三结构域重组纤连蛋白多肽在大肠杆菌中表达及其产物的纯化与鉴定*
作者：李明才 冯作化 李东 张桂梅
单位：同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉 430030
关键词：纤连蛋白；重组多肽；表达；蛋白纯化；肿瘤转移
同济医科大学学报990505 摘要 在大肠杆菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽——人纤连蛋白(FN)的Cell I-Hep Ⅱ-Cell Ⅱ三结构域重组多肽(CH82)，表达效率达21%。在低温(22 ℃)培养表达时，CH82大部分为可溶性产物，经DEAE-52层析及 Heparin-agarose亲和层析可得到纯品；在高温(37 ℃)培养表达时，CH82主要以包涵体形式出现，经尿素变性与复性处理后，可通过Heparin-agarose亲和层析得到纯品。 所得纯品均具有结合肝素和结合细胞的功能，且结合细胞的能力比双结构域FN更强，表明两个结合细胞的功能结构域均有活性。
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中图法分类号 Q51， Q7， R73-37
The Purification and Expression of Triple-domain Recombinant
Fibronectin Polypeptide in E.coli
Li Mingcai, Feng Zuohua, Li Dong et al
Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental
Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Abstract An anti-metastatic polypeptide, triple-domain (Cell I-Hep II-Cell II) recombinant polypeptide of human fibronectin, was expressed in E.coli and purified (CH82). The expression level was to be about 21%. CH82 was soluble in 22 ℃. After sonication and centrifugation of engineering bacteria, the soluble supernatant was applied to DEAE-52 column. The purified product was obtained after the affinity chromatograph with Heparin-agarose. CH82 was inclusion bodies in 37 ℃, After denaturation and renaturation of the inclusion bodies with urea, the purified product was obtained after the affinity chromatograph with Heparin-agarose. The purified product was capable of binding heparin and cells, and has a better binding activity than bifunctional-domain FN polypeptides.
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Key words fibronectin; recombinant polypeptide; expression; purification; metastasis
纤连蛋白(fibronectin, FN)是一种含多个功能结构域的细胞外基质糖蛋白。 它的结合细胞(Cell I)和结合肝素(Hep Ⅱ)双功能结构域重组多肽具有抑制肿瘤转移的功能[1]，能在肿瘤细胞侵入其它组织的几个关键步骤中起抑制作用[2～4]， 有效地阻止肿瘤细胞转移到肺和肝脏[5，6]。 如果在Cell I-Hep Ⅱ双功能结构域重组多肽的C端再加上FN的Cell Ⅱ结构域(IIICS)中的CS1片段，则重组多肽的功能更强[2]，但该多肽在大肠杆菌中的表达效率却很低[1]。本文表达的Cell I-Hep Ⅱ-CS1三结构域重组多肽(删除了CS1序列N端Asp1961-Glu1978的18个氨基酸)在大肠杆菌中具有较高的表达效率，同时对它进行了分离纯化与功能鉴定。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存，质粒pF9482为本室构建(另文发表)，该质粒携带T7启动子控制下的cDNA片段，该片段编码人纤连蛋白的Cell I结构域(Pro 1239-Ser 1515)、Hep Ⅱ结构域(Ala 1690-Glu 1952)和Cell Ⅱ结构域(Ile 1979-Val 2049)，将质粒pF94-82转化大肠杆菌BL21(DE3)即为工程菌，所表达的多肽命名为CH82。
1.2 工程菌的诱导表达及产物性质分析
取单菌落接种于含Amp的M9ZB培养基中，于37 ℃振荡培养过夜，将培养物1∶40稀释于含Amp的LB培养基中置37 ℃振荡培养2～3 h至A600=0.3～0.5，加入1 mmol/L IPTG，37 ℃培养6 h[7]或22 ℃培养20 h[8]进行表达。收集表达菌，超声波破菌，离心，将上清和沉淀分别制成电泳样品并进行SDS-PAGE电泳分析，以确定表达产物的溶解性。
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1.3 重组多肽的纯化
1.3.1可溶性表达产物的纯化： 工程菌经22 ℃诱导表达后采用超声波破菌，上清通过DEAE-52层析进行分离，从离子交换柱收集的半纯品再经Heparinag-arose亲和层析进行纯化[7]。
1.3.2 不溶性表达产物的纯化： 取培养过夜的工程菌1∶40稀释于200 ml含Amp的LB培养基中，于37 ℃振荡培养至A600=0.3～0.5，加入IPTG至1 mmol/L，诱导表达6 h后离心收集细菌，悬浮于30 ml 20 mmol/L Tris-Cl，2 mmol/L EDTA，pH8.0溶液，加入溶菌酶(1～2 mg/g湿菌)，消化2 h。冰浴超声破菌，离心弃上清，沉淀分别用20 mmol/L Tris-Cl，2 mmol/L EDTA的10 g/L Triton X-100、2 mol/L尿素和 4 mol/L尿素溶液各洗涤2次，再用PBS溶液洗沉淀3次。将上述沉淀溶于8 mol/L尿素的10 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-Cl， pH8.0。离心去不溶物，得到包涵体粗提物。将其按1∶80的比例稀释于20 mmol/L磷酸缓冲液(PB)，pH7.2，100 mmol/L NaCl中并对此溶液4 ℃透析24～48 h使目的蛋白复性。离心去沉淀，将上清中表达产物经过Heparin-agarose亲和层析柱进行纯化。
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1.3.3 检测： 纯化后的样品采用改良的Lowry法测蛋白质含量，SDS-PAGE电泳后蛋白质带扫描分析采用岛津薄层扫描仪。
1.4 细胞
黑色素瘤细胞B16/F1， 购自美国ATCC公司。
1.5 细胞粘附试验
按文献[7]方法，用含氯化钠的磷酸缓冲液(PBS)将重组FN多肽稀释成不同浓度用于包被96孔培养板，50 μl/孔，对照组加PBS。每一个浓度3个复孔，置4 ℃过夜。用PBS洗板3次，加入30 g/L BSA(100 μl/孔)。置37 ℃温育1 h，再用PBS洗板3次；加入悬浮于无血清的RPMI1640培养液中的黑色素瘤B16细胞0.1 ml(105细胞)，置37 ℃50 ml/L CO2培养箱温育2 h后用PBS冲洗3次，洗去未贴壁的细胞。每孔加入100 μl PBS和1 g/L NP-40裂解粘附细胞，测上清中乳酸脱氢酶活性[9]。
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2 结果
2.1 工程菌的诱导表达
表达质粒pF94-82在大肠杆菌中经IPTG 37 ℃诱导后，SDS-PAGE分析表明有明显特异表达产物带(图1)。在37 ℃条件下，CH82主要以包涵体形式存在，扫描分析表明占菌体总蛋白21%以上；在22 ℃条件下所得的CH82大部分为可溶性的，其表达效率为20%，与37 ℃表达比较变化不大(图1)。
图1 CH82在37 ℃和22 ℃培养条件下表达比较
1、5：诱导前受体菌(对照)总蛋白；2、6：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；3、8：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；4、7：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；M：蛋白分子量标准
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2.2 CH82的纯化及其结合肝素的作用
22 ℃诱导表达的菌体用超声波破菌后离心去沉淀,上清上DEAE-52柱,经100 mmol/L NaCl洗脱，可以得到CH82的半纯品，再经Heparin-agarose亲和层析，可得到CH82的纯品(图2)。CH82的分子量理论值为66.57 ku，纯化产物的电泳结果与理论值相符。
图2 可溶性CH82的分离纯化结果
1：蛋白分子量标准；2：诱导前受体菌(对照)总蛋白；3：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；4：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；5：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；6：经DEAE-52分离得到的半纯品再经Heparin-agarose亲和层析得到的纯品；7：经DEAE-52分离后的CH82半纯品
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工程菌经37 ℃诱导表达后制成的包涵体，用10 g/L Triton X-100洗涤包涵体可去除大部分菌体蛋白，而重组蛋白CH82并无损失，用2 mol/L和4 mol/L尿素可去除残留的Triton X-100[10]。包涵体溶解复性后得到的半纯品(CH82)再通过肝素-琼脂糖亲和层析柱，经含100 mmol/L NaCl的PB (pH7.0)充分洗柱后(可完全洗去非特异性粘附蛋白[1])，再用含300 mmol/L NaCl的PB (pH7.0)进行洗脱，可得到纯度很高的CH82(图3)。亲和层析的结果同时也证明CH82具有结合肝素的能力。
图3 包涵体形式CH82的分离纯化结果
1：蛋白质分子量标准；2：诱导前受体菌(对照)总蛋白；3：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；4：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；5：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；6：包涵体粗品；7：经变性与复性后的包涵体半纯品；8：包涵体经半纯品再经Heparin-agarose亲和层析得到的纯品
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2.3 CH82结合细胞的作用
采用黑色素瘤细胞检测CH82和CH50(FN的Cell I-Hep Ⅱ双结构域重组多肽[7])结合细胞的作用，结果如图4。两种多肽结合细胞的能力均呈浓度依赖关系。以ED50(当结合的细胞达到最大结合量一半时的FN多肽浓度[1])表示多肽的结合能力，CH82约为1 nmol/L，而CH50为8 nmol/L。这些结果从功能上进一步证明，由上述途径得到的产物确为CH82。
图4 CH82和CH50多肽粘附黑色素瘤B16细胞的作用比较
3 讨论
大肠杆菌BL21(DE3)的基因组中含有LacUV5控制下的T7RNA聚合酶基因，质粒pF94-82携带有T7启动子控制下的cDNA片段。BL21(DE3)/T7是一种大肠杆菌高效表达系统，含有完整的T7表达元件，它不仅可以在常温(37 ℃)下高效表达外源蛋白，而且在低温(22 ℃)条件下仍能得到高效率的可溶性表达，使表达产物可在非变性状态下得以快速纯化，从而保证了表达产物的功能[8]。降低培养温度到允许的生长温度(22 ℃)是降低包涵体形成的方法之一。从氨基酸序列可知，CH82中碱性氨基酸(R+K)与酸性氨基酸(D+E)的比值是56∶59，为酸性蛋白，其工程菌裂解物可通过DEAE-52分离得到CH82的半纯品，表明CH82的确为酸性蛋白。在22 ℃下表达的可溶性产物直接通过DEAE-52和肝素-琼脂糖亲和层析可得到CH82的纯品；在37 ℃下表达的CH82主要以包涵体形式存在，在包涵体中，除目标蛋白外还含有其他宿主菌的蛋白质如RNA聚合酶，外膜蛋白OmpC，OmpF和OmpA， 16 s和23 s RNA及重组质粒DNA，用含有尿素或Triton X-100的缓冲液漂洗几次后，外膜蛋白质大部分可被除去，而目标蛋白仍处于不溶状态。本文用10g/L Triton X-100、2 mol/L和 4 mol/L尿素溶液逐级洗涤，再用8 mol/L尿素溶解包涵体，然后透析，复性，经Heparin-agarose亲和层析，获得了较满意的纯化效果。由于CH82肽链中没有胱氨酸，不形成二硫键，在低温(22 ℃)下可高效表达成可溶性产物，可以直接通过离子交换层析进行分离，为大肠杆菌中重组表达产物的纯化提供了一个十分简便的方法；同时CH82不含二硫键也使其包涵体复性方法更简便。CH82多肽含有两个结合细胞的功能结构域，它结合细胞的能力比双功能结构域FN更强。CH82的制备为进一步研究具有更强的抑制肿瘤转移作用及免疫调节作用的基因工程制品奠定了基础。 00
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(No.39370783)，卫生部科学基金资助项目(No.96-1-140)
作者简介:李明才，男，1965年生，医学硕士，主管技师。现址：武汉市卫生防疫站病毒科，武汉430022
参考文献
1 Kimizuka F, Taguchi Y, Ohaate Y et al. Production and characterization of functional domains of human fibronectin expressed in Escherichia coli. J Biochem,1991,110:284
2 Saiki I, Makbe T, Yoneda J et al. Inhibitory effect of fibronectin and its recombinant polypeptides on the adhesion of metastatic melanoma cells to laminin. Jpn J Cancer Res ,1991,82:1112
, 百拇医药
3 Matsumoto Y, Saiki Y, Makabe T et al. Inhibitory effect of antimetastatic fusion polypeptide of human fibronectin on tumor cell adhesion to extracellular matrices. Jpn J Cancer Res ,1991,82:1130
4 Yoneda J, Saiki I,Kobayashi H et al. Inhibitory effect of recombinant fibronectin polypeptides on the adhesion of liver-metastatic lymphoma cells to hepatic sinusoidal endothelial cells and tumor invasion. Jpn J Cancer Res ,1994,85:723
, 百拇医药
5 Saiki I, Murata J, Makabe T et al. Inhibition of lung metastasis by synthetic and recombinant with functional domains. Jpn J Cancer Res ,1990,81:1003
6 Saiki I, Matsumoto Y, Murata J et al. Recombinant fusion polypeptide with cell-and heparin-binding domains of fibronectin inhibits liver metastasis of L5178YML-25 lymphoma cells. Jpn J Cancer Res, 1991,82:1120
7 冯作化，张桂梅，李 东等. Cell IHep Ⅱ重组FN多肽在大肠肝菌中的表达及纯化研究. 武汉大学学报(自然科学版),1996,42(生物工程专刊):125
8 江智红，杨 毅，屠红民等.大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因的克隆与表达. 生物化学与生物物理学报,1996,28(6):606
9 陈丙莺, 马建吟，黄钦田等. 简易自然杀伤试验-LDH释放改良法. 上海免疫学杂志,1989,9:218
10 梅俊杰，高杰英，丁广治等. 小鼠白细胞介素5融合蛋白在大肠肝菌中的表达.中国免疫学杂志,1997,13(1):6
收稿日期:1998-10-22, 百拇医药
单位：同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉 430030
关键词：纤连蛋白；重组多肽；表达；蛋白纯化；肿瘤转移
同济医科大学学报990505 摘要 在大肠杆菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽——人纤连蛋白(FN)的Cell I-Hep Ⅱ-Cell Ⅱ三结构域重组多肽(CH82)，表达效率达21%。在低温(22 ℃)培养表达时，CH82大部分为可溶性产物，经DEAE-52层析及 Heparin-agarose亲和层析可得到纯品；在高温(37 ℃)培养表达时，CH82主要以包涵体形式出现，经尿素变性与复性处理后，可通过Heparin-agarose亲和层析得到纯品。 所得纯品均具有结合肝素和结合细胞的功能，且结合细胞的能力比双结构域FN更强，表明两个结合细胞的功能结构域均有活性。
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中图法分类号 Q51， Q7， R73-37
The Purification and Expression of Triple-domain Recombinant
Fibronectin Polypeptide in E.coli
Li Mingcai, Feng Zuohua, Li Dong et al
Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental
Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
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Abstract An anti-metastatic polypeptide, triple-domain (Cell I-Hep II-Cell II) recombinant polypeptide of human fibronectin, was expressed in E.coli and purified (CH82). The expression level was to be about 21%. CH82 was soluble in 22 ℃. After sonication and centrifugation of engineering bacteria, the soluble supernatant was applied to DEAE-52 column. The purified product was obtained after the affinity chromatograph with Heparin-agarose. CH82 was inclusion bodies in 37 ℃, After denaturation and renaturation of the inclusion bodies with urea, the purified product was obtained after the affinity chromatograph with Heparin-agarose. The purified product was capable of binding heparin and cells, and has a better binding activity than bifunctional-domain FN polypeptides.
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Key words fibronectin; recombinant polypeptide; expression; purification; metastasis
纤连蛋白(fibronectin, FN)是一种含多个功能结构域的细胞外基质糖蛋白。 它的结合细胞(Cell I)和结合肝素(Hep Ⅱ)双功能结构域重组多肽具有抑制肿瘤转移的功能[1]，能在肿瘤细胞侵入其它组织的几个关键步骤中起抑制作用[2～4]， 有效地阻止肿瘤细胞转移到肺和肝脏[5，6]。 如果在Cell I-Hep Ⅱ双功能结构域重组多肽的C端再加上FN的Cell Ⅱ结构域(IIICS)中的CS1片段，则重组多肽的功能更强[2]，但该多肽在大肠杆菌中的表达效率却很低[1]。本文表达的Cell I-Hep Ⅱ-CS1三结构域重组多肽(删除了CS1序列N端Asp1961-Glu1978的18个氨基酸)在大肠杆菌中具有较高的表达效率，同时对它进行了分离纯化与功能鉴定。
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1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存，质粒pF9482为本室构建(另文发表)，该质粒携带T7启动子控制下的cDNA片段，该片段编码人纤连蛋白的Cell I结构域(Pro 1239-Ser 1515)、Hep Ⅱ结构域(Ala 1690-Glu 1952)和Cell Ⅱ结构域(Ile 1979-Val 2049)，将质粒pF94-82转化大肠杆菌BL21(DE3)即为工程菌，所表达的多肽命名为CH82。
1.2 工程菌的诱导表达及产物性质分析
取单菌落接种于含Amp的M9ZB培养基中，于37 ℃振荡培养过夜，将培养物1∶40稀释于含Amp的LB培养基中置37 ℃振荡培养2～3 h至A600=0.3～0.5，加入1 mmol/L IPTG，37 ℃培养6 h[7]或22 ℃培养20 h[8]进行表达。收集表达菌，超声波破菌，离心，将上清和沉淀分别制成电泳样品并进行SDS-PAGE电泳分析，以确定表达产物的溶解性。
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1.3 重组多肽的纯化
1.3.1可溶性表达产物的纯化： 工程菌经22 ℃诱导表达后采用超声波破菌，上清通过DEAE-52层析进行分离，从离子交换柱收集的半纯品再经Heparinag-arose亲和层析进行纯化[7]。
1.3.2 不溶性表达产物的纯化： 取培养过夜的工程菌1∶40稀释于200 ml含Amp的LB培养基中，于37 ℃振荡培养至A600=0.3～0.5，加入IPTG至1 mmol/L，诱导表达6 h后离心收集细菌，悬浮于30 ml 20 mmol/L Tris-Cl，2 mmol/L EDTA，pH8.0溶液，加入溶菌酶(1～2 mg/g湿菌)，消化2 h。冰浴超声破菌，离心弃上清，沉淀分别用20 mmol/L Tris-Cl，2 mmol/L EDTA的10 g/L Triton X-100、2 mol/L尿素和 4 mol/L尿素溶液各洗涤2次，再用PBS溶液洗沉淀3次。将上述沉淀溶于8 mol/L尿素的10 mmol/L DTT，2 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-Cl， pH8.0。离心去不溶物，得到包涵体粗提物。将其按1∶80的比例稀释于20 mmol/L磷酸缓冲液(PB)，pH7.2，100 mmol/L NaCl中并对此溶液4 ℃透析24～48 h使目的蛋白复性。离心去沉淀，将上清中表达产物经过Heparin-agarose亲和层析柱进行纯化。
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1.3.3 检测： 纯化后的样品采用改良的Lowry法测蛋白质含量，SDS-PAGE电泳后蛋白质带扫描分析采用岛津薄层扫描仪。
1.4 细胞
黑色素瘤细胞B16/F1， 购自美国ATCC公司。
1.5 细胞粘附试验
按文献[7]方法，用含氯化钠的磷酸缓冲液(PBS)将重组FN多肽稀释成不同浓度用于包被96孔培养板，50 μl/孔，对照组加PBS。每一个浓度3个复孔，置4 ℃过夜。用PBS洗板3次，加入30 g/L BSA(100 μl/孔)。置37 ℃温育1 h，再用PBS洗板3次；加入悬浮于无血清的RPMI1640培养液中的黑色素瘤B16细胞0.1 ml(105细胞)，置37 ℃50 ml/L CO2培养箱温育2 h后用PBS冲洗3次，洗去未贴壁的细胞。每孔加入100 μl PBS和1 g/L NP-40裂解粘附细胞，测上清中乳酸脱氢酶活性[9]。
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2 结果
2.1 工程菌的诱导表达
表达质粒pF94-82在大肠杆菌中经IPTG 37 ℃诱导后，SDS-PAGE分析表明有明显特异表达产物带(图1)。在37 ℃条件下，CH82主要以包涵体形式存在，扫描分析表明占菌体总蛋白21%以上；在22 ℃条件下所得的CH82大部分为可溶性的，其表达效率为20%，与37 ℃表达比较变化不大(图1)。
图1 CH82在37 ℃和22 ℃培养条件下表达比较
1、5：诱导前受体菌(对照)总蛋白；2、6：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；3、8：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；4、7：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；M：蛋白分子量标准
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2.2 CH82的纯化及其结合肝素的作用
22 ℃诱导表达的菌体用超声波破菌后离心去沉淀,上清上DEAE-52柱,经100 mmol/L NaCl洗脱，可以得到CH82的半纯品，再经Heparin-agarose亲和层析，可得到CH82的纯品(图2)。CH82的分子量理论值为66.57 ku，纯化产物的电泳结果与理论值相符。
图2 可溶性CH82的分离纯化结果
1：蛋白分子量标准；2：诱导前受体菌(对照)总蛋白；3：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；4：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；5：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；6：经DEAE-52分离得到的半纯品再经Heparin-agarose亲和层析得到的纯品；7：经DEAE-52分离后的CH82半纯品
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工程菌经37 ℃诱导表达后制成的包涵体，用10 g/L Triton X-100洗涤包涵体可去除大部分菌体蛋白，而重组蛋白CH82并无损失，用2 mol/L和4 mol/L尿素可去除残留的Triton X-100[10]。包涵体溶解复性后得到的半纯品(CH82)再通过肝素-琼脂糖亲和层析柱，经含100 mmol/L NaCl的PB (pH7.0)充分洗柱后(可完全洗去非特异性粘附蛋白[1])，再用含300 mmol/L NaCl的PB (pH7.0)进行洗脱，可得到纯度很高的CH82(图3)。亲和层析的结果同时也证明CH82具有结合肝素的能力。
图3 包涵体形式CH82的分离纯化结果
1：蛋白质分子量标准；2：诱导前受体菌(对照)总蛋白；3：工程菌经IPTG诱导表达后的总蛋白；4：工程菌经IPTG诱导表达后上清中的总蛋白；5：工程菌经IPTG诱导表达后沉淀中的总蛋白；6：包涵体粗品；7：经变性与复性后的包涵体半纯品；8：包涵体经半纯品再经Heparin-agarose亲和层析得到的纯品
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2.3 CH82结合细胞的作用
采用黑色素瘤细胞检测CH82和CH50(FN的Cell I-Hep Ⅱ双结构域重组多肽[7])结合细胞的作用，结果如图4。两种多肽结合细胞的能力均呈浓度依赖关系。以ED50(当结合的细胞达到最大结合量一半时的FN多肽浓度[1])表示多肽的结合能力，CH82约为1 nmol/L，而CH50为8 nmol/L。这些结果从功能上进一步证明，由上述途径得到的产物确为CH82。
图4 CH82和CH50多肽粘附黑色素瘤B16细胞的作用比较
3 讨论
大肠杆菌BL21(DE3)的基因组中含有LacUV5控制下的T7RNA聚合酶基因，质粒pF94-82携带有T7启动子控制下的cDNA片段。BL21(DE3)/T7是一种大肠杆菌高效表达系统，含有完整的T7表达元件，它不仅可以在常温(37 ℃)下高效表达外源蛋白，而且在低温(22 ℃)条件下仍能得到高效率的可溶性表达，使表达产物可在非变性状态下得以快速纯化，从而保证了表达产物的功能[8]。降低培养温度到允许的生长温度(22 ℃)是降低包涵体形成的方法之一。从氨基酸序列可知，CH82中碱性氨基酸(R+K)与酸性氨基酸(D+E)的比值是56∶59，为酸性蛋白，其工程菌裂解物可通过DEAE-52分离得到CH82的半纯品，表明CH82的确为酸性蛋白。在22 ℃下表达的可溶性产物直接通过DEAE-52和肝素-琼脂糖亲和层析可得到CH82的纯品；在37 ℃下表达的CH82主要以包涵体形式存在，在包涵体中，除目标蛋白外还含有其他宿主菌的蛋白质如RNA聚合酶，外膜蛋白OmpC，OmpF和OmpA， 16 s和23 s RNA及重组质粒DNA，用含有尿素或Triton X-100的缓冲液漂洗几次后，外膜蛋白质大部分可被除去，而目标蛋白仍处于不溶状态。本文用10g/L Triton X-100、2 mol/L和 4 mol/L尿素溶液逐级洗涤，再用8 mol/L尿素溶解包涵体，然后透析，复性，经Heparin-agarose亲和层析，获得了较满意的纯化效果。由于CH82肽链中没有胱氨酸，不形成二硫键，在低温(22 ℃)下可高效表达成可溶性产物，可以直接通过离子交换层析进行分离，为大肠杆菌中重组表达产物的纯化提供了一个十分简便的方法；同时CH82不含二硫键也使其包涵体复性方法更简便。CH82多肽含有两个结合细胞的功能结构域，它结合细胞的能力比双功能结构域FN更强。CH82的制备为进一步研究具有更强的抑制肿瘤转移作用及免疫调节作用的基因工程制品奠定了基础。 00
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*国家自然科学基金资助项目(No.39370783)，卫生部科学基金资助项目(No.96-1-140)
作者简介:李明才，男，1965年生，医学硕士，主管技师。现址：武汉市卫生防疫站病毒科，武汉430022
参考文献
1 Kimizuka F, Taguchi Y, Ohaate Y et al. Production and characterization of functional domains of human fibronectin expressed in Escherichia coli. J Biochem,1991,110:284
2 Saiki I, Makbe T, Yoneda J et al. Inhibitory effect of fibronectin and its recombinant polypeptides on the adhesion of metastatic melanoma cells to laminin. Jpn J Cancer Res ,1991,82:1112
, 百拇医药
3 Matsumoto Y, Saiki Y, Makabe T et al. Inhibitory effect of antimetastatic fusion polypeptide of human fibronectin on tumor cell adhesion to extracellular matrices. Jpn J Cancer Res ,1991,82:1130
4 Yoneda J, Saiki I,Kobayashi H et al. Inhibitory effect of recombinant fibronectin polypeptides on the adhesion of liver-metastatic lymphoma cells to hepatic sinusoidal endothelial cells and tumor invasion. Jpn J Cancer Res ,1994,85:723
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收稿日期:1998-10-22, 百拇医药