丙型肝炎病毒Simmonds基因分型法酶切分型的研究△
作者：孙南雄 范晓峰 杜绍财 张永祥
单位：孙南雄 张永祥 南京医科大学第一附属医院传染病研究室，邮政编码：210029；范晓峰 Health Science Center, School of Medicine, Saint Louis University,1402 South Grand Blvd,St Louis MO63104,US；杜绍财 北京医科大学第二临床学院肝病研究所(100034)
关键词：丙型肝炎病毒 基因分型
江苏医药990701 摘要 丙型肝炎病毒(HCV)的基因分型在临床和流行病学的研究方面有重要意义。以多聚酶链反应的方法扩增HCV的5'-非编码区第28至284区段(HCV-J株)，并以复合限制性内切酶水解的方法按Simmonds基因分型的标准，将HCV分为6型和若干亚型。结果：检测标本38份，均为1b型，与以往的检测结果类似。
, http://www.100md.com
A Study on Hepatitis C Genotype Based on Simmonds' Classification by
Using Restriction Endonuclease Method
Sun Nanxiong, et al
Research Laboratory for Infectious Diseases, the First Affiliated
Hospital, Nanjing Medical University,Nanjing
Abstract A study was described for identifying hepatitis C virus genotypes by restriction endonuclease cleavage of sequence amplified by polymerase chain reaction (PCR) from 5′-non-coding region, that the nucleotide sequence was from region 28 to 284 (HCV-J), GenBank, D10750.Using the enzymes of both HaeⅢ/RsaⅠ and of both HinfⅠ/MvaⅠ, followed by cleavage with BstUI or ScrFI, according to the showed variant genotypes above. It was possible to identify and distinguish HCV genotypes as 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a and 6a. The method was used to investigate the prevalence of those genotypes in 38 cases of HCV infection in our hospital. All of the samples showed that they were genotype 1b, which was the same as what we have reported before in 1994. The method and its key influence factors were also discussed.
, 百拇医药
Key words HCV Genotype
丙型肝炎病毒(HCV)属黄热病毒科，单股正链RNA病毒，约9400个核苷酸。根据HCV基因序列的同源性可以分为不同的型和亚型。HCV的基因分型与疾病严重性、干扰素的疗效、抗-HCV抗体检测的敏感性、疫苗的研制以及HCV流行病学的研究都有密切的关系[1，2]。
基因分型可以用型特异性引物进行选择性扩增，或用型特异性探针与PCR扩增产物杂交，或应用限制性内切酶水解扩增产物等方法进行[2，3]。
由于分型方法不同，HCV基因分型的命名一度存在混乱局面。1993年后，Simmonds等提出亲缘关系分析法得到了大多数学者的认同。Simmonds按照发现的先后将HCV分为6个型，以数字表示。每个型有若干亚型，以a，b，c等表示。这样，Simmonds把HCV分为6个型，11个亚型。该分型法还能与先前的各种分型命名法相对应，不仅协调了以前的分型命名方法，而且可以命名新的型和亚型[4，5]。
, 百拇医药
我们选取HCV5'-非编码区(5'-NCR区)(HCV-J)扩增第28至284核苷酸区段，得到257个核苷酸的片段产物。采用复合限制性内切酶酶切的方法，水解该核苷酸片段，达到了Simmonds的分型要求。按所建立的方法检测我科HCV的标本38例，获得较满意的结果。兹报告如下。
材料和方法
一、材料
1.HCV分型参考血清由美国Saint Louis大学医学院赠送，基因型分别为1a，1b，2a，2b，3a，4a和6a。参考血清存-70℃备用。
2.HCV阳性标本来自我科门诊和病房的符合病毒性肝炎临床诊断的患者。其抗-HCV抗体(Abbott IMx检测)及HCV RNA(RT-PCR法)均阳性。在所收集标本的38例患者中，男27例，女11例，平均年龄为39.5岁。标本分装后存-70℃备用。
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3.引物取自5′-NCR区。序列引自GenBank，编号D10750(HCV-J)，由中国科学院上海植物生理所合成。
外引物序列为：
Forward 1：?5′-GGCGACACTCCACCATA-?GATC-3'(position 1-21)
Reverse 1：?5′-GGTGCACGGTCTACGAGA-?CCT-3'(position 304-324)
内引物序列为：
Forward 2：?5′-CTGTGAGGAACTACTGTC-?TTC-3'(position 28-48)
Reverse 2：?5′-CCCTATCAGGCAGTACCA-?CAA-3'(position 264-284)
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4.dNTPs，Prgmega公司；AMV逆转录酶，Promega公司；RNasin，Promega公司；Taq酶，Promega公司；限制性内切酶HaeⅢ(10U/μl)，Promega公司；限制性内切酶RsaⅠ(10U/μl)，Promega公司；限制性内切酶MvaI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；限制性内切酶HinFI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；限制性内切酶BstUI(10U/μl)，Sigma公司；限制性内切酶ScrFI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；分子量标志物pBR322 DNA/HaeⅢ，华美公司；低溶点琼脂糖，Sigma公司，临用前配制成4%凝胶。
5.HYBAID基因扩增仪
6.电泳仪，PowerPac300，BIO-RAD公司，电泳槽，Sub-Cell GT-MINI，BIORAD公司；
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7.紫外透射分析仪，ZF-AI型，上海长明光学电子仪器厂。
二、方法
1.5′-NCR基因片段的扩增
基因分型血清或标本各50μl，以异硫氰酸胍提取HCV-RNA。以AMV酶逆转录为cDNA。产物进行第一轮扩增。扩增条件为94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒，共35个循环。取第一轮产物5μl，进行第二轮扩增。扩增条件同上。第二轮PCR产物经纯化后，进行酶切分型。
2.酶切分型
(1)将纯化的第二轮PCR产物各取10μl分别加第一组酶HaeⅢ 1μl，RsaI 1μl和第二组酶HinFI1μl，MvaI 1μl。37℃水浴，4～16小时。
(2)根据第一、二两组酶切结果选择进行第三组酶切反应或第四组酶切反应。第三组酶切反应为纯化的第二轮PCR产物10μl加?BstUI1μl。60℃水浴，4～16小时。第四组酶切反应为纯化的第二轮PCR产物10μl加ScrFI 1μl，37℃水浴，4～16小时。
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(3)电泳。取酶切产物各20μl，溴酚兰3μl，分子量标志物5μl，以4%低溶点琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为80～100伏特，1～1.5小时。以紫外透射仪观察结果或拍照。
结 果
一、基因分型血清的分型结果
1.HaeⅢ/RsaI酶切产物电泳结果见图1(图1～4见封二)。由图可见，1a，1b和4a型的两条核苷酸片段较为清晰，该苷酸数分别为120和114。2a和2b分别可见62，58，56和46四条带(其中56，58二条带已重叠)和114，74和46三条带。3a可见114，69，51三条带。6a可见117，62和46条带。理论上各型均应含有两条14和9核苷酸片段。因量太少，在图中已不清晰。
2.HinFI/MvaI酶切产物电泳结果见图2。由图可见，1a和1b型均可见四条带，核苷酸片段分别为82，71，63和41。2a和2b型可见二条带，核苷酸片段分别为186和71。3a型和4a型均可见三条带，核苷酸片段分别为130，71和56。图2还显示3a和4a中含有186核苷酸片段的不完全水解片段。6型可见四条带，核苷酸片段为82，71，63和44。
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3.BstUI酶切产物电泳结果见图3。1a泳道可见227片段。1b泳道可见197片段(图中尚可见258和227的不完全水解片段)。
4.ScrFI酶切产物电泳结果见图4。2a可见四条带，核苷酸片段分别为82，71，48和41；2b可见两条带，核苷酸片段为171和71。3a可见三条带，核苷酸片段分别为114，71，57。
二、标本检测结果。38例标本按上述方法检测结果均为1b型。
讨 论
一、酶切分型的结果判断
HaeⅢ/Rsal的酶切位点分别为5'GG↓CC3'和5'GT↓AC3'。MvaI/HinfI的酶切位点分别为5'CC↓A/TGG3'和5'G↓ANTC3'。首先应根据HaeⅢ/RsaI和MvaI/HinfI的酶切结果判定HCV的6个型。然后分别用BstUI区别1a和1b；用ScrFI区别2a和2b，3a和3b。
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二、实验条件的选择
基因扩增产物的纯化十分重要，应通过充分的洗涤，去除各种不必要的离子，以保证限制性内切酶的活性。酶切分型中所用的酶切时间应视所加限制性内切酶的量和活性加以调整。若酶切不完全，则可出现图3，1b泳道的结果。
三、分型基因片段的选择
用以分型的基因序列有非编码区的5'-NCR区和编码区的Core区、E1区和NS-5区。5′-NCR区基因序列最为保守，易于扩增，用此区作基因分型有较敏感的优点。本文即采用5'-NCR区作为分型片段。但是此区有的亚型基因序列因差别很小而不能完全区分开，如1c和1a型就不能分开。相反，采用扩增编码区的方法，亚型间基因序列变异较大，各个型别及其亚型能够很好地区分。其不足之处是此区亚型间基因序列变异较大，因而不易找到共同的引物结合位点，导致敏感性低，所以编码区主要应用型特异性引物法进行分型。Lau等对139例HCV-RNA(+)患者使用不同方法进行分型比较表明，不能分型的比例在5′-NCR区为7.8%，Core区为10.8%，NS-5区为16.5%[6]。
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四、以酶切分型的方法对我科38份随机标本进行检测。发现38例均为1b型。这与我科在1994年报告的情况类似[7]。当时检测150例HCV阳性标本，1b型(Ⅱ/K1)为98.7%(148/150)，2a型(Ⅲ/K2a)为1.3%。本次检测结果说明南京地区HCV感染仍然以1b型为主。
图1 HaeIII/RsaI水解产物电泳图谱M为分子量标志物，由右向左各泳道分别
la,lb,2a,2b,3a,4a和6a
, 百拇医药
图3 BstUI水解产物电泳图谱M为分子量标志物,la,lb为BstUI水产电泳图谱
图2 HinFI/Mval水解产物电泳图谱M为分子量标志物,由右向左各泳道分别la,lb,2a,2b,3a,4a和6a
图4 水解产物电泳图谱M为分子量标志物,2a,2b3a为ScrFI水解产物电泳图谱
△ 本课题为江苏省卫生厅留学回国人员科研启动资金资助(编号：276EC9606)
, 百拇医药
参考文献
[1] 孙南雄，等.实用肝脏病杂志 1998；3(1)：58.
[2] 张永祥，等.国外医学流行病学与传染病学分册 1998；25(2)：53.
[3] 杜绍财，等.中华医学杂志 1993；73(1)：7.
[4] Simmonds P, et al. J Gen Virol 1993；74：661.
[5] Simmonds P, et al. Hepatology 1994；19(Suppl)：1321.
[6] Lau JYN, et al. J Infect Dis 1995；171：281.
[7] 黄祖瑚，等.南京医学院学报 1994；14(1)：43.
(1998年12月26日收稿 1999年2月14日修回), 百拇医药
单位：孙南雄 张永祥 南京医科大学第一附属医院传染病研究室，邮政编码：210029；范晓峰 Health Science Center, School of Medicine, Saint Louis University,1402 South Grand Blvd,St Louis MO63104,US；杜绍财 北京医科大学第二临床学院肝病研究所(100034)
关键词：丙型肝炎病毒 基因分型
江苏医药990701 摘要 丙型肝炎病毒(HCV)的基因分型在临床和流行病学的研究方面有重要意义。以多聚酶链反应的方法扩增HCV的5'-非编码区第28至284区段(HCV-J株)，并以复合限制性内切酶水解的方法按Simmonds基因分型的标准，将HCV分为6型和若干亚型。结果：检测标本38份，均为1b型，与以往的检测结果类似。
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A Study on Hepatitis C Genotype Based on Simmonds' Classification by
Using Restriction Endonuclease Method
Sun Nanxiong, et al
Research Laboratory for Infectious Diseases, the First Affiliated
Hospital, Nanjing Medical University,Nanjing
Abstract A study was described for identifying hepatitis C virus genotypes by restriction endonuclease cleavage of sequence amplified by polymerase chain reaction (PCR) from 5′-non-coding region, that the nucleotide sequence was from region 28 to 284 (HCV-J), GenBank, D10750.Using the enzymes of both HaeⅢ/RsaⅠ and of both HinfⅠ/MvaⅠ, followed by cleavage with BstUI or ScrFI, according to the showed variant genotypes above. It was possible to identify and distinguish HCV genotypes as 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a and 6a. The method was used to investigate the prevalence of those genotypes in 38 cases of HCV infection in our hospital. All of the samples showed that they were genotype 1b, which was the same as what we have reported before in 1994. The method and its key influence factors were also discussed.
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Key words HCV Genotype
丙型肝炎病毒(HCV)属黄热病毒科，单股正链RNA病毒，约9400个核苷酸。根据HCV基因序列的同源性可以分为不同的型和亚型。HCV的基因分型与疾病严重性、干扰素的疗效、抗-HCV抗体检测的敏感性、疫苗的研制以及HCV流行病学的研究都有密切的关系[1，2]。
基因分型可以用型特异性引物进行选择性扩增，或用型特异性探针与PCR扩增产物杂交，或应用限制性内切酶水解扩增产物等方法进行[2，3]。
由于分型方法不同，HCV基因分型的命名一度存在混乱局面。1993年后，Simmonds等提出亲缘关系分析法得到了大多数学者的认同。Simmonds按照发现的先后将HCV分为6个型，以数字表示。每个型有若干亚型，以a，b，c等表示。这样，Simmonds把HCV分为6个型，11个亚型。该分型法还能与先前的各种分型命名法相对应，不仅协调了以前的分型命名方法，而且可以命名新的型和亚型[4，5]。
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我们选取HCV5'-非编码区(5'-NCR区)(HCV-J)扩增第28至284核苷酸区段，得到257个核苷酸的片段产物。采用复合限制性内切酶酶切的方法，水解该核苷酸片段，达到了Simmonds的分型要求。按所建立的方法检测我科HCV的标本38例，获得较满意的结果。兹报告如下。
材料和方法
一、材料
1.HCV分型参考血清由美国Saint Louis大学医学院赠送，基因型分别为1a，1b，2a，2b，3a，4a和6a。参考血清存-70℃备用。
2.HCV阳性标本来自我科门诊和病房的符合病毒性肝炎临床诊断的患者。其抗-HCV抗体(Abbott IMx检测)及HCV RNA(RT-PCR法)均阳性。在所收集标本的38例患者中，男27例，女11例，平均年龄为39.5岁。标本分装后存-70℃备用。
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3.引物取自5′-NCR区。序列引自GenBank，编号D10750(HCV-J)，由中国科学院上海植物生理所合成。
外引物序列为：
Forward 1：?5′-GGCGACACTCCACCATA-?GATC-3'(position 1-21)
Reverse 1：?5′-GGTGCACGGTCTACGAGA-?CCT-3'(position 304-324)
内引物序列为：
Forward 2：?5′-CTGTGAGGAACTACTGTC-?TTC-3'(position 28-48)
Reverse 2：?5′-CCCTATCAGGCAGTACCA-?CAA-3'(position 264-284)
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4.dNTPs，Prgmega公司；AMV逆转录酶，Promega公司；RNasin，Promega公司；Taq酶，Promega公司；限制性内切酶HaeⅢ(10U/μl)，Promega公司；限制性内切酶RsaⅠ(10U/μl)，Promega公司；限制性内切酶MvaI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；限制性内切酶HinFI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；限制性内切酶BstUI(10U/μl)，Sigma公司；限制性内切酶ScrFI(10U/μl)，Beohringer Mannhaim公司；分子量标志物pBR322 DNA/HaeⅢ，华美公司；低溶点琼脂糖，Sigma公司，临用前配制成4%凝胶。
5.HYBAID基因扩增仪
6.电泳仪，PowerPac300，BIO-RAD公司，电泳槽，Sub-Cell GT-MINI，BIORAD公司；
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7.紫外透射分析仪，ZF-AI型，上海长明光学电子仪器厂。
二、方法
1.5′-NCR基因片段的扩增
基因分型血清或标本各50μl，以异硫氰酸胍提取HCV-RNA。以AMV酶逆转录为cDNA。产物进行第一轮扩增。扩增条件为94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒，共35个循环。取第一轮产物5μl，进行第二轮扩增。扩增条件同上。第二轮PCR产物经纯化后，进行酶切分型。
2.酶切分型
(1)将纯化的第二轮PCR产物各取10μl分别加第一组酶HaeⅢ 1μl，RsaI 1μl和第二组酶HinFI1μl，MvaI 1μl。37℃水浴，4～16小时。
(2)根据第一、二两组酶切结果选择进行第三组酶切反应或第四组酶切反应。第三组酶切反应为纯化的第二轮PCR产物10μl加?BstUI1μl。60℃水浴，4～16小时。第四组酶切反应为纯化的第二轮PCR产物10μl加ScrFI 1μl，37℃水浴，4～16小时。
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(3)电泳。取酶切产物各20μl，溴酚兰3μl，分子量标志物5μl，以4%低溶点琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为80～100伏特，1～1.5小时。以紫外透射仪观察结果或拍照。
结 果
一、基因分型血清的分型结果
1.HaeⅢ/RsaI酶切产物电泳结果见图1(图1～4见封二)。由图可见，1a，1b和4a型的两条核苷酸片段较为清晰，该苷酸数分别为120和114。2a和2b分别可见62，58，56和46四条带(其中56，58二条带已重叠)和114，74和46三条带。3a可见114，69，51三条带。6a可见117，62和46条带。理论上各型均应含有两条14和9核苷酸片段。因量太少，在图中已不清晰。
2.HinFI/MvaI酶切产物电泳结果见图2。由图可见，1a和1b型均可见四条带，核苷酸片段分别为82，71，63和41。2a和2b型可见二条带，核苷酸片段分别为186和71。3a型和4a型均可见三条带，核苷酸片段分别为130，71和56。图2还显示3a和4a中含有186核苷酸片段的不完全水解片段。6型可见四条带，核苷酸片段为82，71，63和44。
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3.BstUI酶切产物电泳结果见图3。1a泳道可见227片段。1b泳道可见197片段(图中尚可见258和227的不完全水解片段)。
4.ScrFI酶切产物电泳结果见图4。2a可见四条带，核苷酸片段分别为82，71，48和41；2b可见两条带，核苷酸片段为171和71。3a可见三条带，核苷酸片段分别为114，71，57。
二、标本检测结果。38例标本按上述方法检测结果均为1b型。
讨 论
一、酶切分型的结果判断
HaeⅢ/Rsal的酶切位点分别为5'GG↓CC3'和5'GT↓AC3'。MvaI/HinfI的酶切位点分别为5'CC↓A/TGG3'和5'G↓ANTC3'。首先应根据HaeⅢ/RsaI和MvaI/HinfI的酶切结果判定HCV的6个型。然后分别用BstUI区别1a和1b；用ScrFI区别2a和2b，3a和3b。
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二、实验条件的选择
基因扩增产物的纯化十分重要，应通过充分的洗涤，去除各种不必要的离子，以保证限制性内切酶的活性。酶切分型中所用的酶切时间应视所加限制性内切酶的量和活性加以调整。若酶切不完全，则可出现图3，1b泳道的结果。
三、分型基因片段的选择
用以分型的基因序列有非编码区的5'-NCR区和编码区的Core区、E1区和NS-5区。5′-NCR区基因序列最为保守，易于扩增，用此区作基因分型有较敏感的优点。本文即采用5'-NCR区作为分型片段。但是此区有的亚型基因序列因差别很小而不能完全区分开，如1c和1a型就不能分开。相反，采用扩增编码区的方法，亚型间基因序列变异较大，各个型别及其亚型能够很好地区分。其不足之处是此区亚型间基因序列变异较大，因而不易找到共同的引物结合位点，导致敏感性低，所以编码区主要应用型特异性引物法进行分型。Lau等对139例HCV-RNA(+)患者使用不同方法进行分型比较表明，不能分型的比例在5′-NCR区为7.8%，Core区为10.8%，NS-5区为16.5%[6]。
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四、以酶切分型的方法对我科38份随机标本进行检测。发现38例均为1b型。这与我科在1994年报告的情况类似[7]。当时检测150例HCV阳性标本，1b型(Ⅱ/K1)为98.7%(148/150)，2a型(Ⅲ/K2a)为1.3%。本次检测结果说明南京地区HCV感染仍然以1b型为主。
图1 HaeIII/RsaI水解产物电泳图谱M为分子量标志物，由右向左各泳道分别
la,lb,2a,2b,3a,4a和6a
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图3 BstUI水解产物电泳图谱M为分子量标志物,la,lb为BstUI水产电泳图谱
图2 HinFI/Mval水解产物电泳图谱M为分子量标志物,由右向左各泳道分别la,lb,2a,2b,3a,4a和6a
图4 水解产物电泳图谱M为分子量标志物,2a,2b3a为ScrFI水解产物电泳图谱
△ 本课题为江苏省卫生厅留学回国人员科研启动资金资助(编号：276EC9606)
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参考文献
[1] 孙南雄，等.实用肝脏病杂志 1998；3(1)：58.
[2] 张永祥，等.国外医学流行病学与传染病学分册 1998；25(2)：53.
[3] 杜绍财，等.中华医学杂志 1993；73(1)：7.
[4] Simmonds P, et al. J Gen Virol 1993；74：661.
[5] Simmonds P, et al. Hepatology 1994；19(Suppl)：1321.
[6] Lau JYN, et al. J Infect Dis 1995；171：281.
[7] 黄祖瑚，等.南京医学院学报 1994；14(1)：43.
(1998年12月26日收稿 1999年2月14日修回), 百拇医药