hGM-CSF受体β亚单位胞浆域在配体胞吞过程中的作用*
作者：张日 朱子玲 冯一中 苏成海
单位：张日 朱子玲 苏成海(苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所，苏州，215006)；冯一中(苏州医学院病理解剖学教研室)
关键词：人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体；β亚单位胞浆域；胞吞；激酶抑制剂
苏州医学院学报991207 摘要 目的 探索人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(hGM-R)β亚单位胞浆域在配体诱导的胞吞过程中的作用。方法 通过PCR扩增技术，构建β亚单位胞浆域缺失突变子(1441、1582、1726、2354和Sma)，然后将野生型或突变型β亚单位和GM-Rα亚单位cDNA共转染入COS-7细胞，并对转染细胞的配体胞吞进行检测。结果 以低亲和力方式与配体结合的COS-GM-Rα胞吞水平仅为结合配体的7%，而以高亲和力方式与配体结合的COS-GM-Rα/β胞吞水平则达37%，为前者的5倍，这种胞吞现象可被丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂H-7和星形孢菌素抑制，但不被酪氨酸激酶抑制剂木黄酮和制表菌所抑制；从β亚单位胞浆域结构与胞吞关系可见，C末端122个氨基酸缺失可使胞吞受抑，而该122个氨基酸上游的300个氨基酸区域缺失则可使胞吞水平显著提高。结论 有效的胞吞需要高亲和结合力的功能受体存在，且胞吞过程不涉及酪氨酸激酶磷酸化；而β亚单位胞浆域对胞吞有正性或负性调节作用，提示这些区域含有调节胞吞过程的序列。
, 百拇医药
中图法分类 R392-33
Role of the Cytoplasmic Domain of β Subunit of the Human Granulo cyte-
Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor in Ligand Endocytosis
Zhang Ri,Zhu Ziling,Feng Yizhong,et al
(Jiangsu Institute of Hematology,The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract Objective To explore the role of the cytoplasmic regi o n of β subunit of the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (hGM-R) in ligand-induced endocytosis.Methods Cytoplasm ic deletion mutants (1441,1582,1726,2354 and Sma) of β subunit were generated b y PCR amplification technique.COS-7 cells were transiently cotransfected with GM -R α subunit and either wild-type or mutant β subunit cDNA and GM-R mediated -endocytosis of the transfected cells was then examined.Results The COS-GM-R α bound its ligand with low affinity and internalized only 7% of t he total bound counts while COS-GM-R α/β bound its ligand with high affinity a nd internalized 37% of the bound ligand which was 5 times of that of GM-Rα.Effi cient endocytosis was inhibited by serine or threonine kinase inhibitors H-7 and staurosporine,but not by tyrosine kinase inhibitors genistein and erbstatin.Del etion of C-terminal 122 amino acids of β subunit reduced ligand-induced endoc ytosis whereas deletion of 300 amino acids proximal to these 122 amino acids con sistently increased ligand endocytosis.Conclusion High affinity b inding is required for efficient endocytosis which is not affected by the tyrosi ne kinase phosphorylation.The cytoplasmic region of β subunit has a positive or negative effect on ligand endocytosis.This suggests that these regions contain sequences which regulate endocytosis.
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Key words human granulocyte-macrophage colony-stimulat ing factor receptor; cytoplasmic region of β subunit; endocytosis; kinase inhib itors
人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colon y-st imulating factor,hGM-CSF)是一种主要由巨噬细胞和T淋巴细胞产生的分子量为18～24kd的糖蛋白，它能刺激粒系造血祖细胞的增殖与分化，并增强成熟粒细胞的功能。目前已知，hGM-CSF的生物学作用是通过定位于细胞膜上的特异性受体(hGM-R)而介导。完整的GM-R由α和β两个亚单位组成。α亚单位能与配体以低亲和力方式特异性结合，β亚单位尽管自身不能结合配体，但可与GM-Rα共同组成能与配体高亲和结合的功能受体分子，同时担负信号传导功能。此外，β亚单位也是白细胞介素-3(IL-3)和白细胞介素-5(IL-5)受体的共同成员(βc)，因而GM-R也可被IL-3和IL-5交叉竞争结合[1～3]。虽然hGM-R与信号传导之间关系的研究已有诸多报道，但对βc胞浆域结构在配体与受体结合后介导的胞吞(endocytosis)过程中的作用至今仍不清楚。为此，我们构建了βc亚单位胞浆突变子，探讨了βc胞浆域在配体胞吞过程中的作用。
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1 材料与方法
1.1 试剂和细胞培养：表达载体pMX和pREP9及激酶抑制剂分别购于Invitrogen和Boehringer公司， 125I-GM-CSF购于NEN公司；非洲绿猴肾细胞COS-7生长于含10%胎牛血清(FCS)IMDM培养基中。
1.2 突变子构建：利用KH97质粒，经PCR扩增构建了βc胞浆缺失突变子(1441，1582，1726和2354)。所用PCR引物如下(每一反义引物均含3′端终止码)：
有义链：AAGCTTGAGCTGACCAGGGAGAT
反义链：1441：TCAGCGCAGCCTGTACCCGT
1582：TCAGAAGCGGCTGCCCCACG
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1726：TCAGGGCTGCTCTGTGGGTA
2354:TCACCGGCCCTCAATTGGA
Sma突变子则通过常规分子克隆技术，在SmaI位点进行消化切割产生。所有构建的突变子核苷酸序列均被检测以保证其正确，然后将其分别插入pMX载体中；野生型GM-RαDNA则被插入pREP9载体中。
1.3 转染：利用磷酸钙法将相应的质粒导入COS细胞，即在直径100mm培养皿中，每皿种入1×106细胞，1天后，每皿加入1ml磷酸钙/DNA沉淀物(内含GM-Rα和野生型或突变型βcDNA各10μg)，37℃培养18～24h后，洗涤细胞并加入新鲜培养液继续培养48h，然后收集细胞进行结合检测。
1.4 同位素配体结合检测：同位素标记GM-CSF结合检测按DiPersio法[2]进行，即取2×106细胞悬浮于50μl结合缓冲液(IMDM+50mmol/LHEPES+0.1%BSA)中，混匀后分2管，与含特异性放射性活性为(1～5)×1018dpm/mole的125I-GM-CSF室温下孵育90min。为了获得特异性结合，其中一管加入比标记配体浓度高100倍的未标记GM-CSF。孵育结束加入含20%FCS的结合缓冲液中止反应，离心后在γ计数仪上测定细胞放射性活性。
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1.5 受体胞吞检测：按Perelaux法[3]进行，即取5×106瞬时转染细胞与125I-GM-CSF在冰上孵育90min，继用冰冷的结合缓冲液洗细胞2遍后，重新悬浮细胞于10%FCS的IMDM中，37℃培养。在培养的0、5、10、30和60min时，各取1×106细胞与1ml酸性缓冲液(由0.1mol/L甘氨酸和0.15mol/LNaCl[pH=3.0]组成)在冰上处理5min，然后将细胞通过由dibutyl phthalate和色拉油按20∶3比例组成的油层离心，在γ计数仪上分别测定细胞上清与沉淀部分的放射性活性。为了观察激酶抑制剂对胞吞的影响，实验前先将表达GM-Rα/β的细胞在冰上与激酶抑制物预培养2h(所用的激酶抑制物及浓度如下：100μmol/L木黄酮，10μmol/L制表菌素，10μmol/LH-7和1.0μmol/L星形孢菌素)，然后进行上述实验。
2 结果
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2.1 βc胞浆缺失突变子结构：按照核苷酸数目设计构建胞浆突变子。1441突变子仅保留胞浆域近膜端的6个氨基酸；1582突变子含有包括box1在内的近膜区域，但缺少box2序列及其余的胞浆域；1726突变子含box1和box2结构，但缺少box2结构下游的胞浆域；2354突变子含对βc功能有关键影响的box1、box2、酪氨酸577和酪氨酸750结构，但缺少C末端122个氨基酸；Sma突变子除缺少C末端55个氨基酸外，其余结构和野生型βc相同。
2.2 配体胞吞需要βc的存在：胞吞水平依据37℃时不同时间内沉淀细胞的总cpm百分比增加值来测算和定量。我们检测了表达GM-Rα及GM-Rα/β的COS细胞胞吞125I-GM-CSF的能力，发现呈低亲和结合的COS-GM-Rα细胞仅胞吞总结合参数的7%，而与配体有高亲和结合力的COS-GM-Rα/β细胞则可胞吞总结合参数的37%，为前者的5倍(见图1)，这提示高亲和结合力为高效胞吞所必需。
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图1 有效的配体胞吞需要高亲和力
的功能受体存在
2.3 βc胞浆突变子对配体胞吞具有独特的影响：共表达GM-Rα和野生型或突变型βc的COS细胞胞吞结果见图2。当野生型GM-Rα存在时，所有βc胞浆缺失突变子均能与之共同组成高亲和结合力的受体分子。缺失胞浆远膜区域的2354和Sma突变子，其胞吞水平与仅表达GM-Rα时近似(9%)，βcC末端122个氨基酸上游的300个氨基酸(以1582和1726为代表)，则反见胞吞水平升高至48%，提示该300个氨基酸区域对胞吞有负调作用，去除该区域可增强胞吞作用；仅保留胞浆近膜端6个氨基酸的1441突变子，对胞吞的影响与野生型βc相同(36%)，提示有效胞吞不需βc胞浆域。
图2 βc胞浆域对配体胞吞有正性和负性调节作用
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2.4 酪氨酸磷酸化与配体胞吞无关：实验结果表明，酪氨酸激酶抑制剂木黄酮与制表菌素并不影响GM-CSF诱导的胞吞，提示酪氨酸磷酸化与配体胞吞过程无关；而在丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂中，H-7仅中等度(33%)抑制胞吞，星型孢菌素则可抑制配体胞吞的65%，提示丝氨酸或苏氨酸磷酸化可涉及GM-CSF诱导的胞吞(见图3)。
图3 激酶抑制剂对配体胞吞的影响
3 讨论
在GM-CSF刺激后，存在于靶细胞膜上的受体GM-R可被活化，形成的配体-受体复合物一方面通过信号传导途径，将刺激信号下传细胞核，从而诱发各种细胞生物学行为；另一方面，完成受体后信号传导的配体-受体复合物可被网格蛋白构成的陷窝内吞，并运送至溶酶体而降解，从而引起受体下调，这一过程即称为配体介导的胞吞，这是细胞摄取与转运激素、糖蛋白和脂类物质的重要方式。通过该机制，可使细胞对配体重复刺激产生耐受，直至细胞重新合成新结合蛋白并在细胞表面表达为止。尽管目前对GM-CSF诱导的受体胞吞所知甚少，但巨噬集落刺激因子受体的研究证明，受体的近膜胞浆域对胞吞十分重要[4]。Ronco等[5]也报道，GM-Rα亚单位胞浆域突变并不影响GM-R介导的胞吞；另一方面，一些研究发现，βc胞浆域结构在GM-CSF介导的信号传导过程中具有决定性作用，缺失胞浆域box1(氨基酸456～487)、box2(氨基酸517～542)，酪氨酸577和酪氨酸750可分别阻断GM-CSF受体介导的增殖反应、Jak家族(Jak2)、Shc及βc酪氨酸激酶磷酸化[6]。我们推断βc胞浆域结构中某些保守序列也许在胞吞过程中起关键作用。
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我们的结果证明，配体胞吞需要βc亚单位的存在。因为单独α亚单位并不足以导致有效的胞吞，而由α与β亚单位共同构成的高亲和力结合受体分子则可使胞吞水平至少提高5倍，这与IL-2受体复合物(IL-2R)较类似，即仅在由β和γ亚单位共同组成的中和高亲和力受体分子才被有效胞吞[7]。如前所述，仅保留胞浆近膜端6个氨基酸的1441突变子，能产生与野生型βc一样的胞吞水平，说明只有高亲和结合力受体才能产生高水平的胞吞，而βc胞浆域并非为高效的胞吞所绝对必需。Hatakeyama等[8]发现，IL-2Rβ胞浆域并非为胞吞所必需，这也支持我们的结果。纵然胞吞过程并非需要βc的胞浆域，但当其存在时，则对配体胞吞具有正性或负性影响，缺失C末端122个氨基酸可阻断βc介导的配体胞吞，而缺失邻近该122个氨基酸上游的300个氨基酸区域并包括该122个氨基酸则反可使胞吞水平增高。对此似乎矛盾现象的解释是，可能βc胞浆域某些结构特征如大小、次级结构或三维折叠对胞吞效率有一定影响；然而，对受体代谢中βc亚单位在胞吞中的确切作用，尚需进行更多的研究。
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我们的实验还显示，蛋白质酪氨酸磷酸化与配体胞吞无关，因为酪氨酸激酶抑制剂不能改变其胞吞水平，与此相类似的是，Okuda等[9]发现，酪氨酸激酶的活化并不支持GM-CSF诱导的胞吞；另一方面，有人证明特异性丝氨酸残基(S664)磷酸化对于多聚免疫球蛋白受体胞吞是必需的[10]。我们观察到，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂H-7和星形孢菌素可抑制GM-CSF诱导的受体胞吞，因而推测丝氨酸或苏氨酸磷酸化可能影响配体胞吞过程[11]。
*国家自然科学基金(No.39670277)和国家教委留学回国队员科研启动基金(1997-932)资助课题
参考文献
1 Mire-Sluis A,et al.Evidence for a signalingrole for the α ch ains of grnaulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)，interleukin -3 (IL-3)，and IL-5 receptor∶divergent signaling pathways betewwn GM-CSF/IL-3 a nd IL-5.Blood,1995,86∶2679
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2 DiPersio JF,et al.Characterization of human grnaulocyte-macrophage co lon-stimulating factor receptor.J Biol Chem,1988,263∶1834
3 Perelaux A,et al.Binding,internalization and degradation of radiolidin ated interleukin 3 and grnaulocyte-macrophage colony stimulating factor by vari ous hemopoietic cells.Biochim Biophys Acta,1990,1055∶141.
4 Myles GM,et al.Tyrosine 569 in the c-Fms juxtamembrane domain is esse ntial for kinase activity and macrophage colony-stimulating factor-dependent i nternalization.Mol Cell Biol,1994,14∶4843
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5 Ronco LV,et al.Identification of conserved amino acids in the human gr anulocytemacrophage colony-stimulating factor receptor alpha subunit critical f or function.evidence for formation of a heterodimeric receptor comples prior to ligand binding.J Biol Chem,1994,269∶277
6 Bagley CJ,et al.The structural and functional basis of cytokine recept or activation∶lessons from the common β subunit of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,interleukin-3 (IL-3),and IL-5 receptors.Blood,1997, 89∶1471
, 百拇医药
7 Weissman AM,et al.Only high affinity receptors for interleukin 2 media te internalization of ligand.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83∶1463
8 Hatakeyama M,et a.A restricted cytoplasmic region of IL-2 receptor β chain is essential for growth signal transduction but not for ligand binding and internalization.Cell,1989,59∶837
9Okuda K,et al.Internalization of the granulocyte-macrophage c olony-s timulating factor receptor is not required for induction of protein tyrosine pho sphorylation in human myeloid cells.Blood,1991,78∶1928
, 百拇医药
10Hirt RP,et al.Transcytosis of the polymeric Ig receptor requires phos phorylation of serine 664 in the absence but not the presence of dimeric IgA.Cel l,1993,74∶245
11Khwaja A,et al.Isoquinolinesulfonaide protein kinase inhibitors H-7 and H-8 enhance the effects of grnaulocyte-macrophage colony-stimulating fact or (GM-CSF) on neutrophil function and inhibit GM-CSF receptor internalization.B lood,1990,76∶996
(1999年7月12日收稿), 百拇医药
单位：张日 朱子玲 苏成海(苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所，苏州，215006)；冯一中(苏州医学院病理解剖学教研室)
关键词：人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体；β亚单位胞浆域；胞吞；激酶抑制剂
苏州医学院学报991207 摘要 目的 探索人粒-巨噬细胞集落刺激因子受体(hGM-R)β亚单位胞浆域在配体诱导的胞吞过程中的作用。方法 通过PCR扩增技术，构建β亚单位胞浆域缺失突变子(1441、1582、1726、2354和Sma)，然后将野生型或突变型β亚单位和GM-Rα亚单位cDNA共转染入COS-7细胞，并对转染细胞的配体胞吞进行检测。结果 以低亲和力方式与配体结合的COS-GM-Rα胞吞水平仅为结合配体的7%，而以高亲和力方式与配体结合的COS-GM-Rα/β胞吞水平则达37%，为前者的5倍，这种胞吞现象可被丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂H-7和星形孢菌素抑制，但不被酪氨酸激酶抑制剂木黄酮和制表菌所抑制；从β亚单位胞浆域结构与胞吞关系可见，C末端122个氨基酸缺失可使胞吞受抑，而该122个氨基酸上游的300个氨基酸区域缺失则可使胞吞水平显著提高。结论 有效的胞吞需要高亲和结合力的功能受体存在，且胞吞过程不涉及酪氨酸激酶磷酸化；而β亚单位胞浆域对胞吞有正性或负性调节作用，提示这些区域含有调节胞吞过程的序列。
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中图法分类 R392-33
Role of the Cytoplasmic Domain of β Subunit of the Human Granulo cyte-
Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor in Ligand Endocytosis
Zhang Ri,Zhu Ziling,Feng Yizhong,et al
(Jiangsu Institute of Hematology,The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,215006)
Abstract Objective To explore the role of the cytoplasmic regi o n of β subunit of the human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (hGM-R) in ligand-induced endocytosis.Methods Cytoplasm ic deletion mutants (1441,1582,1726,2354 and Sma) of β subunit were generated b y PCR amplification technique.COS-7 cells were transiently cotransfected with GM -R α subunit and either wild-type or mutant β subunit cDNA and GM-R mediated -endocytosis of the transfected cells was then examined.Results The COS-GM-R α bound its ligand with low affinity and internalized only 7% of t he total bound counts while COS-GM-R α/β bound its ligand with high affinity a nd internalized 37% of the bound ligand which was 5 times of that of GM-Rα.Effi cient endocytosis was inhibited by serine or threonine kinase inhibitors H-7 and staurosporine,but not by tyrosine kinase inhibitors genistein and erbstatin.Del etion of C-terminal 122 amino acids of β subunit reduced ligand-induced endoc ytosis whereas deletion of 300 amino acids proximal to these 122 amino acids con sistently increased ligand endocytosis.Conclusion High affinity b inding is required for efficient endocytosis which is not affected by the tyrosi ne kinase phosphorylation.The cytoplasmic region of β subunit has a positive or negative effect on ligand endocytosis.This suggests that these regions contain sequences which regulate endocytosis.
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Key words human granulocyte-macrophage colony-stimulat ing factor receptor; cytoplasmic region of β subunit; endocytosis; kinase inhib itors
人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colon y-st imulating factor,hGM-CSF)是一种主要由巨噬细胞和T淋巴细胞产生的分子量为18～24kd的糖蛋白，它能刺激粒系造血祖细胞的增殖与分化，并增强成熟粒细胞的功能。目前已知，hGM-CSF的生物学作用是通过定位于细胞膜上的特异性受体(hGM-R)而介导。完整的GM-R由α和β两个亚单位组成。α亚单位能与配体以低亲和力方式特异性结合，β亚单位尽管自身不能结合配体，但可与GM-Rα共同组成能与配体高亲和结合的功能受体分子，同时担负信号传导功能。此外，β亚单位也是白细胞介素-3(IL-3)和白细胞介素-5(IL-5)受体的共同成员(βc)，因而GM-R也可被IL-3和IL-5交叉竞争结合[1～3]。虽然hGM-R与信号传导之间关系的研究已有诸多报道，但对βc胞浆域结构在配体与受体结合后介导的胞吞(endocytosis)过程中的作用至今仍不清楚。为此，我们构建了βc亚单位胞浆突变子，探讨了βc胞浆域在配体胞吞过程中的作用。
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1 材料与方法
1.1 试剂和细胞培养：表达载体pMX和pREP9及激酶抑制剂分别购于Invitrogen和Boehringer公司， 125I-GM-CSF购于NEN公司；非洲绿猴肾细胞COS-7生长于含10%胎牛血清(FCS)IMDM培养基中。
1.2 突变子构建：利用KH97质粒，经PCR扩增构建了βc胞浆缺失突变子(1441，1582，1726和2354)。所用PCR引物如下(每一反义引物均含3′端终止码)：
有义链：AAGCTTGAGCTGACCAGGGAGAT
反义链：1441：TCAGCGCAGCCTGTACCCGT
1582：TCAGAAGCGGCTGCCCCACG
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1726：TCAGGGCTGCTCTGTGGGTA
2354:TCACCGGCCCTCAATTGGA
Sma突变子则通过常规分子克隆技术，在SmaI位点进行消化切割产生。所有构建的突变子核苷酸序列均被检测以保证其正确，然后将其分别插入pMX载体中；野生型GM-RαDNA则被插入pREP9载体中。
1.3 转染：利用磷酸钙法将相应的质粒导入COS细胞，即在直径100mm培养皿中，每皿种入1×106细胞，1天后，每皿加入1ml磷酸钙/DNA沉淀物(内含GM-Rα和野生型或突变型βcDNA各10μg)，37℃培养18～24h后，洗涤细胞并加入新鲜培养液继续培养48h，然后收集细胞进行结合检测。
1.4 同位素配体结合检测：同位素标记GM-CSF结合检测按DiPersio法[2]进行，即取2×106细胞悬浮于50μl结合缓冲液(IMDM+50mmol/LHEPES+0.1%BSA)中，混匀后分2管，与含特异性放射性活性为(1～5)×1018dpm/mole的125I-GM-CSF室温下孵育90min。为了获得特异性结合，其中一管加入比标记配体浓度高100倍的未标记GM-CSF。孵育结束加入含20%FCS的结合缓冲液中止反应，离心后在γ计数仪上测定细胞放射性活性。
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1.5 受体胞吞检测：按Perelaux法[3]进行，即取5×106瞬时转染细胞与125I-GM-CSF在冰上孵育90min，继用冰冷的结合缓冲液洗细胞2遍后，重新悬浮细胞于10%FCS的IMDM中，37℃培养。在培养的0、5、10、30和60min时，各取1×106细胞与1ml酸性缓冲液(由0.1mol/L甘氨酸和0.15mol/LNaCl[pH=3.0]组成)在冰上处理5min，然后将细胞通过由dibutyl phthalate和色拉油按20∶3比例组成的油层离心，在γ计数仪上分别测定细胞上清与沉淀部分的放射性活性。为了观察激酶抑制剂对胞吞的影响，实验前先将表达GM-Rα/β的细胞在冰上与激酶抑制物预培养2h(所用的激酶抑制物及浓度如下：100μmol/L木黄酮，10μmol/L制表菌素，10μmol/LH-7和1.0μmol/L星形孢菌素)，然后进行上述实验。
2 结果
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2.1 βc胞浆缺失突变子结构：按照核苷酸数目设计构建胞浆突变子。1441突变子仅保留胞浆域近膜端的6个氨基酸；1582突变子含有包括box1在内的近膜区域，但缺少box2序列及其余的胞浆域；1726突变子含box1和box2结构，但缺少box2结构下游的胞浆域；2354突变子含对βc功能有关键影响的box1、box2、酪氨酸577和酪氨酸750结构，但缺少C末端122个氨基酸；Sma突变子除缺少C末端55个氨基酸外，其余结构和野生型βc相同。
2.2 配体胞吞需要βc的存在：胞吞水平依据37℃时不同时间内沉淀细胞的总cpm百分比增加值来测算和定量。我们检测了表达GM-Rα及GM-Rα/β的COS细胞胞吞125I-GM-CSF的能力，发现呈低亲和结合的COS-GM-Rα细胞仅胞吞总结合参数的7%，而与配体有高亲和结合力的COS-GM-Rα/β细胞则可胞吞总结合参数的37%，为前者的5倍(见图1)，这提示高亲和结合力为高效胞吞所必需。
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图1 有效的配体胞吞需要高亲和力
的功能受体存在
2.3 βc胞浆突变子对配体胞吞具有独特的影响：共表达GM-Rα和野生型或突变型βc的COS细胞胞吞结果见图2。当野生型GM-Rα存在时，所有βc胞浆缺失突变子均能与之共同组成高亲和结合力的受体分子。缺失胞浆远膜区域的2354和Sma突变子，其胞吞水平与仅表达GM-Rα时近似(9%)，βcC末端122个氨基酸上游的300个氨基酸(以1582和1726为代表)，则反见胞吞水平升高至48%，提示该300个氨基酸区域对胞吞有负调作用，去除该区域可增强胞吞作用；仅保留胞浆近膜端6个氨基酸的1441突变子，对胞吞的影响与野生型βc相同(36%)，提示有效胞吞不需βc胞浆域。
图2 βc胞浆域对配体胞吞有正性和负性调节作用
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2.4 酪氨酸磷酸化与配体胞吞无关：实验结果表明，酪氨酸激酶抑制剂木黄酮与制表菌素并不影响GM-CSF诱导的胞吞，提示酪氨酸磷酸化与配体胞吞过程无关；而在丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂中，H-7仅中等度(33%)抑制胞吞，星型孢菌素则可抑制配体胞吞的65%，提示丝氨酸或苏氨酸磷酸化可涉及GM-CSF诱导的胞吞(见图3)。
图3 激酶抑制剂对配体胞吞的影响
3 讨论
在GM-CSF刺激后，存在于靶细胞膜上的受体GM-R可被活化，形成的配体-受体复合物一方面通过信号传导途径，将刺激信号下传细胞核，从而诱发各种细胞生物学行为；另一方面，完成受体后信号传导的配体-受体复合物可被网格蛋白构成的陷窝内吞，并运送至溶酶体而降解，从而引起受体下调，这一过程即称为配体介导的胞吞，这是细胞摄取与转运激素、糖蛋白和脂类物质的重要方式。通过该机制，可使细胞对配体重复刺激产生耐受，直至细胞重新合成新结合蛋白并在细胞表面表达为止。尽管目前对GM-CSF诱导的受体胞吞所知甚少，但巨噬集落刺激因子受体的研究证明，受体的近膜胞浆域对胞吞十分重要[4]。Ronco等[5]也报道，GM-Rα亚单位胞浆域突变并不影响GM-R介导的胞吞；另一方面，一些研究发现，βc胞浆域结构在GM-CSF介导的信号传导过程中具有决定性作用，缺失胞浆域box1(氨基酸456～487)、box2(氨基酸517～542)，酪氨酸577和酪氨酸750可分别阻断GM-CSF受体介导的增殖反应、Jak家族(Jak2)、Shc及βc酪氨酸激酶磷酸化[6]。我们推断βc胞浆域结构中某些保守序列也许在胞吞过程中起关键作用。
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我们的结果证明，配体胞吞需要βc亚单位的存在。因为单独α亚单位并不足以导致有效的胞吞，而由α与β亚单位共同构成的高亲和力结合受体分子则可使胞吞水平至少提高5倍，这与IL-2受体复合物(IL-2R)较类似，即仅在由β和γ亚单位共同组成的中和高亲和力受体分子才被有效胞吞[7]。如前所述，仅保留胞浆近膜端6个氨基酸的1441突变子，能产生与野生型βc一样的胞吞水平，说明只有高亲和结合力受体才能产生高水平的胞吞，而βc胞浆域并非为高效的胞吞所绝对必需。Hatakeyama等[8]发现，IL-2Rβ胞浆域并非为胞吞所必需，这也支持我们的结果。纵然胞吞过程并非需要βc的胞浆域，但当其存在时，则对配体胞吞具有正性或负性影响，缺失C末端122个氨基酸可阻断βc介导的配体胞吞，而缺失邻近该122个氨基酸上游的300个氨基酸区域并包括该122个氨基酸则反可使胞吞水平增高。对此似乎矛盾现象的解释是，可能βc胞浆域某些结构特征如大小、次级结构或三维折叠对胞吞效率有一定影响；然而，对受体代谢中βc亚单位在胞吞中的确切作用，尚需进行更多的研究。
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我们的实验还显示，蛋白质酪氨酸磷酸化与配体胞吞无关，因为酪氨酸激酶抑制剂不能改变其胞吞水平，与此相类似的是，Okuda等[9]发现，酪氨酸激酶的活化并不支持GM-CSF诱导的胞吞；另一方面，有人证明特异性丝氨酸残基(S664)磷酸化对于多聚免疫球蛋白受体胞吞是必需的[10]。我们观察到，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂H-7和星形孢菌素可抑制GM-CSF诱导的受体胞吞，因而推测丝氨酸或苏氨酸磷酸化可能影响配体胞吞过程[11]。
*国家自然科学基金(No.39670277)和国家教委留学回国队员科研启动基金(1997-932)资助课题
参考文献
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2 DiPersio JF,et al.Characterization of human grnaulocyte-macrophage co lon-stimulating factor receptor.J Biol Chem,1988,263∶1834
3 Perelaux A,et al.Binding,internalization and degradation of radiolidin ated interleukin 3 and grnaulocyte-macrophage colony stimulating factor by vari ous hemopoietic cells.Biochim Biophys Acta,1990,1055∶141.
4 Myles GM,et al.Tyrosine 569 in the c-Fms juxtamembrane domain is esse ntial for kinase activity and macrophage colony-stimulating factor-dependent i nternalization.Mol Cell Biol,1994,14∶4843
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5 Ronco LV,et al.Identification of conserved amino acids in the human gr anulocytemacrophage colony-stimulating factor receptor alpha subunit critical f or function.evidence for formation of a heterodimeric receptor comples prior to ligand binding.J Biol Chem,1994,269∶277
6 Bagley CJ,et al.The structural and functional basis of cytokine recept or activation∶lessons from the common β subunit of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,interleukin-3 (IL-3),and IL-5 receptors.Blood,1997, 89∶1471
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7 Weissman AM,et al.Only high affinity receptors for interleukin 2 media te internalization of ligand.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83∶1463
8 Hatakeyama M,et a.A restricted cytoplasmic region of IL-2 receptor β chain is essential for growth signal transduction but not for ligand binding and internalization.Cell,1989,59∶837
9Okuda K,et al.Internalization of the granulocyte-macrophage c olony-s timulating factor receptor is not required for induction of protein tyrosine pho sphorylation in human myeloid cells.Blood,1991,78∶1928
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10Hirt RP,et al.Transcytosis of the polymeric Ig receptor requires phos phorylation of serine 664 in the absence but not the presence of dimeric IgA.Cel l,1993,74∶245
11Khwaja A,et al.Isoquinolinesulfonaide protein kinase inhibitors H-7 and H-8 enhance the effects of grnaulocyte-macrophage colony-stimulating fact or (GM-CSF) on neutrophil function and inhibit GM-CSF receptor internalization.B lood,1990,76∶996
(1999年7月12日收稿), 百拇医药