3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在心肌组织自显影的研究*
作者：金基焕1 安君1 李素香1 崔苍海1 尹正日2 金青松2 崔城洛2 刘鼎新3 董彦3 仪明光4
单位：延边医学院133000，1.心胸外科；2.电镜室；3.北京医科大学细胞生物研究室；4.中国原子能科学研究院
关键词：心肌；三磷酸腺苷；镁
提要 利用放射自显影术从形态学上观察3H 提要 利用放射自显影术从形态学上观察3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常和缺血缺氧心肌组织、细胞超微结构中的分布规律。结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP缺血缺氧心肌超微结构中均有分布，但三者均以线粒体内为多，从银粒数目上看，3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP多。外源性ATP对缺血缺氧心肌细胞有保护作用，而且外源性ATP对缺血缺氧心肌细胞的作用基点可能在线粒体上。
, 百拇医药
近年来已研究证明ATP-MgCl2对实验性心肌缺血和心脏外科的心肌保护上有十分明显的效果[1，2]，但其机制尚不清楚。本研究目的旨在观察3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常(非缺血)和缺血缺氧动物心肌组织内的分布，以期为探讨外源ATP-MgCl2、ATP-Mg2+性等能量制剂对心肌保护作用机理的研究提供形态学基础。
材料和方法
一、材料
1.实验动物：昆明种小鼠.体重25～27g，雌雄兼用，由北京医科大学动物室提供。
2.药品：ATP-MgCl2、ATP-Mg2+和ATP由日本千叶大学提供，中国原子能科学研究院同位素研究所标记。
, 百拇医药
二、方法
将54只健康小鼠随机分为3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP组进而分为缺血缺氧和对照组。
1.缺血缺氧小鼠模型的制备：采用小鼠眼底后静脉放血法，放血量为全血量的30%，放血后90分钟用于实验。
2.缺血缺氧小鼠心肌模型鉴定：将正常小鼠心肌和缺血缺氧小鼠心肌行冰冻切片(6μm)，贴于盖片，稍干后即分别加入作用液(LDH和SDH作用液)[3]，封片后用光镜观察结果。
3.示踪剂剂量和注射途径：3H-ATP-MgCl2放射性为1.0mCi/m，3H-ATP-Mg2+为1.15mCi/mg，3H-ATP为1.05mCi/mg。三者的放射化学纯度均大于95%。用ATP-MgCl2溶解液稀释后使用。注入剂量每克体重为5μCi，采用尾静脉注射。
, 百拇医药
4.取材时间，注射示踪剂后分别于3、6、10、20分钟取材。
5.光镜标本和自显影标本的制备：注射示踪剂后，按上述时间开胸取出心脏速冻，而后转入恒冷箱切片机内，将其切成6.0～8.0μm厚的冰冻节片(左心室壁)，将冰冻片裱贴在载玻片上，再转入-40°C低温冰箱内冷冻干燥。
在暗室安全灯下，将核-4乳胶(中国原子能科学研究院提供)按浸膜法[4]涂敷乳胶，避光条件下4°C冰箱内曝光6周而后显影，水洗，定影，水洗，HE染色封片。
将制得的自显影片在光镜下观察结果每个标本在1000倍油镜下随机观察9个视野银粒，测微尺下计数固定视野5×5小方格(9.9×9.9μm2)内的银粒总和减去本底银粒即为一个视野的银粒数。
6.电镜自显影：雄性小鼠6只(Bal B/C种)体重19～25G，随机分成3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP组。示踪剂注射剂量每克体重为40μCi，注射后1、3、6分钟取材(左心室壁)，按电镜样品制备常规进行固定、脱水、包埋，超薄切片(500A)，放在覆有Formvar膜的铜网上。在暗室安全灯下，按金属环法[4]涂敷HW-4核乳胶(中国原子能科学研究所提供)，避光条件下-20°C低温冰箱内曝光14个月后，经显影、水洗、停显影、水洗、定影，最后醋酸铀及柠檬铅染色。
, 百拇医药
将制得的电镜自显影片用电镜观察。用双盲法选取视野，观察、照像时的放大倍率恒定，每一标本随机拍5张照片进行阅读分析。
结 果
1.缺血缺氧鼠组：放血30%(全血量的30%)，经90分钟，缺血缺氧鼠心模型心肌组织中乳酸脱氢酶(LDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)颗粒较正常对照组明显减少。
2.3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP自显影银粒在正常和缺血缺氧鼠心肌组织中均有分布。
3.在正常心肌组织中，注射示踪剂后6分钟，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+组的银粒计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)；其余3、10、20分钟三者无差异(P>0.05，表1)。
, 百拇医药
表1 正常心肌组织中银粒计数比较(9.9×9.9μm2)
分组
鼠数
注射后至取材时间(分钟)
3
6
10
20
AMC
20
58±8
85±9*
, 百拇医药
68±8
38±6
AM
18
53±7
78±9*
54±7
25±5
A
16
47±6
37±6
52±7
, 百拇医药
27±5
* 与A组相比较P<0.01；AMC：3H-ATP-MgCl2组，AM：3H-ATP-Mg2+组，A：3H-ATP组
4.在缺血缺氧鼠心肌组织中,3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+组的银粒计数在3、6、10、20分钟均显著多于3H-ATP组(P<0.01，表2)
表2 缺血缺氧心肌组织中银粒计数比较(9.9×9.9μm2)
分组
鼠数
, 百拇医药
注射后至取材时间(分钟)
3
6
10
20
AMC
20
98±10*
177±13*
117±11*
69±8*
AM
, 百拇医药
18
88±9*
154±12*
97±10*
55±7*
A
16
64±8
47±7
68±8
29±5
*与A组相应时间比较P<0.01；AMC：3H-ATP-MgCl2组，AM3H-ATP-Mg2+组，A：3H-ATP组
, 百拇医药
5.3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP自显影银粒在缺血缺氧鼠心肌细胞各种超微结构中均有分布。但三者均以线粒体内为多(图1～3)；从银粒计数上看3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP为多。
图1 注射3H-ATP-MgCl2后1分钟银粒分布，以线粒体内为多×15000
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图2 注射3H-ATP-Mg2+后1分钟银粒分布，以线粒体内为多×15000
图3 注射3H-ATP后1分钟银粒数目较少，但也大多分布在线粒体上×15000
讨 论
本文采用小鼠眼底后静脉放血法，造成小鼠心肌缺血缺氧并监测其心肌组织内LDH和SDH作为判断心肌缺氧的指标。结果表明缺血缺氧时心肌组织内LDH和SDH活性较正常明显降低。
过去认为外源性ATP难以通过细胞膜，后来Chaudry等[5]报告，外源性ATP以ATP-MgCl2形式静脉注射，可以通过细胞膜尤其是缺血缺氧的细胞膜。而且ATP-MgCl2能够显著地提高因缺氧所致ATP下降的细胞内ATP水平的回升[6]，且这种作用并非ADP-MgCl2或MgCl2所致。ATP-MgCl2对缺血缺氧组织的有效性并不是ATP和MgCl2血管扩张的结果[7]。Chaudry等[5]用14C-ATP、14C-ADP、14C-AMP和14C-adenosine(并加入等量MgCl2)比较了正常和出血性休克鼠肝肾组织中的ATP含量，结果表明，只有14C-ATP加MgCl2进入了肝肾组织细胞内，而且出血性休克鼠肝肾组织细胞内的ATP含量较正常对照组大2.5倍，而14C-ADP、14C-AMP、14C-adenosine在正常和出血性休克鼠肝肾组织细胞中的含量是相同的。本研究结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常和缺血缺氧鼠心肌组织中均有分布。说明外源性ATP可进入正常和缺血缺氧的心肌组织中。在正常心肌组织中注入示踪剂后6分钟3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+组的银粒计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)，其余3、10、20分钟无差异(P>0.05)；在缺血缺氧心肌组织中3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+的银粒数计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)。
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电镜自显影结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在缺血缺氧心肌各种超微结构中均有分布。但三者均以线粒体内为多；从银粒计数来看，3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP为多。Sotonyi等研究证明在线粒体膜及嵴内腔内均有3H-ATP所致自显影银粒。
综上所述，我们认为外源性ATPATP-MgCl2或ATP-Mg2+这种能量制剂形式投给时，将有较多的ATP进入心肌细胞内尤其是缺血缺氧的心肌细胞内，其作用基点可能在线粒体上。因此ATP-MgCl2或ATP-Mg2+这种能量制剂对缺血缺氧心肌细胞有保护作用，且这种保护作用可能是通过改善和恢复线粒体的功能来实现。
, 百拇医药
参考文献
1.北川素. 虚血筋にするATP-MgCl2の效果.千叶医学 1985；61：199.
2.金基焕，等. ATP-氯化镁冷停搏液的研究. 中华麻醉学杂志 1986；6：261.
3.陈啸梅，等.组织化学手册. 北京：人民卫生出版社，1986：224-235.
4.刘鼎新，编著. 放射自显影技术. 北京：科学技术出版社，1986；92-131.
5.Chaudry. et al. Evidence for enhanced uptake of ATP by liver and kidney in hemorrhagic shock, Am J Physiol 1977; 233:83.
, http://www.100md.com
6.Hirasawa H.et al. Effect of ATP-MgCl2or ATP-Na2 administration on renal function and renal cellular metabolism following real ischimia. Ciro Shock 1983; 10:271.
7.平泽博之，他.虚血性急性器不全にするATP-MgCl2法.千叶医学 1984；60：71.
*国家自然科学基金资助项目；
(1989年4月1日收稿 同年10月11日修回), 百拇医药(金基焕1 安君1 李素香1 崔苍海1 尹正日2 金青松2 崔城洛2 刘鼎新3 董彦3 仪明光4)
单位：延边医学院133000，1.心胸外科；2.电镜室；3.北京医科大学细胞生物研究室；4.中国原子能科学研究院
关键词：心肌；三磷酸腺苷；镁
提要 利用放射自显影术从形态学上观察3H 提要 利用放射自显影术从形态学上观察3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常和缺血缺氧心肌组织、细胞超微结构中的分布规律。结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP缺血缺氧心肌超微结构中均有分布，但三者均以线粒体内为多，从银粒数目上看，3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP多。外源性ATP对缺血缺氧心肌细胞有保护作用，而且外源性ATP对缺血缺氧心肌细胞的作用基点可能在线粒体上。
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近年来已研究证明ATP-MgCl2对实验性心肌缺血和心脏外科的心肌保护上有十分明显的效果[1，2]，但其机制尚不清楚。本研究目的旨在观察3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常(非缺血)和缺血缺氧动物心肌组织内的分布，以期为探讨外源ATP-MgCl2、ATP-Mg2+性等能量制剂对心肌保护作用机理的研究提供形态学基础。
材料和方法
一、材料
1.实验动物：昆明种小鼠.体重25～27g，雌雄兼用，由北京医科大学动物室提供。
2.药品：ATP-MgCl2、ATP-Mg2+和ATP由日本千叶大学提供，中国原子能科学研究院同位素研究所标记。
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二、方法
将54只健康小鼠随机分为3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP组进而分为缺血缺氧和对照组。
1.缺血缺氧小鼠模型的制备：采用小鼠眼底后静脉放血法，放血量为全血量的30%，放血后90分钟用于实验。
2.缺血缺氧小鼠心肌模型鉴定：将正常小鼠心肌和缺血缺氧小鼠心肌行冰冻切片(6μm)，贴于盖片，稍干后即分别加入作用液(LDH和SDH作用液)[3]，封片后用光镜观察结果。
3.示踪剂剂量和注射途径：3H-ATP-MgCl2放射性为1.0mCi/m，3H-ATP-Mg2+为1.15mCi/mg，3H-ATP为1.05mCi/mg。三者的放射化学纯度均大于95%。用ATP-MgCl2溶解液稀释后使用。注入剂量每克体重为5μCi，采用尾静脉注射。
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4.取材时间，注射示踪剂后分别于3、6、10、20分钟取材。
5.光镜标本和自显影标本的制备：注射示踪剂后，按上述时间开胸取出心脏速冻，而后转入恒冷箱切片机内，将其切成6.0～8.0μm厚的冰冻节片(左心室壁)，将冰冻片裱贴在载玻片上，再转入-40°C低温冰箱内冷冻干燥。
在暗室安全灯下，将核-4乳胶(中国原子能科学研究院提供)按浸膜法[4]涂敷乳胶，避光条件下4°C冰箱内曝光6周而后显影，水洗，定影，水洗，HE染色封片。
将制得的自显影片在光镜下观察结果每个标本在1000倍油镜下随机观察9个视野银粒，测微尺下计数固定视野5×5小方格(9.9×9.9μm2)内的银粒总和减去本底银粒即为一个视野的银粒数。
6.电镜自显影：雄性小鼠6只(Bal B/C种)体重19～25G，随机分成3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP组。示踪剂注射剂量每克体重为40μCi，注射后1、3、6分钟取材(左心室壁)，按电镜样品制备常规进行固定、脱水、包埋，超薄切片(500A)，放在覆有Formvar膜的铜网上。在暗室安全灯下，按金属环法[4]涂敷HW-4核乳胶(中国原子能科学研究所提供)，避光条件下-20°C低温冰箱内曝光14个月后，经显影、水洗、停显影、水洗、定影，最后醋酸铀及柠檬铅染色。
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将制得的电镜自显影片用电镜观察。用双盲法选取视野，观察、照像时的放大倍率恒定，每一标本随机拍5张照片进行阅读分析。
结 果
1.缺血缺氧鼠组：放血30%(全血量的30%)，经90分钟，缺血缺氧鼠心模型心肌组织中乳酸脱氢酶(LDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)颗粒较正常对照组明显减少。
2.3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP自显影银粒在正常和缺血缺氧鼠心肌组织中均有分布。
3.在正常心肌组织中，注射示踪剂后6分钟，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+组的银粒计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)；其余3、10、20分钟三者无差异(P>0.05，表1)。
, 百拇医药
表1 正常心肌组织中银粒计数比较(9.9×9.9μm2)
分组
鼠数
注射后至取材时间(分钟)
3
6
10
20
AMC
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58±8
85±9*
, 百拇医药
68±8
38±6
AM
18
53±7
78±9*
54±7
25±5
A
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47±6
37±6
52±7
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27±5
* 与A组相比较P<0.01；AMC：3H-ATP-MgCl2组，AM：3H-ATP-Mg2+组，A：3H-ATP组
4.在缺血缺氧鼠心肌组织中,3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+组的银粒计数在3、6、10、20分钟均显著多于3H-ATP组(P<0.01，表2)
表2 缺血缺氧心肌组织中银粒计数比较(9.9×9.9μm2)
分组
鼠数
, 百拇医药
注射后至取材时间(分钟)
3
6
10
20
AMC
20
98±10*
177±13*
117±11*
69±8*
AM
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18
88±9*
154±12*
97±10*
55±7*
A
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64±8
47±7
68±8
29±5
*与A组相应时间比较P<0.01；AMC：3H-ATP-MgCl2组，AM3H-ATP-Mg2+组，A：3H-ATP组
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5.3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP自显影银粒在缺血缺氧鼠心肌细胞各种超微结构中均有分布。但三者均以线粒体内为多(图1～3)；从银粒计数上看3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP为多。
图1 注射3H-ATP-MgCl2后1分钟银粒分布，以线粒体内为多×15000
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图2 注射3H-ATP-Mg2+后1分钟银粒分布，以线粒体内为多×15000
图3 注射3H-ATP后1分钟银粒数目较少，但也大多分布在线粒体上×15000
讨 论
本文采用小鼠眼底后静脉放血法，造成小鼠心肌缺血缺氧并监测其心肌组织内LDH和SDH作为判断心肌缺氧的指标。结果表明缺血缺氧时心肌组织内LDH和SDH活性较正常明显降低。
过去认为外源性ATP难以通过细胞膜，后来Chaudry等[5]报告，外源性ATP以ATP-MgCl2形式静脉注射，可以通过细胞膜尤其是缺血缺氧的细胞膜。而且ATP-MgCl2能够显著地提高因缺氧所致ATP下降的细胞内ATP水平的回升[6]，且这种作用并非ADP-MgCl2或MgCl2所致。ATP-MgCl2对缺血缺氧组织的有效性并不是ATP和MgCl2血管扩张的结果[7]。Chaudry等[5]用14C-ATP、14C-ADP、14C-AMP和14C-adenosine(并加入等量MgCl2)比较了正常和出血性休克鼠肝肾组织中的ATP含量，结果表明，只有14C-ATP加MgCl2进入了肝肾组织细胞内，而且出血性休克鼠肝肾组织细胞内的ATP含量较正常对照组大2.5倍，而14C-ADP、14C-AMP、14C-adenosine在正常和出血性休克鼠肝肾组织细胞中的含量是相同的。本研究结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在正常和缺血缺氧鼠心肌组织中均有分布。说明外源性ATP可进入正常和缺血缺氧的心肌组织中。在正常心肌组织中注入示踪剂后6分钟3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+组的银粒计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)，其余3、10、20分钟无差异(P>0.05)；在缺血缺氧心肌组织中3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+的银粒数计数显著多于3H-ATP组(P<0.01)。
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电镜自显影结果表明，3H-ATP-MgCl2、3H-ATP-Mg2+和3H-ATP在缺血缺氧心肌各种超微结构中均有分布。但三者均以线粒体内为多；从银粒计数来看，3H-ATP-MgCl2和3H-ATP-Mg2+较3H-ATP为多。Sotonyi等研究证明在线粒体膜及嵴内腔内均有3H-ATP所致自显影银粒。
综上所述，我们认为外源性ATPATP-MgCl2或ATP-Mg2+这种能量制剂形式投给时，将有较多的ATP进入心肌细胞内尤其是缺血缺氧的心肌细胞内，其作用基点可能在线粒体上。因此ATP-MgCl2或ATP-Mg2+这种能量制剂对缺血缺氧心肌细胞有保护作用，且这种保护作用可能是通过改善和恢复线粒体的功能来实现。
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参考文献
1.北川素. 虚血筋にするATP-MgCl2の效果.千叶医学 1985；61：199.
2.金基焕，等. ATP-氯化镁冷停搏液的研究. 中华麻醉学杂志 1986；6：261.
3.陈啸梅，等.组织化学手册. 北京：人民卫生出版社，1986：224-235.
4.刘鼎新，编著. 放射自显影技术. 北京：科学技术出版社，1986；92-131.
5.Chaudry. et al. Evidence for enhanced uptake of ATP by liver and kidney in hemorrhagic shock, Am J Physiol 1977; 233:83.
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6.Hirasawa H.et al. Effect of ATP-MgCl2or ATP-Na2 administration on renal function and renal cellular metabolism following real ischimia. Ciro Shock 1983; 10:271.
7.平泽博之，他.虚血性急性器不全にするATP-MgCl2法.千叶医学 1984；60：71.
*国家自然科学基金资助项目；
(1989年4月1日收稿 同年10月11日修回), 百拇医药(金基焕1 安君1 李素香1 崔苍海1 尹正日2 金青松2 崔城洛2 刘鼎新3 董彦3 仪明光4)