人骨形态发生蛋白4(2b)成熟区cDNA的克隆和序列分析
作者：王欣璐 刘淼 杨广夫 李华 王全颍 杨广笑
单位：王欣璐、刘淼、李华(710061 西安医科大学第一附属医院骨科)；杨广夫(影像学中心)；王全颍、杨广笑(西安医科大学解剖教研室)
关键词：骨形态发生蛋白质类；克隆；分子；序列分析，DNA；逆转录聚合酶链反应
中华骨科杂志000905
【摘要】目的研究人骨形态发生蛋白4(2b)(BMP-4)成熟区cDNA的克隆方法,并进行测序及序列分析。方法采用异硫氰酸胍一步法从人骨肉瘤细胞株U-2OS中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增为BMP-4成熟区cDNA基因片段。将此基因片段经适当酶切后克隆入载体pUC19中，获得重组质粒pUC19/BMP-4。采用Sanger双脱氧链终止法双向测定核苷酸序列。结果通过RT-PCR方法获得了BMP-4成熟区的cDNA，并经核苷酸测序证实。计算机检索Genebank,选择其中已发表的BMP-4DNA序列(D30751)作为参考，经DNASIS软件分析显示，rhBMP-4成熟区cDNA和Genebank中D30751BMP-4成熟区(963～1310bp)的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。rhBMP-4成熟区cDNA中有2个碱基发生突变，一个位于第1154(201)位的GC，但它不引起缬氨酸(Val)密码子改变，故为无意义突变；另一突变位于1222(269)位的CT，其密码子亦随之发生改变，即由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸。结论获得克隆的BMP-4基因成熟区，该基因在骨关节系统的损伤与修复及疾病治疗中具有重要的临床应用价值。
, http://www.100md.com
Cloning and sequencing of mature fragment of BMP-4 gene
WANG Xinlu ,LIU Miao,YANG Guangfu,etal.
(Department of Orthopaedic Surgery, the First Affiliated Hospital, Xi＇ an Medical University,Xi＇ an 710061, China)
【Abstract】Objective To analyse the cloning and sequencing of mature fragment of human bone morphogenetic protein-4 gene. Methods The template DNA was extract from the human osteosarcoma cells line U-2OS by the single- step isolation method with isothiocyanic acid guanidine, the cDNA coding for the mature fragment of BMP-4 was amplified by the reverse transcription- polymerase chain reaction(RT-PCR). The mature fragment of BMP-4 was cloned into the vector pUC19, and sequenced by Sanger dideoxy-mediated chain termination method. Results The mature fragment of BMP-4 cDNA was obtained by RT-PCR and identified by sequencing. The computer search was done on Genebank, and the published DNA sequence of BMP-4 from Genebank (D30751) was chosen for a reference. Analysis showed that the homology and similarity of nucleotides and amino acids between cDNA of rhBMP-4 mature fragment and the published sequence of BMP-4 were both 99% . Sequence analysis revealed that there were two bases mutations, one was at base 1 154(201) G→C, this had no influence on the corresponding amino acids(Val), another was at base 1 222(269) C→T, the mutation at the base 1 222 had turned the Ala into Val. Conclusion The mature fragment of BMP-4 gene has been cloned. The gene is of great significance in treatment of skeletal injuries and diseases.
, 百拇医药
【Key words】Bone morphogenetic proteins; Cloning,molecular; Sequence analysis,DNA; Reverse transcription polymerase chain reaction
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属酸性多肽，首先在骨组织中发现，随之在多种动物及人的骨骼肌、软骨甚至肾脏等组织中也发现了此类蛋白质。因BMPs的氨基酸序列与转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)有相似性，故被归入TGF-β超家族[1]。目前已发现了13种BMP，分别为BMP-1～BMP-13。BMPs的生物学活性主要是诱导骨形成，促进骨损伤的修复，诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化。它对胚胎肢芽和心、眼、肾、神经等组织器官的发育亦有重要调节作用。BMP独特的生物学活性使其对骨折、骨缺损、骨质疏松、牙周病等多种骨性疾病的治疗具有巨大的应用价值。虽然采用生物化学方法可从各种骨组织中提取天然BMPs，但因其含量少、产量低以及动物蛋白抗原性等原因而无法满足临床应用的需要。应用基因工程的方法可获得足够量的重组人BMP(recombinant human bone morphogenetic protein,rhBMP)。美国和日本的基因工程重组人BMP-2、BMP-7等已经完成二期临床试验，并申报专利[1-5]。我国在这方面的研究也已取得了很大的进步和发展，已报道了BMP-2(2A)等基因在大肠杆菌中成功表达的实验结果[1-6]。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
(一)细胞株、质粒和培养液:骨肉瘤细胞株U-2OS由白求恩医科大学基础医学院馈赠；载体pUC19和大肠杆菌E.coliDH5α由西安华广生物技术公司提供。
(二)试剂:各种限制性内切酶、TaqDNA合成酶、dNTPs、T4DNA连接酶均为华美生物技术公司产品。
二、方法
(一)引物的设计与合成:引物设计参照已发表于Genebank中核苷酸序列(D30751)的成熟区(963～1310bp),由北京赛百盛生物技术公司协助完成其合成。引物如下:
正向引物5＇
GCGAATTCATGCCTAAGCATCACTCACAG 3＇
, 百拇医药
EcoRⅠ酶切位点
反向引物5
GCAAGCTTTGCCTGATCTCAGCGGCA 3＇
HindⅢ酶切位点
(二)应用RT-PCR法扩增BMP-4成熟区cDNA片段:(1)模板DNA的制备。采用异硫氰酸胍一步法[7,8]从培养细胞中提取制备总RNA，再以总RNA为模板，加入逆转录系统各成分和polyT,以生成cDNA模板。(2)反应系统。取总RNA1μg加入由华美公司提供的寡聚oligo(dT)2μl,5×Buffer10μl,胎盘RNA酶抑制剂1μl(50u),逆转录酶5μl,dNTPs(2.5mmol/L)8μl,使反应总体积为50μl，在42℃下反应2h，95℃5min灭活逆转录酶，置冰上。(3)PCR反应条件。在PCR反应体系中加入正向引物1μl、反向引物1μl、已合成的cDNA模板20μl、Buffer10μl、dNTPs(2.5mmol/L)8μl、Taq酶1μl、水59μl及石蜡油50μl。置入PCR仪(美国PE公司)，100℃沸水中5min,94℃1min,42℃30s,72℃30s，共25个循环，最后于72℃保持7min。取5μlPCR扩增产物以质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定和定量。
, 百拇医药
(三)DNA重组:将PCR扩增产物即BMP-4的成熟区cDNA片段和质粒pUC19分别用HindⅢ、EcoRⅠ进行酶切，断端行粘性连接，形成重组质粒pUC19/BMP-4(图1)。将5μl反应混合物中的重组质粒转化入用0.1mol/LCaCl2制备的大肠杆菌DH5α感受态菌株中，筛选白色克隆并用碱裂解法提取质粒，行StyⅠ酶切鉴定。
图1 重组质粒pUC19/BMP-4构建示意图
(四)BMP-4成熟片段的序列分析:用373ADNA全自动测定仪(Applied Biosystem公司)，以Sanger双脱氧链末端终止法[9]测定核苷酸序列。测序时，采用Taq DNA聚合酶及荧光标记的通用引物，从两个方向对同一片段进行测序，每个方向测2次，以所测得的序列作为BMP-4成熟区基因片段的序列。测序结果用计算机软件(DNA SIS)进行比较分析。
, 百拇医药
结果
一、骨肉瘤细胞株BMP-4成熟区基因RT-PCR扩增鉴定
BMP-4基因的PCR扩增产物预期长度为373bp，它包括357bp的BMP-4基因成熟区，2个限制性内切酶识别序列和4个保护碱基。实验中，以总RNA为逆转录反应模板合成第一条cDNA带，并以此为模板使用上述引物行PCR反应扩增了BMP-4基因成熟区片段。取5μlPCR扩增产物，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定可见一条373bp的电泳带，且无其它杂带，与预测的片段长度相同，说明这条电泳带即为BMP-4成熟区基因的扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
二、重组质粒pUC19/BMP-4的克隆与鉴定
, http://www.100md.com
(一)将BMP-4的成熟区cDNA片段和质粒pUC19分别用HindⅢ、EcoRⅠ酶切，断端行粘性连接，使目的片段插入pUC19中，转染大肠杆菌DH5α感受态菌株，随机筛选白色克隆。
(二)行StyⅠ酶切鉴定，在重组质粒上StyⅠ只有一个酶切点。因此酶切结果显示，仅有一条相对分子质量约为3.0kb的DNA带，如用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切可产生357bp和2670bp两条带(图3)。
图3 重组质粒pUC19/BMP-4酶切鉴定
三、BMP-4重组质粒的序列测定及分析结果
核苷酸序列测定结果显示，BMP-4成熟区核苷酸序列的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，共348个碱基对。用计算机软件比较rhBMP-4成熟区cDNA和Genebank中D30751BMP-4成熟区(963～1310bp)的序列，两者的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。在rhBMP-4成熟区的cDNA中有2个碱基发生突变，一个位于第1154(201)位的GC，但它并未引起缬氨酸(Val)密码子的改变，故为无意义突变；另一个是1222(269)位的C→T，其密码子发生改变，由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸(图4)。
, http://www.100md.com
1 Genebank中BMP-4成熟区核苷酸序列(D30751)
2 测序获得的BMP-4成熟区核苷酸序列
3 氨基酸翻译序列
图4 BMP-4成熟区片段的序列分析结果
讨论
BMPs包含13种以上的蛋白质成员，其中9种可以在体内诱导异位骨形成，Urist等[1]推测其靶细胞可能是血管周围未分化的间充质细胞，除了BMP-1以外，所有的BMPs均属于TGF-β超家族。根据对原始氨基酸序列的分析，将BMP-2～BMP-7分为3个亚组[10]:BMP-3为第一亚组；BMP-5、BMP-6、BMP-7属于第二亚组；BMP-2和BMP-4因羧基端有92%的氨基酸同源，故而组成第三亚组。在这3个亚组中，以BMP-2、BMP-4、BMP-7的生物活性最强，BMP-4与TGF-β家族的所有成员一样，合成时为前体蛋白，包括N端分泌引导肽、中间的前肽和C端的成熟肽。1988年，由Wozney等[4]首先在大肠杆菌中分别对BMP-1、BMP-2A、BMP-3基因进行表达，此后，陆续报道了BMP-2、BMP-4、BMP-7的原核表达实验结果[5,11-13]。1994年赵明等[6]首次在国内报告了人BMP-2(2A)成熟肽的基因克隆在大肠杆菌中的表达产物,于啮齿动物体内具有明显的诱导新骨形成的作用。
, 百拇医药
为了生产能够满足临床需求的基因工程多肽，国内外学者在BMPs的原核及真核表达方面进行了大量的研究工作，发现与真核表达系统相比，大肠杆菌的成长条件简单、培养费用少、技术成熟、产量高。但因其缺乏糖基化和蛋白质剪切加工系统，难以获得有活性的蛋白质。然而，据文献报道[6,12,13]，糖基化与否并不一定影响BMPs的蛋白质活性，经大肠杆菌表达的BMP-2、BMP-4及BMP-7均具有与真核系统所表达的BMP一样的体外诱导骨形成活性。在本实验中，我们已经完成了BMP-4成熟区的cDNA克隆，为BMP-4的原核表达创造了条件，也为进一步研究如何获得有活性的rhBMP-4蛋白质奠定了基础。目前我们已开始进行BMP-4原核表达的实验研究，并对蛋白质表达和提取方法进行改进和优化，以期取得一定量的蛋白质产物，进而进行活性测定。
核苷酸序列分析是区别和鉴定基因的最根本、也是最可靠的方法。我们对从人骨肉瘤细胞中提取的rhBMP-4成熟区cDNA进行的核苷酸序列分析表明，它与Genebank/EMBL中的BMP-4序列核苷酸的同源性达99%，氨基酸序列同源性达99%，与文献所报道的BMP基因高度保守性的结果相一致。在我们获得的rhBMP-4成熟区cDNA中，有2个核苷酸与已发表的BMP-4不同，即第1154(201)位的G→C和第1222(269)位的C→T。在1154位改变的C与其前的两个核苷酸共同组成遗传密码子GTC翻译为缬氨酸(Val)，而GTC和GTG均翻译为缬氨酸，因此，BMP-4基因在此位点为无意义突变。于1222位的核苷酸变化使丙氨酸变为缬氨酸，两者的分子结构很相似。据笔者分析，1222位核苷酸发生突变可能与以下两个因素有关:(1)本实验所用的人骨肉瘤细胞系核苷酸序列已存在点的突变；(2)在RT-PCR过程中发生偶然错配。
, http://www.100md.com
对rhBMP-4成熟区cDNA序列的分析显示,半胱氨酸(cysteine,Cys)多达7个，分别位于第15、44、48、79、80、112和114位(图4)。McDonald等[14]和Schlunegger等[15]均认为7个半胱氨酸中有6个是两两形成的分子内二硫键，另1个用于形成分子间的二硫键，并借此连接两条多肽链而形成有活性的二聚体形式。这个由3对半胱氨酸组成的分子内二硫键结构被称作半胱氨酸结(cysteine knot)，它不仅存在于BMP-4中，还存在于整个TGF-β家族、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)中，是蛋白质的核心和骨架。在我们所获rhBMP-4的成熟区中半胱氨酸的位置和数目均具有保守性，与文献报道一致。第87位的丙氨酸发生变异，变为缬氨酸，因为在受体结合区无氨基酸的改变，推测变异可能位于β3链中，此位置因远离半胱氨酸结，所以可能不会引起蛋白质活性的改变。在β3链中有一个氨基酸发生变异是否会引起BMP-4蛋白质分子构型的改变、这种改变有无生物学意义，均有待于进一步的实验研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Urist MR, Lietze A, Mizutani H, et al. A bovine molecular weight bone morphogenetic protein(BMP) fraction.Clin Orthop,1982,(162):219-232.
2，Takaoka K, Yoshikawa H, Hashimoto J, et al. Purification and characterization of a bone-inducing protein from a murine osteosarcoma (Dunn type). Clin Orthop, 1993, (292):329-336.
3，Kubler N, Urist MR. Cell differentiation in response to partially purified osteosarcoma- derived bone morphogenetic protein in vivo and vitro. Clin Orthop, 1993,(292):321-328.
, 百拇医药
4，Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities. Science,1988,242:1528-1534.
5，Takaoka K, Yoshikawa H, Hashimoto J, et al. Gene cloning and expression of a bone morphogenetic protein derived from a murine osteosarcoma.Clin Orthop,1993,(294):344- 352.
6，赵明，王会信，周延冲.重组人骨形成蛋白2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志,1994,10:319-324.
7，Chomczynski P. Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
, 百拇医药
8，姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京:第1版.人民军医出版社，1996.57-58.
9，Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:5463-5467.
10，Riley EH, Lane JM, Urist MR, et al. Bone morphogenetic protein 2 biology and applications.Clin Orthop,1996,(324):39-46.
11，Ruppert R, Hoffmann E, Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur J Biochem, 1996, 237:295-302.
, 百拇医药
12，Kubler NR, Reuther JF, Faller G,et al. Inductive properties of recombinant human BMP-2 produced in a bacterial expression system. Int J Oral Maxillofac Surg,1998,27:305-309.
13，Kubler NR, Moser M , Berr K , et al. Biological activity of E. coli expressed BMP-4. Mund Kiefer Gesichtschir,1998,2 Supp 11:149-152 (German).
14，McDonald NQ, Hendrickson WA. A structural superfamily of growth factors containing a cysteine knot motif.Cell,1993,73:421-424.
15，Schlunegger MP, Grutter MG. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2A resolution of human transforming growth factor-β2.Nature,1992,358:430-434.
(收稿日期:1999-07-19), 百拇医药
单位：王欣璐、刘淼、李华(710061 西安医科大学第一附属医院骨科)；杨广夫(影像学中心)；王全颍、杨广笑(西安医科大学解剖教研室)
关键词：骨形态发生蛋白质类；克隆；分子；序列分析，DNA；逆转录聚合酶链反应
中华骨科杂志000905
【摘要】目的研究人骨形态发生蛋白4(2b)(BMP-4)成熟区cDNA的克隆方法,并进行测序及序列分析。方法采用异硫氰酸胍一步法从人骨肉瘤细胞株U-2OS中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增为BMP-4成熟区cDNA基因片段。将此基因片段经适当酶切后克隆入载体pUC19中，获得重组质粒pUC19/BMP-4。采用Sanger双脱氧链终止法双向测定核苷酸序列。结果通过RT-PCR方法获得了BMP-4成熟区的cDNA，并经核苷酸测序证实。计算机检索Genebank,选择其中已发表的BMP-4DNA序列(D30751)作为参考，经DNASIS软件分析显示，rhBMP-4成熟区cDNA和Genebank中D30751BMP-4成熟区(963～1310bp)的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。rhBMP-4成熟区cDNA中有2个碱基发生突变，一个位于第1154(201)位的GC，但它不引起缬氨酸(Val)密码子改变，故为无意义突变；另一突变位于1222(269)位的CT，其密码子亦随之发生改变，即由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸。结论获得克隆的BMP-4基因成熟区，该基因在骨关节系统的损伤与修复及疾病治疗中具有重要的临床应用价值。
, http://www.100md.com
Cloning and sequencing of mature fragment of BMP-4 gene
WANG Xinlu ,LIU Miao,YANG Guangfu,etal.
(Department of Orthopaedic Surgery, the First Affiliated Hospital, Xi＇ an Medical University,Xi＇ an 710061, China)
【Abstract】Objective To analyse the cloning and sequencing of mature fragment of human bone morphogenetic protein-4 gene. Methods The template DNA was extract from the human osteosarcoma cells line U-2OS by the single- step isolation method with isothiocyanic acid guanidine, the cDNA coding for the mature fragment of BMP-4 was amplified by the reverse transcription- polymerase chain reaction(RT-PCR). The mature fragment of BMP-4 was cloned into the vector pUC19, and sequenced by Sanger dideoxy-mediated chain termination method. Results The mature fragment of BMP-4 cDNA was obtained by RT-PCR and identified by sequencing. The computer search was done on Genebank, and the published DNA sequence of BMP-4 from Genebank (D30751) was chosen for a reference. Analysis showed that the homology and similarity of nucleotides and amino acids between cDNA of rhBMP-4 mature fragment and the published sequence of BMP-4 were both 99% . Sequence analysis revealed that there were two bases mutations, one was at base 1 154(201) G→C, this had no influence on the corresponding amino acids(Val), another was at base 1 222(269) C→T, the mutation at the base 1 222 had turned the Ala into Val. Conclusion The mature fragment of BMP-4 gene has been cloned. The gene is of great significance in treatment of skeletal injuries and diseases.
, 百拇医药
【Key words】Bone morphogenetic proteins; Cloning,molecular; Sequence analysis,DNA; Reverse transcription polymerase chain reaction
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属酸性多肽，首先在骨组织中发现，随之在多种动物及人的骨骼肌、软骨甚至肾脏等组织中也发现了此类蛋白质。因BMPs的氨基酸序列与转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)有相似性，故被归入TGF-β超家族[1]。目前已发现了13种BMP，分别为BMP-1～BMP-13。BMPs的生物学活性主要是诱导骨形成，促进骨损伤的修复，诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化。它对胚胎肢芽和心、眼、肾、神经等组织器官的发育亦有重要调节作用。BMP独特的生物学活性使其对骨折、骨缺损、骨质疏松、牙周病等多种骨性疾病的治疗具有巨大的应用价值。虽然采用生物化学方法可从各种骨组织中提取天然BMPs，但因其含量少、产量低以及动物蛋白抗原性等原因而无法满足临床应用的需要。应用基因工程的方法可获得足够量的重组人BMP(recombinant human bone morphogenetic protein,rhBMP)。美国和日本的基因工程重组人BMP-2、BMP-7等已经完成二期临床试验，并申报专利[1-5]。我国在这方面的研究也已取得了很大的进步和发展，已报道了BMP-2(2A)等基因在大肠杆菌中成功表达的实验结果[1-6]。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
(一)细胞株、质粒和培养液:骨肉瘤细胞株U-2OS由白求恩医科大学基础医学院馈赠；载体pUC19和大肠杆菌E.coliDH5α由西安华广生物技术公司提供。
(二)试剂:各种限制性内切酶、TaqDNA合成酶、dNTPs、T4DNA连接酶均为华美生物技术公司产品。
二、方法
(一)引物的设计与合成:引物设计参照已发表于Genebank中核苷酸序列(D30751)的成熟区(963～1310bp),由北京赛百盛生物技术公司协助完成其合成。引物如下:
正向引物5＇
GCGAATTCATGCCTAAGCATCACTCACAG 3＇
, 百拇医药
EcoRⅠ酶切位点
反向引物5
GCAAGCTTTGCCTGATCTCAGCGGCA 3＇
HindⅢ酶切位点
(二)应用RT-PCR法扩增BMP-4成熟区cDNA片段:(1)模板DNA的制备。采用异硫氰酸胍一步法[7,8]从培养细胞中提取制备总RNA，再以总RNA为模板，加入逆转录系统各成分和polyT,以生成cDNA模板。(2)反应系统。取总RNA1μg加入由华美公司提供的寡聚oligo(dT)2μl,5×Buffer10μl,胎盘RNA酶抑制剂1μl(50u),逆转录酶5μl,dNTPs(2.5mmol/L)8μl,使反应总体积为50μl，在42℃下反应2h，95℃5min灭活逆转录酶，置冰上。(3)PCR反应条件。在PCR反应体系中加入正向引物1μl、反向引物1μl、已合成的cDNA模板20μl、Buffer10μl、dNTPs(2.5mmol/L)8μl、Taq酶1μl、水59μl及石蜡油50μl。置入PCR仪(美国PE公司)，100℃沸水中5min,94℃1min,42℃30s,72℃30s，共25个循环，最后于72℃保持7min。取5μlPCR扩增产物以质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定和定量。
, 百拇医药
(三)DNA重组:将PCR扩增产物即BMP-4的成熟区cDNA片段和质粒pUC19分别用HindⅢ、EcoRⅠ进行酶切，断端行粘性连接，形成重组质粒pUC19/BMP-4(图1)。将5μl反应混合物中的重组质粒转化入用0.1mol/LCaCl2制备的大肠杆菌DH5α感受态菌株中，筛选白色克隆并用碱裂解法提取质粒，行StyⅠ酶切鉴定。
图1 重组质粒pUC19/BMP-4构建示意图
(四)BMP-4成熟片段的序列分析:用373ADNA全自动测定仪(Applied Biosystem公司)，以Sanger双脱氧链末端终止法[9]测定核苷酸序列。测序时，采用Taq DNA聚合酶及荧光标记的通用引物，从两个方向对同一片段进行测序，每个方向测2次，以所测得的序列作为BMP-4成熟区基因片段的序列。测序结果用计算机软件(DNA SIS)进行比较分析。
, 百拇医药
结果
一、骨肉瘤细胞株BMP-4成熟区基因RT-PCR扩增鉴定
BMP-4基因的PCR扩增产物预期长度为373bp，它包括357bp的BMP-4基因成熟区，2个限制性内切酶识别序列和4个保护碱基。实验中，以总RNA为逆转录反应模板合成第一条cDNA带，并以此为模板使用上述引物行PCR反应扩增了BMP-4基因成熟区片段。取5μlPCR扩增产物，经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定可见一条373bp的电泳带，且无其它杂带，与预测的片段长度相同，说明这条电泳带即为BMP-4成熟区基因的扩增产物(图2)。
图2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
二、重组质粒pUC19/BMP-4的克隆与鉴定
, http://www.100md.com
(一)将BMP-4的成熟区cDNA片段和质粒pUC19分别用HindⅢ、EcoRⅠ酶切，断端行粘性连接，使目的片段插入pUC19中，转染大肠杆菌DH5α感受态菌株，随机筛选白色克隆。
(二)行StyⅠ酶切鉴定，在重组质粒上StyⅠ只有一个酶切点。因此酶切结果显示，仅有一条相对分子质量约为3.0kb的DNA带，如用HindⅢ、EcoRⅠ双酶切可产生357bp和2670bp两条带(图3)。
图3 重组质粒pUC19/BMP-4酶切鉴定
三、BMP-4重组质粒的序列测定及分析结果
核苷酸序列测定结果显示，BMP-4成熟区核苷酸序列的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，共348个碱基对。用计算机软件比较rhBMP-4成熟区cDNA和Genebank中D30751BMP-4成熟区(963～1310bp)的序列，两者的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99%。在rhBMP-4成熟区的cDNA中有2个碱基发生突变，一个位于第1154(201)位的GC，但它并未引起缬氨酸(Val)密码子的改变，故为无意义突变；另一个是1222(269)位的C→T，其密码子发生改变，由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸(图4)。
, http://www.100md.com
1 Genebank中BMP-4成熟区核苷酸序列(D30751)
2 测序获得的BMP-4成熟区核苷酸序列
3 氨基酸翻译序列
图4 BMP-4成熟区片段的序列分析结果
讨论
BMPs包含13种以上的蛋白质成员，其中9种可以在体内诱导异位骨形成，Urist等[1]推测其靶细胞可能是血管周围未分化的间充质细胞，除了BMP-1以外，所有的BMPs均属于TGF-β超家族。根据对原始氨基酸序列的分析，将BMP-2～BMP-7分为3个亚组[10]:BMP-3为第一亚组；BMP-5、BMP-6、BMP-7属于第二亚组；BMP-2和BMP-4因羧基端有92%的氨基酸同源，故而组成第三亚组。在这3个亚组中，以BMP-2、BMP-4、BMP-7的生物活性最强，BMP-4与TGF-β家族的所有成员一样，合成时为前体蛋白，包括N端分泌引导肽、中间的前肽和C端的成熟肽。1988年，由Wozney等[4]首先在大肠杆菌中分别对BMP-1、BMP-2A、BMP-3基因进行表达，此后，陆续报道了BMP-2、BMP-4、BMP-7的原核表达实验结果[5,11-13]。1994年赵明等[6]首次在国内报告了人BMP-2(2A)成熟肽的基因克隆在大肠杆菌中的表达产物,于啮齿动物体内具有明显的诱导新骨形成的作用。
, 百拇医药
为了生产能够满足临床需求的基因工程多肽，国内外学者在BMPs的原核及真核表达方面进行了大量的研究工作，发现与真核表达系统相比，大肠杆菌的成长条件简单、培养费用少、技术成熟、产量高。但因其缺乏糖基化和蛋白质剪切加工系统，难以获得有活性的蛋白质。然而，据文献报道[6,12,13]，糖基化与否并不一定影响BMPs的蛋白质活性，经大肠杆菌表达的BMP-2、BMP-4及BMP-7均具有与真核系统所表达的BMP一样的体外诱导骨形成活性。在本实验中，我们已经完成了BMP-4成熟区的cDNA克隆，为BMP-4的原核表达创造了条件，也为进一步研究如何获得有活性的rhBMP-4蛋白质奠定了基础。目前我们已开始进行BMP-4原核表达的实验研究，并对蛋白质表达和提取方法进行改进和优化，以期取得一定量的蛋白质产物，进而进行活性测定。
核苷酸序列分析是区别和鉴定基因的最根本、也是最可靠的方法。我们对从人骨肉瘤细胞中提取的rhBMP-4成熟区cDNA进行的核苷酸序列分析表明，它与Genebank/EMBL中的BMP-4序列核苷酸的同源性达99%，氨基酸序列同源性达99%，与文献所报道的BMP基因高度保守性的结果相一致。在我们获得的rhBMP-4成熟区cDNA中，有2个核苷酸与已发表的BMP-4不同，即第1154(201)位的G→C和第1222(269)位的C→T。在1154位改变的C与其前的两个核苷酸共同组成遗传密码子GTC翻译为缬氨酸(Val)，而GTC和GTG均翻译为缬氨酸，因此，BMP-4基因在此位点为无意义突变。于1222位的核苷酸变化使丙氨酸变为缬氨酸，两者的分子结构很相似。据笔者分析，1222位核苷酸发生突变可能与以下两个因素有关:(1)本实验所用的人骨肉瘤细胞系核苷酸序列已存在点的突变；(2)在RT-PCR过程中发生偶然错配。
, http://www.100md.com
对rhBMP-4成熟区cDNA序列的分析显示,半胱氨酸(cysteine,Cys)多达7个，分别位于第15、44、48、79、80、112和114位(图4)。McDonald等[14]和Schlunegger等[15]均认为7个半胱氨酸中有6个是两两形成的分子内二硫键，另1个用于形成分子间的二硫键，并借此连接两条多肽链而形成有活性的二聚体形式。这个由3对半胱氨酸组成的分子内二硫键结构被称作半胱氨酸结(cysteine knot)，它不仅存在于BMP-4中，还存在于整个TGF-β家族、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)中，是蛋白质的核心和骨架。在我们所获rhBMP-4的成熟区中半胱氨酸的位置和数目均具有保守性，与文献报道一致。第87位的丙氨酸发生变异，变为缬氨酸，因为在受体结合区无氨基酸的改变，推测变异可能位于β3链中，此位置因远离半胱氨酸结，所以可能不会引起蛋白质活性的改变。在β3链中有一个氨基酸发生变异是否会引起BMP-4蛋白质分子构型的改变、这种改变有无生物学意义，均有待于进一步的实验研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Urist MR, Lietze A, Mizutani H, et al. A bovine molecular weight bone morphogenetic protein(BMP) fraction.Clin Orthop,1982,(162):219-232.
2，Takaoka K, Yoshikawa H, Hashimoto J, et al. Purification and characterization of a bone-inducing protein from a murine osteosarcoma (Dunn type). Clin Orthop, 1993, (292):329-336.
3，Kubler N, Urist MR. Cell differentiation in response to partially purified osteosarcoma- derived bone morphogenetic protein in vivo and vitro. Clin Orthop, 1993,(292):321-328.
, 百拇医药
4，Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation:molecular clones and activities. Science,1988,242:1528-1534.
5，Takaoka K, Yoshikawa H, Hashimoto J, et al. Gene cloning and expression of a bone morphogenetic protein derived from a murine osteosarcoma.Clin Orthop,1993,(294):344- 352.
6，赵明，王会信，周延冲.重组人骨形成蛋白2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性.生物化学杂志,1994,10:319-324.
7，Chomczynski P. Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
, 百拇医药
8，姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京:第1版.人民军医出版社，1996.57-58.
9，Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:5463-5467.
10，Riley EH, Lane JM, Urist MR, et al. Bone morphogenetic protein 2 biology and applications.Clin Orthop,1996,(324):39-46.
11，Ruppert R, Hoffmann E, Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur J Biochem, 1996, 237:295-302.
, 百拇医药
12，Kubler NR, Reuther JF, Faller G,et al. Inductive properties of recombinant human BMP-2 produced in a bacterial expression system. Int J Oral Maxillofac Surg,1998,27:305-309.
13，Kubler NR, Moser M , Berr K , et al. Biological activity of E. coli expressed BMP-4. Mund Kiefer Gesichtschir,1998,2 Supp 11:149-152 (German).
14，McDonald NQ, Hendrickson WA. A structural superfamily of growth factors containing a cysteine knot motif.Cell,1993,73:421-424.
15，Schlunegger MP, Grutter MG. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2A resolution of human transforming growth factor-β2.Nature,1992,358:430-434.
(收稿日期:1999-07-19), 百拇医药