三七及其混淆品蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴别
作者：侯连兵 陈振德 陈志良 许重远 杨西晓
单位：第一军医大学南方医院 广州 510515
关键词：三七；高效毛细管电泳；生药鉴别
中草药001130
摘 要 目的：对三七及其混淆品进行蛋白多肽电泳鉴别。方法：采用 高效毛细管电泳法对三七及其混淆品蛋白多肽进行分析。结果：三七及其混淆品蛋白多肽高 效毛细管电泳谱图有明显的差异。结论：高效毛细管电泳可作为中药三七的生药鉴别方法。
Indentification of Proteins from Panax pseudo-ginseng var. notoginseng and
Its Confusable Varieties by HPCE
, http://www.100md.com
Hou Lianbing Chen Zhende Chen Zhiliang Xu Chongyuan and Yang Xixiao
(Nanfang Hospital, First Military Medical University Guangzhou 510515)
Abstract Panax pseudo-ginseng Wall. var. notoginsen g (Burkill) Hoo et Tseng and its easily confusable varieties were distin guished by analysing their proteins with high-performance capillary electrophor esis (HPCE). Result of the analysis showed that their protein electrophotograms were obviously different and could be used for the pharmacognostic identificatio n of P. pseudo-ginseng Wall. var. notoginsen g.
, 百拇医药
Key words Panax pseudo-ginseng Wall. var. n otoginseng (Burkill) Hoo et Tseng HPCE pharmacognostic identification
中药三七始载于《本草纲目》，为五加科 Araliaceae 植物 Panax pseudo-ginseng Wall. var. notoginseng (Burkil l) Hoo et Tseng 人参三七的根， 历版《中华人民共和国药典》均有收载。本品具有散瘀止血，消肿定痛之功效，用于咯血、 便血、崩漏 、外伤出血、胸腹刺痛、跌打肿痛等症。三七在止血与抗凝血，心血管系统，中枢神经系统 ，抗氧化与抗衰老，脂、糖、蛋白质与核酸代谢，抗炎，免疫系统，护肝利胆等方面具有广 泛的药理作用[1]；也是云南白药等多种著名中成药处方中的主要药材之一。
三七为贵重中药，故民间出现以三七命名的药材种类繁多，如菊科的菊叶三七 Gyn ura segetum Merr.、景天科的景天三七 Sedum aizoon L.、 五 加科的竹节三七 Panax japonicum C. A. Mey. 等近 20 种[2 ，3 ]。赵学敏的《本草纲目拾遗》就收载有 16 种，可见其混乱由来以久。三七多以药材外 观、显微切片、粉末、理化等方法鉴别，操作繁杂，专属性不强。我们拟以中药材细胞中普 遍存在的，受遗传基因控制的蛋白多肽分子为指标，用近年来迅速发展的新型分离分析技术 高效毛细管电泳法来探索和论证从分子水平鉴别三七的可行性。
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1 材料与方法
1.1 材料：三七购自广东省药材公司，菊叶三七采自江西九江，并经作者鉴定。
1.2 仪器与试剂：美国 BIO-RAD 公司 BioFocusTM 3 000 型 Capillary Ion Anal yzer，配有紫外扫描检测器。熔融石英毛细管 75 μm × 60 cm (河北永年光纤厂)。所用 试剂均为分析纯。
1.3 电泳条件：电解缓冲液为 150 mmol/L 硼酸盐溶液 (pH 8.5)；电压为 20 kV；温度 20 ℃；紫外检测波长 200 nm；重力进样，时间 5 s。开机后先用 0.1 mol/L 氢氧化钠冲 洗毛细管 2 min，再用去离子水冲洗 5 min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样。每 两次进样之间设定缓冲液冲洗 2 min。
1.4 样品溶液的配制：取生药样品 0.5 g，加入蛋白提取液 5 mL，在冰浴中研磨成匀浆 状，转移至离心管内，以 5 000 r/min 离心 20 min，取上清液备用。Tris-甘氨酸蛋白提 取液：Tris 0.6 g，甘氨酸 2.88 g，加蒸馏水溶解至 1 000 mL。碱性蛋白提取液：Tris - HCl 0.1 mol/L,0.1% 抗坏血酸，巯基乙醇 10 mmol/L,pH 8.0。酸性蛋白提取液：柠檬 酸 8 0 mmol/L, Na2HPO4 32 mmol/L，抗坏血酸 5 mmol/L，巯基乙醇 10 mmol/L，pH 2 .8。
, 百拇医药
2 结果
2.1 在酸性提取液中，三七在 5.21，8.80 和 9.17 min 处各有一吸收峰，而菊叶三 七只在 11.08 min 处有一吸收峰。
2.2 在中性提取液中，三七在 5.11，7.72 和 8.68 min 处各有一吸收峰，而菊叶三 七只在 9.00 min 处有一吸收峰。
2.3 在碱性提取液中，三七在 5.53，8.75，8.97，9.96，10.33 和 11.99 min 处 各有一吸收峰，而菊叶三七在 10.41，10.74，13.40 和 15.28 min 处各有一吸收峰。
综合 3 种提取液所检测的图谱，可以看出三七及其混淆品的 HPCE 谱图存在显著差异，容 易加以区别(见图1)，可作为中药三七的鉴别方法。
, http://www.100md.com 3 讨论
A-三七 B-菊叶三七 1-酸性提取液 2-中性提取液 3-碱性提取液
图1 三七和菊叶三七蛋白多肽 HPCE 谱图
3.1 HPCE 已用于多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质的分 离分析[4 ]。胡平等报道提取菟丝子种子植物蛋白用 HPCE 法进行生药鉴定，认为根据种子植物蛋 白的 电泳图谱，可有效地鉴别菟丝子的来源[5]。张朝晖等报道对 12 种海马、海龙类 药材采用 HPCE 进行鉴别，结果表明种间区别较明显，认为该法速度快，分辨力强、重现性 好[6]。
3.2 从我们应用 HPCE 对三七及菊叶三七蛋白多肽检测结果看，三七及其混淆品在 3 种 提取液中的 HPCE 吸收峰有明显的差异，本实验结果可供三七及其混淆品的鉴别作参考。
, http://www.100md.com
Addr ess： Hou Lianbing, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou
侯连兵 男，1957年6月出生，药学硕士，副教授、副主任药师，硕士生导师。现任第一军 医大学临床药理研究所副所长、南方医院药学部副主任。近年主要从事天然药物研究与开发 以及中药药理学研究。主持研究2000年国家科技重点攻关项目1 项，广东省重点科技攻关2 项。获国家二、三类新药证书2 个，国家、军队科技进步奖7 次。主编、副主编专著7 部。 发表各类研究论文83 篇。
参 考 文 献
1，梅全喜，毕焕新主编.现代中药药理手册.北京：中国中医药出版社，1998： 446
2，阎文玫主编.中药材真伪鉴定.北京：人民卫生出版社，1994：16
3，沈保安主编.中药鉴定现代研究.北京：中国中医药出版社，1998：73
4，李红旗，沈忠耀.生物工程进展，1995，15(6)：40
5，胡 平，罗国安，王如骥，等.药学学报，1997，32(7)：549
6，张朝晖，范国荣，徐国钧，等.中国中药杂志，1998，23(5)：25
(1999-08-10收稿), 百拇医药
单位：第一军医大学南方医院 广州 510515
关键词：三七；高效毛细管电泳；生药鉴别
中草药001130
摘 要 目的：对三七及其混淆品进行蛋白多肽电泳鉴别。方法：采用 高效毛细管电泳法对三七及其混淆品蛋白多肽进行分析。结果：三七及其混淆品蛋白多肽高 效毛细管电泳谱图有明显的差异。结论：高效毛细管电泳可作为中药三七的生药鉴别方法。
Indentification of Proteins from Panax pseudo-ginseng var. notoginseng and
Its Confusable Varieties by HPCE
, http://www.100md.com
Hou Lianbing Chen Zhende Chen Zhiliang Xu Chongyuan and Yang Xixiao
(Nanfang Hospital, First Military Medical University Guangzhou 510515)
Abstract Panax pseudo-ginseng Wall. var. notoginsen g (Burkill) Hoo et Tseng and its easily confusable varieties were distin guished by analysing their proteins with high-performance capillary electrophor esis (HPCE). Result of the analysis showed that their protein electrophotograms were obviously different and could be used for the pharmacognostic identificatio n of P. pseudo-ginseng Wall. var. notoginsen g.
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Key words Panax pseudo-ginseng Wall. var. n otoginseng (Burkill) Hoo et Tseng HPCE pharmacognostic identification
中药三七始载于《本草纲目》，为五加科 Araliaceae 植物 Panax pseudo-ginseng Wall. var. notoginseng (Burkil l) Hoo et Tseng 人参三七的根， 历版《中华人民共和国药典》均有收载。本品具有散瘀止血，消肿定痛之功效，用于咯血、 便血、崩漏 、外伤出血、胸腹刺痛、跌打肿痛等症。三七在止血与抗凝血，心血管系统，中枢神经系统 ，抗氧化与抗衰老，脂、糖、蛋白质与核酸代谢，抗炎，免疫系统，护肝利胆等方面具有广 泛的药理作用[1]；也是云南白药等多种著名中成药处方中的主要药材之一。
三七为贵重中药，故民间出现以三七命名的药材种类繁多，如菊科的菊叶三七 Gyn ura segetum Merr.、景天科的景天三七 Sedum aizoon L.、 五 加科的竹节三七 Panax japonicum C. A. Mey. 等近 20 种[2 ，3 ]。赵学敏的《本草纲目拾遗》就收载有 16 种，可见其混乱由来以久。三七多以药材外 观、显微切片、粉末、理化等方法鉴别，操作繁杂，专属性不强。我们拟以中药材细胞中普 遍存在的，受遗传基因控制的蛋白多肽分子为指标，用近年来迅速发展的新型分离分析技术 高效毛细管电泳法来探索和论证从分子水平鉴别三七的可行性。
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1 材料与方法
1.1 材料：三七购自广东省药材公司，菊叶三七采自江西九江，并经作者鉴定。
1.2 仪器与试剂：美国 BIO-RAD 公司 BioFocusTM 3 000 型 Capillary Ion Anal yzer，配有紫外扫描检测器。熔融石英毛细管 75 μm × 60 cm (河北永年光纤厂)。所用 试剂均为分析纯。
1.3 电泳条件：电解缓冲液为 150 mmol/L 硼酸盐溶液 (pH 8.5)；电压为 20 kV；温度 20 ℃；紫外检测波长 200 nm；重力进样，时间 5 s。开机后先用 0.1 mol/L 氢氧化钠冲 洗毛细管 2 min，再用去离子水冲洗 5 min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样。每 两次进样之间设定缓冲液冲洗 2 min。
1.4 样品溶液的配制：取生药样品 0.5 g，加入蛋白提取液 5 mL，在冰浴中研磨成匀浆 状，转移至离心管内，以 5 000 r/min 离心 20 min，取上清液备用。Tris-甘氨酸蛋白提 取液：Tris 0.6 g，甘氨酸 2.88 g，加蒸馏水溶解至 1 000 mL。碱性蛋白提取液：Tris - HCl 0.1 mol/L,0.1% 抗坏血酸，巯基乙醇 10 mmol/L,pH 8.0。酸性蛋白提取液：柠檬 酸 8 0 mmol/L, Na2HPO4 32 mmol/L，抗坏血酸 5 mmol/L，巯基乙醇 10 mmol/L，pH 2 .8。
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2 结果
2.1 在酸性提取液中，三七在 5.21，8.80 和 9.17 min 处各有一吸收峰，而菊叶三 七只在 11.08 min 处有一吸收峰。
2.2 在中性提取液中，三七在 5.11，7.72 和 8.68 min 处各有一吸收峰，而菊叶三 七只在 9.00 min 处有一吸收峰。
2.3 在碱性提取液中，三七在 5.53，8.75，8.97，9.96，10.33 和 11.99 min 处 各有一吸收峰，而菊叶三七在 10.41，10.74，13.40 和 15.28 min 处各有一吸收峰。
综合 3 种提取液所检测的图谱，可以看出三七及其混淆品的 HPCE 谱图存在显著差异，容 易加以区别(见图1)，可作为中药三七的鉴别方法。
, http://www.100md.com 3 讨论
A-三七 B-菊叶三七 1-酸性提取液 2-中性提取液 3-碱性提取液
图1 三七和菊叶三七蛋白多肽 HPCE 谱图
3.1 HPCE 已用于多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质的分 离分析[4 ]。胡平等报道提取菟丝子种子植物蛋白用 HPCE 法进行生药鉴定，认为根据种子植物蛋 白的 电泳图谱，可有效地鉴别菟丝子的来源[5]。张朝晖等报道对 12 种海马、海龙类 药材采用 HPCE 进行鉴别，结果表明种间区别较明显，认为该法速度快，分辨力强、重现性 好[6]。
3.2 从我们应用 HPCE 对三七及菊叶三七蛋白多肽检测结果看，三七及其混淆品在 3 种 提取液中的 HPCE 吸收峰有明显的差异，本实验结果可供三七及其混淆品的鉴别作参考。
, http://www.100md.com
Addr ess： Hou Lianbing, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou
侯连兵 男，1957年6月出生，药学硕士，副教授、副主任药师，硕士生导师。现任第一军 医大学临床药理研究所副所长、南方医院药学部副主任。近年主要从事天然药物研究与开发 以及中药药理学研究。主持研究2000年国家科技重点攻关项目1 项，广东省重点科技攻关2 项。获国家二、三类新药证书2 个，国家、军队科技进步奖7 次。主编、副主编专著7 部。 发表各类研究论文83 篇。
参 考 文 献
1，梅全喜，毕焕新主编.现代中药药理手册.北京：中国中医药出版社，1998： 446
2，阎文玫主编.中药材真伪鉴定.北京：人民卫生出版社，1994：16
3，沈保安主编.中药鉴定现代研究.北京：中国中医药出版社，1998：73
4，李红旗，沈忠耀.生物工程进展，1995，15(6)：40
5，胡 平，罗国安，王如骥，等.药学学报，1997，32(7)：549
6，张朝晖，范国荣，徐国钧，等.中国中药杂志，1998，23(5)：25
(1999-08-10收稿), 百拇医药