脉损伤后c-myc、c-fos和p53表达的影响
作者： 殷松楼 张宝慧
单位：殷松楼 (江苏省徐州医学院附属医院内分泌科 221002)；张宝慧 (北京医科大学第三医院康复医学中心)
关键词：运动；大鼠；胸主动脉损伤；原癌基因；抗癌基因
中国运动医学杂志990103 提要 采用原位杂交方法分析了大鼠胸主动脉损伤后原癌基因c-myc、c-fos和抗癌基因p53表达情况，并观察运动对其影响。结果表明：动脉损伤后c-fos、c-myc表达明显增加，p53表达下降；运动组c-fos和c-myc明显被控制，p53表达增强。研究结果提示运动对纠正原癌基因和抗癌基因表达失衡有作用，为运动防治平滑肌细胞过度增殖性疾病的分子生物学机制研究提供了线索。
Exercise Effects on Expression of c_fos,c_myc and p53 in Rats after Thoracic Aorta Injury
, http://www.100md.com
Yin Songlou,Zhan Baohui
Rehabilitation Center of third Hospital,Beijing Medieal University
Expression of proto-oncogene c-fos,c-myc and anti-oncogene p53 were analysed in situ in rats after thoracic aorta injury,and effects of exercise on the expression of c-fos,c-myc and p53 were observed. The results showed that the expression of c-fos and c-myc evidently increased and the expression of p53 decreased after artery injury.Expression of c-fos and c-myc were inhibited and expression of p53 was enhanced in the exercise group.The results suggested that exercise could correct unbalance of expression between proto-oncogene and anti-oncogene which might be the important molecular biologic mechanism of preventing and treating the diseases with SMC over-proliferation through exercise.
, 百拇医药
Key words: exercise,rats,aorta injury,proto-oncogeme,anti-oncogene
原癌基因是生命必需的基因，它是编码关键性调控蛋白的正常细胞基因。近年来研究发现，原癌基因c_myc、c_fos和抗癌基因p53表达异常与动脉粥样硬化(AS)、经皮腔内冠状动脉球囊成形术(PTCA)后再狭窄、高血压等病理形成密切相关。这类疾病严重威胁人类健康，目前尚无有效措施加以防治。运动已作为预防和治疗冠心病、PTCA再狭窄、高血压病的措施之一，但其机制尚未明了。本研究旨在研究大鼠动脉球囊损伤后c_myc、c_fos和p53表达的改变，观察运动对它们的影响，从基因水平探讨运动抑制平滑肌细胞大量增殖的有关机制。
1 材料和方法
1.1 动物分组和运动方案
雄性Wistar大鼠30只，体重300～350克/只，由北京医科大学动物科学中心提供，随机分成3组：(1)假手术组(SO)；(2)胸主动脉球囊损伤组(ABD)；(3)ABD+运动组(ABD+EX)。ABD+EX组术后24小时开始游泳训练，1.5小时/天，5天/周，共4周。游泳池为圆形，水深65cm，内径55cm，水温33℃，于术后4周处死动物，取胸主动脉。
, 百拇医药
1.2 大鼠胸主动脉内皮剥脱术[1]
ABD组和ABD+EX组大鼠戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉，2F Fogarty球囊导管自左颈总动脉插入至膈下1～2cm，向导管内注入生理盐水0.1ml，充盈球囊，将球囊拉至主动脉弓如此反复3次可剥脱胸主动脉内皮，退出导管结扎左颈总动脉，SO组只做左颈总动脉结扎不剥脱胸主动脉内皮。
1.3 原位杂交技术检测胸主动脉c_myc、c_fos和p53 mRNA。
术后4周大鼠断头后速取胸主动脉，OCT包埋，连续冰冻切片，每只做5张切片，片厚6μm，贴于涂有L—多聚赖氨酸载玻片上，4%多聚甲醛固定5分钟，吹干。
杂交前预处理：PBS洗；0.2N HCl 20～30分钟；0.1μg/ml PK,37℃，20分钟；0.2%甘氨酸15分钟；4%多聚甲醛10～45分钟；2×SSC洗5分钟×3次。
, 百拇医药
预杂交：37℃预杂交1小时(预杂交液：去离子甲酰胺，20×SSC,50×Denhard's液，10mg/l鲑精DNA，10mg/l酵母tRNA,50%硫酸葡聚糖)。
杂交：预杂交液中加入适量地高辛标记的探针，42℃ 10～12小时(探针工作浓度均为0.52μg/ml)。
杂交后洗涤：2×SSC,37℃，3分钟×2次；1×SSC；Buffer Ⅰ 2分钟；Buffer Ⅱ30分钟，37℃，15分钟×2次。
杂交后检则：地高辛抗体(1∶5000)，37℃，1小时；Buffer Ⅰ洗15分钟×2次；Buffer Ⅲ洗2分钟；显色(显色液：NBT+X—phosphate+Buffer Ⅲ)；BufferⅢ终止反应；脱水，透明，封片，光镜观察反应结果，碱性磷酸酶标记的地高辛抗体与NBT反应生成蓝色或褐色颗粒为阳性反应。
, 百拇医药 阴性对照：用地高辛试剂盒中非相关探针替代特异探针，DIG—非同位素DNA标记及检测Kit由BM公司购得。
2 结果
2.1 原癌基因c_fos和c_myc mRNA表达的改变(图1～4)
SO组均为阴性；ABD组：c_fos和c_myc mRNA表达明显增加(片中显示蓝色颗粒)，表明动脉损伤后原癌基因被激活，表达增加；ABD+EX组：有少量的阳性颗粒，但和ABD组相比明显少，颜色淡，提示运动抑制了c_fos和c_myc表达。
图1 ABD组c_myc原位杂交结果(×400)
Fig 1.The result of c_myc situ hybridization
, 百拇医药
in ABD group(×400)
图2 ABD+EX组c_myc原位杂交结果(×400)
Fig 2.The result of c_myc situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
图3 ABD组c_fos原位杂交结果(×400)
Fig 3.The result of c_fos situ hybridization
in ABD group(×400)
, http://www.100md.com
图4 ABD+EX组c_fos原位杂交结果(×400)
Fig 4.The result of c_fos situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
2.2 抗癌基因p53 mRNA表达的改变(图5～6)
SO组：无阳性颗粒；ABD组：有少量的阳性颗粒；ABD+EX组：阳性颗粒明显增加，颜色为蓝色，表明运动增加p53 mRNA表达。
图5 ABD组p53原位杂交结果(×400)
Fig 5.The result of p53 situ hybridization
, http://www.100md.com
in ABD group(×400)
图6 ABD+EX组p53原位杂交结果(×400)
Fig 2.The result of p53 situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
3 讨论
大量病理学研究证实，平滑肌细胞(SMC)异常增殖和向内膜下迁移是AS、PTCA再狭窄等疾病发生的关键因素。本研究模型在动脉损伤后出现SMC的异常增殖[2]，说明以此模型作为研究这类疾病的动物模型是可行的。
在人类已发现的100多种原癌基因中，c_myc、c_fos等属即刻早期反应基因，编码核结合蛋白。另外，原癌基因尚可编码生长因子样物质、生长因子受体、参与细胞内信号传导等。通过这些途径参与心血管病理过程，尤其是SMC的异常增殖。在动脉粥样硬化病灶中，原癌基因sis、myc、fos表达明显增强[3]，本研究中c_myc、c_fos于动脉内皮剥脱后表达明显增强，和文献[4]报道一致，原癌基因激活是SMC增殖的触发和始动因素，动脉损伤与原癌基因激活存在密切关系[3，5]。在以SMC增殖为主要病理特点的疾病如AS、PTCA术后再狭窄等，均有促有丝分裂因子(如内皮素、自由基)和抑制因子(如一氧化氮、前列环素)平衡紊乱及原癌基因和抗癌基因表达失调的表现。动物研究表明，内皮素(ET)抗血清可缩小心肌梗塞大鼠的梗塞范围，一氧化氮(NO)生成物、反义c_myc、反义c_fos、反义c_myc和正义p53抑制SMC大量增殖，提示可纠正平衡紊乱，有可能防治上述血管疾病的发生。
, 百拇医药
本研究结果表明运动后原癌基因c_myc和c_fos表达减少，抗癌基因p53表达增加。正常血管NO主要由内皮细胞合成和分泌，内皮细胞(EC)的L—精氨酸/NO的功能之一就是使内膜下SMC维持在静止期。动脉损伤后，因内皮功能和SMC表型发生变化，使血管促有丝分裂因子(如内皮素、自由基)处于优势，而抑制因子(如NO、SOD)影响减小；ET通过磷酸肌醇途径激活原癌基因；自由基一方面损伤EC，另一方面可直接激活原癌基因致SMC大量增殖。运动可增加损伤动脉NO生
成[2]，NO可灭活自由基，中断自由基链式反应，NO通过cGMP途径抑制ET生成，拮抗ET的缩血管作用，阻断原癌基因的开放，这可能是运动抑制动脉损伤后SMC异常增殖的重要分子生物学机制。
大量流行病学资料研究表明，适量运动能防治冠心病，临床上已把运动作为治疗AS、高血压的一种措施。文献报道[6，7]运动可减轻PTCA术后再狭窄程度。我们过去的研究表明运动能抑制大鼠动脉损伤后SMC异常增殖[2]，本研究从基因水平进一步探讨其机制，这将为血管系统疾病运动疗法的临床应用提供理论依据，对临床疾病运动疗法机制的研究有一定参考价值。
, http://www.100md.com
*由国家体育总局资助
4 参考文献
[1]Reidy MA,et al.Endothelial regeneration,inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit.Lab Invest 1991;49:569.
[2]殷松楼等.运动对大鼠胸主动脉损伤后细胞增殖的影响.中国康复医学杂志.1996，11(2)：49-51.
[3]Miano JM,et al.Early proto-oncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal.Am J Pathol 1990,137:761.
, 百拇医药
[4]汤健等.原癌基因与心血管疾病.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1990，第1版，130-145.
[5]Majesky MW,et al.PDGF ligand and receptor gene expression during repair of arterial injury.J Cell Biochem 1990,111:2149.
[6]张宝慧等.康复运动对冠脉再通的影响.中国康复医学杂志.1994，3(2)：1.
[7]Hiroshis MD,et al.Preventive effect of exercise training on recurrents stenosis after pecutaneous transluminal coronary angioplasty(PTCA).Japanese Circulation Journal 1992,56(3):413-421.
(1997.05.22收稿), 百拇医药
单位：殷松楼 (江苏省徐州医学院附属医院内分泌科 221002)；张宝慧 (北京医科大学第三医院康复医学中心)
关键词：运动；大鼠；胸主动脉损伤；原癌基因；抗癌基因
中国运动医学杂志990103 提要 采用原位杂交方法分析了大鼠胸主动脉损伤后原癌基因c-myc、c-fos和抗癌基因p53表达情况，并观察运动对其影响。结果表明：动脉损伤后c-fos、c-myc表达明显增加，p53表达下降；运动组c-fos和c-myc明显被控制，p53表达增强。研究结果提示运动对纠正原癌基因和抗癌基因表达失衡有作用，为运动防治平滑肌细胞过度增殖性疾病的分子生物学机制研究提供了线索。
Exercise Effects on Expression of c_fos,c_myc and p53 in Rats after Thoracic Aorta Injury
, http://www.100md.com
Yin Songlou,Zhan Baohui
Rehabilitation Center of third Hospital,Beijing Medieal University
Expression of proto-oncogene c-fos,c-myc and anti-oncogene p53 were analysed in situ in rats after thoracic aorta injury,and effects of exercise on the expression of c-fos,c-myc and p53 were observed. The results showed that the expression of c-fos and c-myc evidently increased and the expression of p53 decreased after artery injury.Expression of c-fos and c-myc were inhibited and expression of p53 was enhanced in the exercise group.The results suggested that exercise could correct unbalance of expression between proto-oncogene and anti-oncogene which might be the important molecular biologic mechanism of preventing and treating the diseases with SMC over-proliferation through exercise.
, 百拇医药
Key words: exercise,rats,aorta injury,proto-oncogeme,anti-oncogene
原癌基因是生命必需的基因，它是编码关键性调控蛋白的正常细胞基因。近年来研究发现，原癌基因c_myc、c_fos和抗癌基因p53表达异常与动脉粥样硬化(AS)、经皮腔内冠状动脉球囊成形术(PTCA)后再狭窄、高血压等病理形成密切相关。这类疾病严重威胁人类健康，目前尚无有效措施加以防治。运动已作为预防和治疗冠心病、PTCA再狭窄、高血压病的措施之一，但其机制尚未明了。本研究旨在研究大鼠动脉球囊损伤后c_myc、c_fos和p53表达的改变，观察运动对它们的影响，从基因水平探讨运动抑制平滑肌细胞大量增殖的有关机制。
1 材料和方法
1.1 动物分组和运动方案
雄性Wistar大鼠30只，体重300～350克/只，由北京医科大学动物科学中心提供，随机分成3组：(1)假手术组(SO)；(2)胸主动脉球囊损伤组(ABD)；(3)ABD+运动组(ABD+EX)。ABD+EX组术后24小时开始游泳训练，1.5小时/天，5天/周，共4周。游泳池为圆形，水深65cm，内径55cm，水温33℃，于术后4周处死动物，取胸主动脉。
, 百拇医药
1.2 大鼠胸主动脉内皮剥脱术[1]
ABD组和ABD+EX组大鼠戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉，2F Fogarty球囊导管自左颈总动脉插入至膈下1～2cm，向导管内注入生理盐水0.1ml，充盈球囊，将球囊拉至主动脉弓如此反复3次可剥脱胸主动脉内皮，退出导管结扎左颈总动脉，SO组只做左颈总动脉结扎不剥脱胸主动脉内皮。
1.3 原位杂交技术检测胸主动脉c_myc、c_fos和p53 mRNA。
术后4周大鼠断头后速取胸主动脉，OCT包埋，连续冰冻切片，每只做5张切片，片厚6μm，贴于涂有L—多聚赖氨酸载玻片上，4%多聚甲醛固定5分钟，吹干。
杂交前预处理：PBS洗；0.2N HCl 20～30分钟；0.1μg/ml PK,37℃，20分钟；0.2%甘氨酸15分钟；4%多聚甲醛10～45分钟；2×SSC洗5分钟×3次。
, 百拇医药
预杂交：37℃预杂交1小时(预杂交液：去离子甲酰胺，20×SSC,50×Denhard's液，10mg/l鲑精DNA，10mg/l酵母tRNA,50%硫酸葡聚糖)。
杂交：预杂交液中加入适量地高辛标记的探针，42℃ 10～12小时(探针工作浓度均为0.52μg/ml)。
杂交后洗涤：2×SSC,37℃，3分钟×2次；1×SSC；Buffer Ⅰ 2分钟；Buffer Ⅱ30分钟，37℃，15分钟×2次。
杂交后检则：地高辛抗体(1∶5000)，37℃，1小时；Buffer Ⅰ洗15分钟×2次；Buffer Ⅲ洗2分钟；显色(显色液：NBT+X—phosphate+Buffer Ⅲ)；BufferⅢ终止反应；脱水，透明，封片，光镜观察反应结果，碱性磷酸酶标记的地高辛抗体与NBT反应生成蓝色或褐色颗粒为阳性反应。
, 百拇医药 阴性对照：用地高辛试剂盒中非相关探针替代特异探针，DIG—非同位素DNA标记及检测Kit由BM公司购得。
2 结果
2.1 原癌基因c_fos和c_myc mRNA表达的改变(图1～4)
SO组均为阴性；ABD组：c_fos和c_myc mRNA表达明显增加(片中显示蓝色颗粒)，表明动脉损伤后原癌基因被激活，表达增加；ABD+EX组：有少量的阳性颗粒，但和ABD组相比明显少，颜色淡，提示运动抑制了c_fos和c_myc表达。
图1 ABD组c_myc原位杂交结果(×400)
Fig 1.The result of c_myc situ hybridization
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in ABD group(×400)
图2 ABD+EX组c_myc原位杂交结果(×400)
Fig 2.The result of c_myc situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
图3 ABD组c_fos原位杂交结果(×400)
Fig 3.The result of c_fos situ hybridization
in ABD group(×400)
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图4 ABD+EX组c_fos原位杂交结果(×400)
Fig 4.The result of c_fos situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
2.2 抗癌基因p53 mRNA表达的改变(图5～6)
SO组：无阳性颗粒；ABD组：有少量的阳性颗粒；ABD+EX组：阳性颗粒明显增加，颜色为蓝色，表明运动增加p53 mRNA表达。
图5 ABD组p53原位杂交结果(×400)
Fig 5.The result of p53 situ hybridization
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图6 ABD+EX组p53原位杂交结果(×400)
Fig 2.The result of p53 situ hybridization
in ABD+EX group(×400)
3 讨论
大量病理学研究证实，平滑肌细胞(SMC)异常增殖和向内膜下迁移是AS、PTCA再狭窄等疾病发生的关键因素。本研究模型在动脉损伤后出现SMC的异常增殖[2]，说明以此模型作为研究这类疾病的动物模型是可行的。
在人类已发现的100多种原癌基因中，c_myc、c_fos等属即刻早期反应基因，编码核结合蛋白。另外，原癌基因尚可编码生长因子样物质、生长因子受体、参与细胞内信号传导等。通过这些途径参与心血管病理过程，尤其是SMC的异常增殖。在动脉粥样硬化病灶中，原癌基因sis、myc、fos表达明显增强[3]，本研究中c_myc、c_fos于动脉内皮剥脱后表达明显增强，和文献[4]报道一致，原癌基因激活是SMC增殖的触发和始动因素，动脉损伤与原癌基因激活存在密切关系[3，5]。在以SMC增殖为主要病理特点的疾病如AS、PTCA术后再狭窄等，均有促有丝分裂因子(如内皮素、自由基)和抑制因子(如一氧化氮、前列环素)平衡紊乱及原癌基因和抗癌基因表达失调的表现。动物研究表明，内皮素(ET)抗血清可缩小心肌梗塞大鼠的梗塞范围，一氧化氮(NO)生成物、反义c_myc、反义c_fos、反义c_myc和正义p53抑制SMC大量增殖，提示可纠正平衡紊乱，有可能防治上述血管疾病的发生。
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本研究结果表明运动后原癌基因c_myc和c_fos表达减少，抗癌基因p53表达增加。正常血管NO主要由内皮细胞合成和分泌，内皮细胞(EC)的L—精氨酸/NO的功能之一就是使内膜下SMC维持在静止期。动脉损伤后，因内皮功能和SMC表型发生变化，使血管促有丝分裂因子(如内皮素、自由基)处于优势，而抑制因子(如NO、SOD)影响减小；ET通过磷酸肌醇途径激活原癌基因；自由基一方面损伤EC，另一方面可直接激活原癌基因致SMC大量增殖。运动可增加损伤动脉NO生
成[2]，NO可灭活自由基，中断自由基链式反应，NO通过cGMP途径抑制ET生成，拮抗ET的缩血管作用，阻断原癌基因的开放，这可能是运动抑制动脉损伤后SMC异常增殖的重要分子生物学机制。
大量流行病学资料研究表明，适量运动能防治冠心病，临床上已把运动作为治疗AS、高血压的一种措施。文献报道[6，7]运动可减轻PTCA术后再狭窄程度。我们过去的研究表明运动能抑制大鼠动脉损伤后SMC异常增殖[2]，本研究从基因水平进一步探讨其机制，这将为血管系统疾病运动疗法的临床应用提供理论依据，对临床疾病运动疗法机制的研究有一定参考价值。
, http://www.100md.com
*由国家体育总局资助
4 参考文献
[1]Reidy MA,et al.Endothelial regeneration,inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit.Lab Invest 1991;49:569.
[2]殷松楼等.运动对大鼠胸主动脉损伤后细胞增殖的影响.中国康复医学杂志.1996，11(2)：49-51.
[3]Miano JM,et al.Early proto-oncogene expression in rat aortic smooth muscle cells following endothelial removal.Am J Pathol 1990,137:761.
, 百拇医药
[4]汤健等.原癌基因与心血管疾病.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社.1990，第1版，130-145.
[5]Majesky MW,et al.PDGF ligand and receptor gene expression during repair of arterial injury.J Cell Biochem 1990,111:2149.
[6]张宝慧等.康复运动对冠脉再通的影响.中国康复医学杂志.1994，3(2)：1.
[7]Hiroshis MD,et al.Preventive effect of exercise training on recurrents stenosis after pecutaneous transluminal coronary angioplasty(PTCA).Japanese Circulation Journal 1992,56(3):413-421.
(1997.05.22收稿), 百拇医药