LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用
作者：刘国荣 李殿俊 巴德年 孟晓波
单位：150040 哈尔滨医科大学肿瘤研究所[刘国荣(现任北京医科大学免疫中心，100083)、李殿俊、孟晓波]；中国医学科学院(巴德年)
关键词：杀伤细胞，淋巴因子激活；有丝分裂；肿瘤细胞，培养的
中华医学杂志930911 摘要 为了提高淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)临床应用的疗效，采用抗肿瘤化疗药物长春新碱诱导人肺腺癌细胞 Anip973进入有丝分裂期，研究了LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明，肿瘤细胞进入有丝分裂期后，形态学上发生了明显的变化，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用明显增高。电镜下，LAK细胞与有丝分裂期的肿瘤细胞以绒毛相接触，呈犬牙交错状，靶细胞的死亡形式是溶解坏死和凋落。
目前虽然临床上联合应用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)和白细胞介素Ⅱ治疗各种肿瘤病人已取得了较好的疗效，但仍有60%左右的肿瘤病人对该疗法不敏感〔1〕。为此，人们进行了大量的研究工作和探讨，从细胞水平和分子水平提高LAK细胞的抗肿瘤活性。根据肿瘤细胞的生物学特性，肿瘤细胞动力学，细胞周期及抗肿瘤联合化疗方案的启发〔2〕，我们研究了LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用，以期对提高临床LAK疗效有所帮助。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料：肿瘤细胞：人肺腺癌细胞Anip973，本实验室常规传代培养。主要试剂：长春新碱(VCR)，广州明兴制药厂产品；重组人白细胞介素Ⅱ(rhIL-2)，中国科学院上海生化所惠赠。
2.方法：LAK细胞的制备：取健康人()志愿者)静脉血按常规方法制备〔3〕。有丝分裂期肿瘤细胞的制备：在指数生长期的 Anip973 细胞中分别加入不同浓度的 VCR，作用一定时间后，轻轻吸出含有VCR的培养液，加入新的培养液，手持培养瓶横向摇动，令培养液冲刷掉变圆的有丝分裂期细胞离心收集此细胞。对照组正常的肿瘤细胞呈贴壁生长，用胰酶消化收集。将收集的细胞制备染色体标本，计数有丝分裂期细胞所占的百分数即分裂指数〔4〕。LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞杀伤活性的测定：采用4小时51Cr释放试验。电镜标本的制备：取LAK细胞和有丝分裂期肿瘤细胞按10∶1加入96孔平底培养板中，共同培养2小时和4小时后制备电镜标本〔5〕。
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结 果
1.VCR 诱导有丝分裂期肿瘤细胞的动力学：首先观察了VCR诱导人肺腺癌细胞Anip973进入有丝分裂期的最适浓度和时间。从表1可见，当VCR终浓度为0.7μg/ml，作用时间为20小时，肿瘤细胞的分裂指数最高为35.7%，而对照组细胞为2%～4%。
表1 VCR诱导Anip973细胞的分裂指数(%) VCR浓度(μg/ml)
分裂指数(%)
4h
8h
12h
20h
24h
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0.5
4.9
8.7
29.3
31.0
28.6
0.7
9.4
19.8
31.1
35.7
30.2
1.0
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11.3
20.0
22.1
26.0
21.7
1.5
16.6
15.2
12.2
11.5
9.5
2.有丝分裂期肿瘤细胞的形态学变化：培养的 Anip973细胞贴壁生长，在倒置显微镜下可以见到细胞呈不规则的极性状，用VCR同步化后，肿瘤细胞进入有丝分裂期，胞体明显变大变圆，细胞间桥断裂，反光性增强。轻轻摇动培养瓶，有丝分裂期的肿瘤细胞就可以从瓶壁上脱落下来。在透射电镜下可以观察到有丝分裂期的 Anip973细胞，核膜、核仁均消失，细胞核中的染色质浓集成有精细结构的染色体(图1)，而对照组的肿瘤细胞，细胞核完整，核仁清晰可见，染色质呈弥散状态(图2)。
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图1 有丝分裂期肿瘤细胞。核膜、核仁均消失，染色质深集成有精细结构的染色体 TEM×600
图2 对照组肿瘤细胞。细胞核完整，核仁清晰可见，染色质呈弥散状 TEM×500
3.LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用：多次4小时51Cr释放试验结果表明，从效靶比例40∶1到10∶1，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤活性都明显增高(P<0.01,x2检验)，见表2。
表2 LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用 靶细胞
分裂指数(%)
不同效靶比例的细胞毒活性(%)
40∶1
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20∶1
10∶1
对照组(Anip973)
3.6
28.1
15.3
9.9
实验组(Anip973+VCR)
41.0
75.5
65.9
48.4
4.LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞杀伤作用的超微结构观察：LAK细胞与有丝分裂期肿瘤细胞共同培养2小时，扫描电镜下可见LAK细胞与靶细胞以各自的表面绒毛相互接触(图3)。透射电镜下，LAK细胞出现明显的变形，伸出粗大的伪足，朝向靶细胞或匍伏在靶细胞上，甚至呈犬牙交错状(图4)，共同培养4小时可见LAK细胞与靶细胞紧密接触，靶细胞开始死亡。靶细胞的死亡形式有两种：一种是细胞核破碎，形成许多凋零小体的凋落(图5)，另一种是细胞核完整无损，细胞质中无可识别的细胞结构的溶解坏死(图6)。这与LAK细胞对其它靶细胞杀伤的形态学变化没有区别〔6〕。
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图3 LAK细胞与靶细胞以各自的表面绒毛相互接触 SEM×3500
图4 LAK细胞以微绒毛与肿瘤细胞接触呈犬牙交错 TEM×1200
图5 靶细胞死亡，细胞核破碎凋落 TEM×400
图6 靶细胞死亡，细胞核完整，细胞质中细胞结构溶解坏死 TEM×600
讨 论
尽管诱导LAK细胞的详细机制还不清楚，但只要细胞在遗传学上具备成熟的杀伤性，即与肿瘤细胞接触能产生识别分子和肿瘤破坏分子的性质，在IL-2刺激下即可诱导出LAK细胞。LAK细胞通过IL-2和IL-2受体的相互作用在细胞内合成丝氨酸脂酯和穿孔素并蓄积，通过磷酸肌酸激酶依赖性信息传递途径与肿瘤细胞结合产生细胞毒性〔7〕。LAK细胞杀伤靶细胞的过程分三步，即结合、致死一击、靶细胞破坏，所以效靶结合是杀伤的第一步。LAK细胞要杀伤不同的肿瘤细胞就要和肿瘤细胞某些相同或相似的分子结合〔8〕。我们的电镜结果了证实了这一点。LAK细胞的杀伤机制需要有多种细胞毒介质的参与，其中任何一种的独立作用都不能解释LAK杀伤作用的所有特点。我们的实验体系中应用VCR诱导靶细胞进入有丝分裂期。VCR主要是抑制微管蛋白的聚合，从而使有丝分裂中牵引染色体运动的纺缍体不能形成，细胞停止在有丝分裂期，这种作用是可逆的，去除VCR的作用后，肿瘤细胞的生长可以恢复正常〔9〕。这就排除了VCR对肿瘤细胞具有杀伤作用，说明有丝分裂期肿瘤细胞的形态学变化是LAK细胞对其杀伤活性增高的主要原因，具体详细的机制有待于进一步探讨。本组资料表明，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤活性增高，这样就为以后的临床应用提供了实验依据，从而有可能为肿瘤的综合治疗提供一个新的方法。
, 百拇医药
参考文献
1 曹雪涛，叶天星(综述).LAK细胞抗肿瘤活性调节因素的研究进展.国外医学.免疫学分册，1990,4,176.
2 汪振源编.恶性肿瘤的化学治疗.哈尔滨：黑龙江省肿瘤医院，1980,9-10.
3 徐震逸，巴德年，张月桂，等.正常人LAK活性的诱导和LAK前体频率的测定.哈尔滨医科大学学报，1988,22∶74.
4 刘权章编.人类染色体方法学.第4版.哈尔滨医科大学，1989,63-90.
5 史家岚，王吾如，巴德年，等.体外LAK细胞杀伤人肺腺癌细胞的电镜观察.中华医学杂志，1990,70∶319.
6 Zychlinsky A,Li MZ,Liu CC,et al. Cytolytic lymphocytes induce both apoptosis and necrosis in target cells J Immunol,1991,146,393.
7 西村考司.LAK细胞的细胞毒机制.组织培养，1990,16∶70.
8 常金丽，臧人杰.人LAK细胞体外抗肿瘤作用机理探讨.中国免疫学杂志，1991,7∶106.
9 王肇炎，韩 锐编.肿瘤药物治疗.北京：人民卫生出版社，1987.42.
(收稿：1992-11-10 修回：1993-06-23), 百拇医药
单位：150040 哈尔滨医科大学肿瘤研究所[刘国荣(现任北京医科大学免疫中心，100083)、李殿俊、孟晓波]；中国医学科学院(巴德年)
关键词：杀伤细胞，淋巴因子激活；有丝分裂；肿瘤细胞，培养的
中华医学杂志930911 摘要 为了提高淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)临床应用的疗效，采用抗肿瘤化疗药物长春新碱诱导人肺腺癌细胞 Anip973进入有丝分裂期，研究了LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用。结果表明，肿瘤细胞进入有丝分裂期后，形态学上发生了明显的变化，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用明显增高。电镜下，LAK细胞与有丝分裂期的肿瘤细胞以绒毛相接触，呈犬牙交错状，靶细胞的死亡形式是溶解坏死和凋落。
目前虽然临床上联合应用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)和白细胞介素Ⅱ治疗各种肿瘤病人已取得了较好的疗效，但仍有60%左右的肿瘤病人对该疗法不敏感〔1〕。为此，人们进行了大量的研究工作和探讨，从细胞水平和分子水平提高LAK细胞的抗肿瘤活性。根据肿瘤细胞的生物学特性，肿瘤细胞动力学，细胞周期及抗肿瘤联合化疗方案的启发〔2〕，我们研究了LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用，以期对提高临床LAK疗效有所帮助。
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材料和方法
1.材料：肿瘤细胞：人肺腺癌细胞Anip973，本实验室常规传代培养。主要试剂：长春新碱(VCR)，广州明兴制药厂产品；重组人白细胞介素Ⅱ(rhIL-2)，中国科学院上海生化所惠赠。
2.方法：LAK细胞的制备：取健康人()志愿者)静脉血按常规方法制备〔3〕。有丝分裂期肿瘤细胞的制备：在指数生长期的 Anip973 细胞中分别加入不同浓度的 VCR，作用一定时间后，轻轻吸出含有VCR的培养液，加入新的培养液，手持培养瓶横向摇动，令培养液冲刷掉变圆的有丝分裂期细胞离心收集此细胞。对照组正常的肿瘤细胞呈贴壁生长，用胰酶消化收集。将收集的细胞制备染色体标本，计数有丝分裂期细胞所占的百分数即分裂指数〔4〕。LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞杀伤活性的测定：采用4小时51Cr释放试验。电镜标本的制备：取LAK细胞和有丝分裂期肿瘤细胞按10∶1加入96孔平底培养板中，共同培养2小时和4小时后制备电镜标本〔5〕。
, http://www.100md.com
结 果
1.VCR 诱导有丝分裂期肿瘤细胞的动力学：首先观察了VCR诱导人肺腺癌细胞Anip973进入有丝分裂期的最适浓度和时间。从表1可见，当VCR终浓度为0.7μg/ml，作用时间为20小时，肿瘤细胞的分裂指数最高为35.7%，而对照组细胞为2%～4%。
表1 VCR诱导Anip973细胞的分裂指数(%) VCR浓度(μg/ml)
分裂指数(%)
4h
8h
12h
20h
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0.5
4.9
8.7
29.3
31.0
28.6
0.7
9.4
19.8
31.1
35.7
30.2
1.0
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11.3
20.0
22.1
26.0
21.7
1.5
16.6
15.2
12.2
11.5
9.5
2.有丝分裂期肿瘤细胞的形态学变化：培养的 Anip973细胞贴壁生长，在倒置显微镜下可以见到细胞呈不规则的极性状，用VCR同步化后，肿瘤细胞进入有丝分裂期，胞体明显变大变圆，细胞间桥断裂，反光性增强。轻轻摇动培养瓶，有丝分裂期的肿瘤细胞就可以从瓶壁上脱落下来。在透射电镜下可以观察到有丝分裂期的 Anip973细胞，核膜、核仁均消失，细胞核中的染色质浓集成有精细结构的染色体(图1)，而对照组的肿瘤细胞，细胞核完整，核仁清晰可见，染色质呈弥散状态(图2)。
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图1 有丝分裂期肿瘤细胞。核膜、核仁均消失，染色质深集成有精细结构的染色体 TEM×600
图2 对照组肿瘤细胞。细胞核完整，核仁清晰可见，染色质呈弥散状 TEM×500
3.LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用：多次4小时51Cr释放试验结果表明，从效靶比例40∶1到10∶1，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤活性都明显增高(P<0.01,x2检验)，见表2。
表2 LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤作用 靶细胞
分裂指数(%)
不同效靶比例的细胞毒活性(%)
40∶1
, http://www.100md.com
20∶1
10∶1
对照组(Anip973)
3.6
28.1
15.3
9.9
实验组(Anip973+VCR)
41.0
75.5
65.9
48.4
4.LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞杀伤作用的超微结构观察：LAK细胞与有丝分裂期肿瘤细胞共同培养2小时，扫描电镜下可见LAK细胞与靶细胞以各自的表面绒毛相互接触(图3)。透射电镜下，LAK细胞出现明显的变形，伸出粗大的伪足，朝向靶细胞或匍伏在靶细胞上，甚至呈犬牙交错状(图4)，共同培养4小时可见LAK细胞与靶细胞紧密接触，靶细胞开始死亡。靶细胞的死亡形式有两种：一种是细胞核破碎，形成许多凋零小体的凋落(图5)，另一种是细胞核完整无损，细胞质中无可识别的细胞结构的溶解坏死(图6)。这与LAK细胞对其它靶细胞杀伤的形态学变化没有区别〔6〕。
, 百拇医药
图3 LAK细胞与靶细胞以各自的表面绒毛相互接触 SEM×3500
图4 LAK细胞以微绒毛与肿瘤细胞接触呈犬牙交错 TEM×1200
图5 靶细胞死亡，细胞核破碎凋落 TEM×400
图6 靶细胞死亡，细胞核完整，细胞质中细胞结构溶解坏死 TEM×600
讨 论
尽管诱导LAK细胞的详细机制还不清楚，但只要细胞在遗传学上具备成熟的杀伤性，即与肿瘤细胞接触能产生识别分子和肿瘤破坏分子的性质，在IL-2刺激下即可诱导出LAK细胞。LAK细胞通过IL-2和IL-2受体的相互作用在细胞内合成丝氨酸脂酯和穿孔素并蓄积，通过磷酸肌酸激酶依赖性信息传递途径与肿瘤细胞结合产生细胞毒性〔7〕。LAK细胞杀伤靶细胞的过程分三步，即结合、致死一击、靶细胞破坏，所以效靶结合是杀伤的第一步。LAK细胞要杀伤不同的肿瘤细胞就要和肿瘤细胞某些相同或相似的分子结合〔8〕。我们的电镜结果了证实了这一点。LAK细胞的杀伤机制需要有多种细胞毒介质的参与，其中任何一种的独立作用都不能解释LAK杀伤作用的所有特点。我们的实验体系中应用VCR诱导靶细胞进入有丝分裂期。VCR主要是抑制微管蛋白的聚合，从而使有丝分裂中牵引染色体运动的纺缍体不能形成，细胞停止在有丝分裂期，这种作用是可逆的，去除VCR的作用后，肿瘤细胞的生长可以恢复正常〔9〕。这就排除了VCR对肿瘤细胞具有杀伤作用，说明有丝分裂期肿瘤细胞的形态学变化是LAK细胞对其杀伤活性增高的主要原因，具体详细的机制有待于进一步探讨。本组资料表明，LAK细胞对有丝分裂期肿瘤细胞的杀伤活性增高，这样就为以后的临床应用提供了实验依据，从而有可能为肿瘤的综合治疗提供一个新的方法。
, 百拇医药
参考文献
1 曹雪涛，叶天星(综述).LAK细胞抗肿瘤活性调节因素的研究进展.国外医学.免疫学分册，1990,4,176.
2 汪振源编.恶性肿瘤的化学治疗.哈尔滨：黑龙江省肿瘤医院，1980,9-10.
3 徐震逸，巴德年，张月桂，等.正常人LAK活性的诱导和LAK前体频率的测定.哈尔滨医科大学学报，1988,22∶74.
4 刘权章编.人类染色体方法学.第4版.哈尔滨医科大学，1989,63-90.
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7 西村考司.LAK细胞的细胞毒机制.组织培养，1990,16∶70.
8 常金丽，臧人杰.人LAK细胞体外抗肿瘤作用机理探讨.中国免疫学杂志，1991,7∶106.
9 王肇炎，韩 锐编.肿瘤药物治疗.北京：人民卫生出版社，1987.42.
(收稿：1992-11-10 修回：1993-06-23), 百拇医药