SPE结合GC-FID和GC-MS分析血浆中氨基甲酸酯类杀虫剂
作者：李莉 周永新
单位：李莉 周永新(军事医学科学院毒物药物研究所 北京 100850)
关键词：固相萃取法；SPEC混合相萃取柱；GC-FID；GC-MS
药物分析杂志000304 摘要 目的：建立血浆中氨基甲酸酯类杀虫剂SPE结合GC-FID和GC-MS的系统分析方法。方法：用SPEC Multi-Modal混合相固相萃取柱建立血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂的固相萃取方法；采用GC-MS作为定性分析工具，将保留时间 、特征离子和谱库检索相结合实行多指标定性。结果：5种杀虫剂的绝对回收率在60%～96%之间，相对标准偏差小于9%(n=5)。结论：方法系统性好、快速、准确。
Detection of Carbamate Pesticide in Plasma by
, 百拇医药
SPE Combined with GC-FID and GC-MS
Li Li，Zhou Yongxin
(Institute of Pharmacology and Toxicology , 27 Tai-Ping Road , Beijing 100850)
Abstract Objective：To establish a method for detection of 5 carbamate pesticide in plasma by SPE combined with GC-MS.Methods:A new SPEC plus Multi-Modal column was used to extract the 5 carbamate pesticides from plasma. The detection was programmed by combining retention time, diagnostic ions and library search.Results:The absolute recoveries of 5 pesticides were between 60%～96%, with relative standard deviation less than 9%. The detection limits of GC-MS/SIM were 200 ng.mL-1 plasma for tsumacide, isoprocarb and arprocarb , 1 μg.mL-1 plasma for carbaryl and carbofuran.Conclusion:The method is systematic, rapid and accurate.
, 百拇医药
Key words SPE, SPEC Multi-Modal disc, GC-FID, GC-MS
氨基甲酸酯类杀虫剂(carbamate pesticides)是继有机氯和有机磷之后发展的第三代杀虫剂，该类杀虫剂无蓄积作用，杀虫效力强，易分解无残毒，故广泛用于毒杀农业害虫。近年来，自杀、他杀以及使用不慎引起中毒的现象时有发生，因此，有必要建立生物体液中氨基甲酸酯类杀虫剂的分析检测方法，为法庭医学及临床诊断提供依据。
SPEC Multi-Modal多相复合柱是一种新型的紧压式三相混合萃取片，本文作者曾用此种复合柱建立了血浆中5类药物包括巴比妥类、苯二氮NFDA3类、三环吩噻嗪类、局麻药类以及麻醉镇痛药类的系统提取方法[1]。结果表明，这种多相复合萃取片通用性较好，对具有不同理化性质的药物毒物均有较好的回收率。为了扩大系统分析方法的范围，本文继续采用SPEC多相复合柱对血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂进行系统提取，采用GC-MS定性。
, 百拇医药
1 仪器和试剂
PE AutoSystem XL气相色谱仪，配FID检测器和毛细管色谱柱PE-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；VG TRIO-1000型气相色谱质谱联用仪，配有HP-5毛细管色谱柱(25 m×0.32 mm×0.52 μm)；真空固相萃取装置(Waters 公司)。
固相萃取柱 (SPEC.Plus.10ML.C18AR/MP3 Multi.Modal, 美国 ANSYS Inc.) 由香港大诚太平洋有限公司提供。
氨基甲酸酯类对照品：速灭威(tsumacide)、叶蝉散(isoprocarb)、残杀威(arprocarb)、呋喃丹(carbofuran)、西维因(carbaryl)均购自农业部农药鉴定所，纯度均为97%,药物用甲醇溶解，配成1 g.L-1的储备液，实验前用甲醇稀释成100 mg.L-1的混合工作溶液。内标正二十一烷C21购自Lancaster公司，配成100 mg.L-1工作溶液。血浆购自307医院血站，其它各种试剂均为分析纯。
, 百拇医药
0.1 mol.L-1乙酸溶液：去离子水100 mL中加入冰乙酸0.6 mL。
酸性洗脱剂：乙酸乙酯100 mL中加入冰乙酸100 μL。
碱性洗脱剂：乙酸乙酯98 mL中加入浓氨水2 mL。
2 样品提取
2.1 样品准备 取血浆0.5 mL，加入一定量待测药物，用0.1 mol.L-1乙酸溶液2.0 mL 稀释，涡旋混匀30 s， 待用。
2.2 样品的提取净化 样品的提取净化共有7个步骤：①把固相萃取柱编号，装在真空萃取装置上；②柱子用甲醇0.5 mL和0.1 mol.L-1乙酸溶液1.0 mL 预处理；③ 将准备好的样品以约0.5 mL.min-1的流速过柱；④用0.1 mol.L-1乙酸液1.0 mL 冲洗柱子，然后把真空调至50 kPa 干燥5 min。再用正己烷0.5 mL 冲洗后，真空干燥5 min；⑤用酸性洗脱剂0.5 mL洗脱2次，流速为1.5 mL.min-1 左右，收集酸性洗脱液于A试管；⑥用碱性洗脱剂1.0 mL洗脱2次，流速为0.5 mL.min-1左右，收集碱性洗脱液于B试管；⑦酸、碱洗脱液中分别加入定量内标正二十一烷，N2吹至100 μL，取1 μL进样分析。
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3 色谱分析
GC-FID 炉温设为：起始温度100 ℃，升温速率10 ℃.min-1，终止温度为270 ℃，保持5 min。载气为高纯氮，流速为4 mL.min-1，分流比为5∶1，进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃。
GC-MS 炉温设为：起始温度80 ℃，升温速率15 ℃.min-1，终止温度为270 ℃，保持5 min。高纯氦作载气，柱前压为80 kPa，进样口温度为250 ℃。MS部分采用EI源，电子轰击能量为70 eV，传输线温度为250 ℃，光电倍增器电压500 V。
4 结果和讨论
4.1 血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂回收率的测定
, 百拇医药
经过优化实验，在所选GC-FID色谱条件下对加入到血浆中的5种氨基甲酸酯类杀虫剂进行了回收率测定，并考察了血浆空白中内源性杂质对分析的干扰情况，结果见图1。
图1 空白血浆(Ⅰ)外加5种氨基甲酸酯类
杀虫剂(Ⅱ)经SPE后的GC-FID谱图
1.速灭威 2.叶蝉散 3.残杀威
4.呋喃丹 5.西维因 6.内标
血浆中药物的提取过程如上面2.2所述。另取含5 μg标准药物的混合工作溶液于1 mL具塞小试管中，加入4 μg内标正二十一烷，N2吹干后，加入100 μL乙酸乙酯定容。进样1～2 μL ，GC-FID分析。计算药物与内标的峰面积比，以单点法计算药物在血浆中的回收率。为了比较氨基甲酸酯类杀虫剂存在于酸性洗脱液和碱性洗脱液中的比例，对A、B试管中药物回收率进行分别测定。结果表明，氨基甲酸酯类杀虫剂绝大部分存在于酸性洗脱液中，表1列出的回收率即为对A试管(酸性洗脱液)的测定结果。药物的绝对回收率在60%～96%之间，RSD<9%。
, 百拇医药
表1 血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂
(10 μg.mL-1血浆)的回收率(n=5) 药 物
绝对回收率/%
RSD/%
速灭威
61.3
8.65
叶蝉散
95.0
3.61
残杀威
70.8
, 百拇医药
7.63
呋喃丹
86.1
5.55
西维因
95.6
2.83
表2列出了洗脱液的收集方式对药物回收率的影响。实验表明，对于氨基甲酸酯类杀虫剂来说，仅仅收集酸性洗脱液就可以获得较好的回收率。通过分析，作者认为有以下2个原因：一是缩短了N2吹干时间，减少了蒸发过程中的损失。由于酸性洗脱液只有1 mL，而合并酸、碱混合洗脱液有3 mL；二是避免了在碱性条件下，氨基甲酸酯类杀虫剂不稳定所带来的损失。这提示我们，在用前文[1]建立的一步法固相提取结合GC-MS系统分析各类药物毒物时，在初步分析的基础上，有必要根据药物的特点，采用不同的洗脱液收集方式，以提高方法的灵敏度和准确性。表2 洗脱液收集方式*对回收率的影响 药 物
, http://www.100md.com
回 收 率/%
方式1
方式2
叶蝉散
95.0
55.1
残杀威
70.8
65.3
* 方式1：仅收集酸性洗脱液；方式2：合并酸性洗脱液和碱性洗脱液
4.2 氨基甲酸酯类杀虫剂的定性分析
本方法采用GC-MS作定性分析工具，在所选GC-MS分析条件下，5种氨基甲酸酯类和内标正二十一烷在此条件下的GC-MS色谱图见图2。由于氨基甲酸酯类对热不稳定，在加热状态下，化合物中的酯键易断裂，形成酚类热解产物。在GC-MS分析过程中，也有少量热解产物形成，但由于GC-MS专一性强，少量热解产物的形成并不影响定性分析。据有关文献报道[2]，在用GC-MS分析氨基甲酸酯类时，通过选用较短的10 m长的毛细管色谱柱，并同时采取进样口程序升温(60 ℃→200 ℃)，可以有效地防止氨基甲酸酯类的热分解。由于本方法是几类上百种毒物药物系统分析方法的一部分，为兼顾各种不同性质的毒物药物以达到较高的分析灵敏度和分辨率，本方法依然采用较高的进样口温度(250 ℃)，色谱柱长25 m。
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图2 5种氨基甲酸酯类杀虫剂和
内标在所选条件下GC-MS谱图
(图中化合物编号同表3)
化合物的质谱图是质谱法结构定性的基础，但在分析过程中发现，一些化合物具有相同的特征离子，质谱图类似，在这种情况下，只根据特征离子和谱库检索来定性有一定困难。保留性质的差异是色谱法定性的基础，对于GC-MS来说，它同样也是一个很重要的定性指标。为了充分发挥GC-MS的功能，本工作把色谱的保留时间与质谱图(图2)相结合，实行多指标定性。表3列出了5种氨基甲酸酯类杀虫剂的保留时间、特征离子以及最低检测限。
表3 5种氨基甲酸酯类杀虫剂和内标C21的tR、RRT、特征离子以及最低检测限 峰号
药物名称
, 百拇医药
tR/min
RRT
特征离子
最低检测限
/μg.mL-1
1
速灭威热解产物
2.38
0.231
108,107,77,79,90
2
残杀威热解产物
, 百拇医药
3.12
0.302
110,152,81
3
叶蝉散热解产物
3.37
0.327
121,136,91
4
呋喃丹热解产物
4.23
0.410
164,149,131,122
, 百拇医药
5
速灭威
5.65
0.548
108,107,77,165*
0.2
6
西维因热解产物
6.15
0.596
144,115,116
7
, 百拇医药 叶蝉散
6.33
0.613
121,136,91,193*
0.2
8
残杀威
6.93
0.672
110,152,81,209*
0.2
9
, http://www.100md.com
呋喃丹
7.92
0.767
164,149,131, 221*
1.0
10
西维因
9.13
0.885
144,115,116,215*
1.0
11
, http://www.100md.com
C21(内标)
10.32
1.000
* 代表分子离子5 小结
本文建立了血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂的SPE结合GC-MS系统分析方法，所建分析方法系统性强，快速、简便，是对本文作者以前所建系统分析方法的一个补充。本方法不足之处在于为兼顾各种不同性质药物的分析，在所选系统分析条件下氨基甲酸酯类存在热分解现象。
参考文献
1，李莉，周永新，胡绪英等. 固相萃取法在血浆药物筛选分析中的应用. 军事医学科学院院刊，1998, 22(2)：133
2，Wigfield Y Y , Grant R, Snider N. Gas chromatographic and mass spectrometric investigation of seven carbamate insecticides and one metabolite. J Chromatogr，1993, 657(1): 219
(本文于1999年8月26日收到), 百拇医药
单位：李莉 周永新(军事医学科学院毒物药物研究所 北京 100850)
关键词：固相萃取法；SPEC混合相萃取柱；GC-FID；GC-MS
药物分析杂志000304 摘要 目的：建立血浆中氨基甲酸酯类杀虫剂SPE结合GC-FID和GC-MS的系统分析方法。方法：用SPEC Multi-Modal混合相固相萃取柱建立血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂的固相萃取方法；采用GC-MS作为定性分析工具，将保留时间 、特征离子和谱库检索相结合实行多指标定性。结果：5种杀虫剂的绝对回收率在60%～96%之间，相对标准偏差小于9%(n=5)。结论：方法系统性好、快速、准确。
Detection of Carbamate Pesticide in Plasma by
, 百拇医药
SPE Combined with GC-FID and GC-MS
Li Li，Zhou Yongxin
(Institute of Pharmacology and Toxicology , 27 Tai-Ping Road , Beijing 100850)
Abstract Objective：To establish a method for detection of 5 carbamate pesticide in plasma by SPE combined with GC-MS.Methods:A new SPEC plus Multi-Modal column was used to extract the 5 carbamate pesticides from plasma. The detection was programmed by combining retention time, diagnostic ions and library search.Results:The absolute recoveries of 5 pesticides were between 60%～96%, with relative standard deviation less than 9%. The detection limits of GC-MS/SIM were 200 ng.mL-1 plasma for tsumacide, isoprocarb and arprocarb , 1 μg.mL-1 plasma for carbaryl and carbofuran.Conclusion:The method is systematic, rapid and accurate.
, 百拇医药
Key words SPE, SPEC Multi-Modal disc, GC-FID, GC-MS
氨基甲酸酯类杀虫剂(carbamate pesticides)是继有机氯和有机磷之后发展的第三代杀虫剂，该类杀虫剂无蓄积作用，杀虫效力强，易分解无残毒，故广泛用于毒杀农业害虫。近年来，自杀、他杀以及使用不慎引起中毒的现象时有发生，因此，有必要建立生物体液中氨基甲酸酯类杀虫剂的分析检测方法，为法庭医学及临床诊断提供依据。
SPEC Multi-Modal多相复合柱是一种新型的紧压式三相混合萃取片，本文作者曾用此种复合柱建立了血浆中5类药物包括巴比妥类、苯二氮NFDA3类、三环吩噻嗪类、局麻药类以及麻醉镇痛药类的系统提取方法[1]。结果表明，这种多相复合萃取片通用性较好，对具有不同理化性质的药物毒物均有较好的回收率。为了扩大系统分析方法的范围，本文继续采用SPEC多相复合柱对血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂进行系统提取，采用GC-MS定性。
, 百拇医药
1 仪器和试剂
PE AutoSystem XL气相色谱仪，配FID检测器和毛细管色谱柱PE-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)；VG TRIO-1000型气相色谱质谱联用仪，配有HP-5毛细管色谱柱(25 m×0.32 mm×0.52 μm)；真空固相萃取装置(Waters 公司)。
固相萃取柱 (SPEC.Plus.10ML.C18AR/MP3 Multi.Modal, 美国 ANSYS Inc.) 由香港大诚太平洋有限公司提供。
氨基甲酸酯类对照品：速灭威(tsumacide)、叶蝉散(isoprocarb)、残杀威(arprocarb)、呋喃丹(carbofuran)、西维因(carbaryl)均购自农业部农药鉴定所，纯度均为97%,药物用甲醇溶解，配成1 g.L-1的储备液，实验前用甲醇稀释成100 mg.L-1的混合工作溶液。内标正二十一烷C21购自Lancaster公司，配成100 mg.L-1工作溶液。血浆购自307医院血站，其它各种试剂均为分析纯。
, 百拇医药
0.1 mol.L-1乙酸溶液：去离子水100 mL中加入冰乙酸0.6 mL。
酸性洗脱剂：乙酸乙酯100 mL中加入冰乙酸100 μL。
碱性洗脱剂：乙酸乙酯98 mL中加入浓氨水2 mL。
2 样品提取
2.1 样品准备 取血浆0.5 mL，加入一定量待测药物，用0.1 mol.L-1乙酸溶液2.0 mL 稀释，涡旋混匀30 s， 待用。
2.2 样品的提取净化 样品的提取净化共有7个步骤：①把固相萃取柱编号，装在真空萃取装置上；②柱子用甲醇0.5 mL和0.1 mol.L-1乙酸溶液1.0 mL 预处理；③ 将准备好的样品以约0.5 mL.min-1的流速过柱；④用0.1 mol.L-1乙酸液1.0 mL 冲洗柱子，然后把真空调至50 kPa 干燥5 min。再用正己烷0.5 mL 冲洗后，真空干燥5 min；⑤用酸性洗脱剂0.5 mL洗脱2次，流速为1.5 mL.min-1 左右，收集酸性洗脱液于A试管；⑥用碱性洗脱剂1.0 mL洗脱2次，流速为0.5 mL.min-1左右，收集碱性洗脱液于B试管；⑦酸、碱洗脱液中分别加入定量内标正二十一烷，N2吹至100 μL，取1 μL进样分析。
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3 色谱分析
GC-FID 炉温设为：起始温度100 ℃，升温速率10 ℃.min-1，终止温度为270 ℃，保持5 min。载气为高纯氮，流速为4 mL.min-1，分流比为5∶1，进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃。
GC-MS 炉温设为：起始温度80 ℃，升温速率15 ℃.min-1，终止温度为270 ℃，保持5 min。高纯氦作载气，柱前压为80 kPa，进样口温度为250 ℃。MS部分采用EI源，电子轰击能量为70 eV，传输线温度为250 ℃，光电倍增器电压500 V。
4 结果和讨论
4.1 血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂回收率的测定
, 百拇医药
经过优化实验，在所选GC-FID色谱条件下对加入到血浆中的5种氨基甲酸酯类杀虫剂进行了回收率测定，并考察了血浆空白中内源性杂质对分析的干扰情况，结果见图1。
图1 空白血浆(Ⅰ)外加5种氨基甲酸酯类
杀虫剂(Ⅱ)经SPE后的GC-FID谱图
1.速灭威 2.叶蝉散 3.残杀威
4.呋喃丹 5.西维因 6.内标
血浆中药物的提取过程如上面2.2所述。另取含5 μg标准药物的混合工作溶液于1 mL具塞小试管中，加入4 μg内标正二十一烷，N2吹干后，加入100 μL乙酸乙酯定容。进样1～2 μL ，GC-FID分析。计算药物与内标的峰面积比，以单点法计算药物在血浆中的回收率。为了比较氨基甲酸酯类杀虫剂存在于酸性洗脱液和碱性洗脱液中的比例，对A、B试管中药物回收率进行分别测定。结果表明，氨基甲酸酯类杀虫剂绝大部分存在于酸性洗脱液中，表1列出的回收率即为对A试管(酸性洗脱液)的测定结果。药物的绝对回收率在60%～96%之间，RSD<9%。
, 百拇医药
表1 血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂
(10 μg.mL-1血浆)的回收率(n=5) 药 物
绝对回收率/%
RSD/%
速灭威
61.3
8.65
叶蝉散
95.0
3.61
残杀威
70.8
, 百拇医药
7.63
呋喃丹
86.1
5.55
西维因
95.6
2.83
表2列出了洗脱液的收集方式对药物回收率的影响。实验表明，对于氨基甲酸酯类杀虫剂来说，仅仅收集酸性洗脱液就可以获得较好的回收率。通过分析，作者认为有以下2个原因：一是缩短了N2吹干时间，减少了蒸发过程中的损失。由于酸性洗脱液只有1 mL，而合并酸、碱混合洗脱液有3 mL；二是避免了在碱性条件下，氨基甲酸酯类杀虫剂不稳定所带来的损失。这提示我们，在用前文[1]建立的一步法固相提取结合GC-MS系统分析各类药物毒物时，在初步分析的基础上，有必要根据药物的特点，采用不同的洗脱液收集方式，以提高方法的灵敏度和准确性。表2 洗脱液收集方式*对回收率的影响 药 物
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回 收 率/%
方式1
方式2
叶蝉散
95.0
55.1
残杀威
70.8
65.3
* 方式1：仅收集酸性洗脱液；方式2：合并酸性洗脱液和碱性洗脱液
4.2 氨基甲酸酯类杀虫剂的定性分析
本方法采用GC-MS作定性分析工具，在所选GC-MS分析条件下，5种氨基甲酸酯类和内标正二十一烷在此条件下的GC-MS色谱图见图2。由于氨基甲酸酯类对热不稳定，在加热状态下，化合物中的酯键易断裂，形成酚类热解产物。在GC-MS分析过程中，也有少量热解产物形成，但由于GC-MS专一性强，少量热解产物的形成并不影响定性分析。据有关文献报道[2]，在用GC-MS分析氨基甲酸酯类时，通过选用较短的10 m长的毛细管色谱柱，并同时采取进样口程序升温(60 ℃→200 ℃)，可以有效地防止氨基甲酸酯类的热分解。由于本方法是几类上百种毒物药物系统分析方法的一部分，为兼顾各种不同性质的毒物药物以达到较高的分析灵敏度和分辨率，本方法依然采用较高的进样口温度(250 ℃)，色谱柱长25 m。
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图2 5种氨基甲酸酯类杀虫剂和
内标在所选条件下GC-MS谱图
(图中化合物编号同表3)
化合物的质谱图是质谱法结构定性的基础，但在分析过程中发现，一些化合物具有相同的特征离子，质谱图类似，在这种情况下，只根据特征离子和谱库检索来定性有一定困难。保留性质的差异是色谱法定性的基础，对于GC-MS来说，它同样也是一个很重要的定性指标。为了充分发挥GC-MS的功能，本工作把色谱的保留时间与质谱图(图2)相结合，实行多指标定性。表3列出了5种氨基甲酸酯类杀虫剂的保留时间、特征离子以及最低检测限。
表3 5种氨基甲酸酯类杀虫剂和内标C21的tR、RRT、特征离子以及最低检测限 峰号
药物名称
, 百拇医药
tR/min
RRT
特征离子
最低检测限
/μg.mL-1
1
速灭威热解产物
2.38
0.231
108,107,77,79,90
2
残杀威热解产物
, 百拇医药
3.12
0.302
110,152,81
3
叶蝉散热解产物
3.37
0.327
121,136,91
4
呋喃丹热解产物
4.23
0.410
164,149,131,122
, 百拇医药
5
速灭威
5.65
0.548
108,107,77,165*
0.2
6
西维因热解产物
6.15
0.596
144,115,116
7
, 百拇医药 叶蝉散
6.33
0.613
121,136,91,193*
0.2
8
残杀威
6.93
0.672
110,152,81,209*
0.2
9
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呋喃丹
7.92
0.767
164,149,131, 221*
1.0
10
西维因
9.13
0.885
144,115,116,215*
1.0
11
, http://www.100md.com
C21(内标)
10.32
1.000
* 代表分子离子5 小结
本文建立了血浆中5种氨基甲酸酯类杀虫剂的SPE结合GC-MS系统分析方法，所建分析方法系统性强，快速、简便，是对本文作者以前所建系统分析方法的一个补充。本方法不足之处在于为兼顾各种不同性质药物的分析，在所选系统分析条件下氨基甲酸酯类存在热分解现象。
参考文献
1，李莉，周永新，胡绪英等. 固相萃取法在血浆药物筛选分析中的应用. 军事医学科学院院刊，1998, 22(2)：133
2，Wigfield Y Y , Grant R, Snider N. Gas chromatographic and mass spectrometric investigation of seven carbamate insecticides and one metabolite. J Chromatogr，1993, 657(1): 219
(本文于1999年8月26日收到), 百拇医药