胆道梗阻对肝线粒体功能损伤机制的初步研究
作者：李靖 迟彦邦 方学军
单位：李靖 迟彦邦：第三军医大学新桥医院肝胆外科(重庆 400037)；方学军：*第一军医大学南方医院肝胆外科
关键词：胆汁郁积；线粒体；肝；钙；脂质过氧化作用
中国病理生理杂志991014
摘要 目的：初步探讨胆道梗阻对肝线粒体功能损伤的机制。方法：复制犬胆道梗阻模型，观察梗阻的不同时段肝线粒体呼吸功能、钙含量、钙摄取率、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化。结果：胆道梗阻2周、3周、4周及5周各组(Ⅱ～Ⅴ组)分别与假手术组(Ⅰ组)比较：①肝线粒体呼吸控制率、钙摄取率及SOD含量均明显下降(Ⅱ组P<0.05，其余组P<0.01)；②线粒体钙含量均明显升高(Ⅱ组P<0.05，其余组P<0.01)；③线粒体MDA含量明显升高(各组P<0.01)。相关分析显示，线粒体钙含量、MDA含量与线粒体呼吸控制率变化之间均呈现显著的负相关(P<0.01)。结论：胆道梗阻后肝线粒体呼吸功能受到明显损伤，钙超载及脂质过氧化反应是造成线粒体功能损害的可能机制。
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Preliminary studies on the mechanism of liver mitochondrial
function injury following biliary obstruction
LI Jing,CHI Yan-Bang,FANG Xue-Jun
Department of Hepatobiliary Surgery,Xinqiao Hospital,the Thrid Military Medical University,Chongqing (400037)
Abstract AIM:Preliminary studies on the mechanism of liver mitochondrial function injury following biliary obstructioin.METHODS：The changes of hepatic mitochondrial respiratory function,calcium content,calcium uptake,malondialdehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) content following biliary obstruction in dogs were observed.RESULTS：Each group of 2,3,4,5 weeks following biliary obstruction were compared with sham group,the results showed:① hepatic mitochondrial respiratory control rate (RCR),Ca2+-uptake and SOD content were reduced significantly (2 weeks group P<0.05,other groups P<0.01); ②hepatic mitochondrial Ca2+ content was increased significantly (2 weeks group P<0.05,other groups P<0.01); ③ hepatic mitochondrial MDA content were increased significantly (P<0.01).Mitochondrial calcium content and MDA content were highly negative correlated with mitochondrial RCR(P<0.01).CONCLUSION：The hepatic mitochondrial respiratory function is obviously damaged after biliary obstructioin.Mitochondrial calcium overload and lipid peroxidation may be the mechanisms of mitochondrial dysfunction.
, 百拇医药
MeSH Cholestasis; Mitochondria,liver; Calcium; Lipid peroxidation
胆道梗阻对肝线粒体呼吸功能有明显的损伤作用[1]，对其损伤机制研究甚少。本文通过复制犬胆道梗阻模型，动态观察肝线粒体呼吸控制率、钙含量、钙摄取率、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的变化，对胆道梗阻后肝线粒体的损伤及其机制作初步探讨。
材料与方法
一、动物分组及模型复制：
选用本地健康杂种犬30只，雌雄不拘，体重10～15 kg。随机分成5组，每组6只。Ⅰ组：假手术组；Ⅱ组：梗阻2周组；Ⅲ组：梗阻3周组；Ⅳ组：梗阻4周组；Ⅴ组：梗阻5周组。采用胆总管结扎、横断复制犬胆道梗阻模型。各组动物术前禁食12 h，用3%戊巴比妥钠(1 mg/kg体重)静注麻醉，经上腹正中切口进腹，于肝十二指肠韧带内分出胆总管，双重结扎、横断。Ⅰ组分出胆总管后不结扎，仅楔形切取肝组织，逐层关腹。术后普通饲养。各组动物到梗阻时间后再次开腹取肝组织检测。
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二、主要仪器与试剂：
低温高速离心机(长沙离心机厂)、752型紫外分光光度计(上海第一分析仪表厂)、水平式记录仪(四川仪表厂)、溶氧测定仪(上海植物研究所)、超级恒温循环水浴机(上海微电机厂)、日立Z-8000型偏振塞曼原子吸收分光光度计(日本)、2008G自动γ免疫计数器(西安262厂)。ADP(美国，Sigma)考马斯亮蓝G-250(德国，华美公司分装)、结晶牛血清白蛋白(德国，华美公司分装)、SOD放免药盒(成都同位素应用技术研究所)、琥珀酸钠、四乙氧基丙烷等均为国产市售分析纯产品。
三、实验方法：
1.肝线粒体分离制备：按Aprille等的方法进行[1]。蛋白定量用考马斯亮蓝法，以结晶牛血清白蛋白为标准。
2.线粒体呼吸功能测定：参照Estabrook氧电极法进行[1]。以溶氧测定仪测定Ⅲ态氧耗量(S3)及Ⅳ态氧耗量(S4)，计算出呼吸控制率(respiratory control rate,RCR)。
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3.线粒体钙含量测定：线粒体制成每毫升含3 mg线粒体蛋白的悬液，其中含0.25% HCl及0.6% LaCl3。在原子吸收分光光度计上以火焰法直接测定钙含量。测定波长为4 228 nm，测定高度为12.5 mm，狭逢0.5， Air压力1.6 kg/cm2，C2H2压力0.4 kg/cm2。结果以nmol/mg 线粒体蛋白表示。
4.线粒体钙摄取率测定[2]：测定体系总体积为1 mL，反应介质含0.01 mol/L pH7.4 磷酸缓冲液，0.25 mol/L蔗糖、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L琥珀酸钠，3 mmol/L ATP。加入线粒体蛋白1 mg,37℃温育3 min，加入75 μmol/L [45] CaCl2，继续温育5 min，取0.1 mL(双份)，以微孔滤膜过滤，2 mL双蒸水冲洗滤膜，置于闪烁杯中自然干燥后，加入5 mL闪烁液，在液闪计数器上测定放射性强度，计算钙摄取率。
, 百拇医药
5.线粒体MDA及SOD含量测定：MDA含量测定参照紫外法[3]；SOD含量测定用放射免疫法，按SOD放免药盒说明书操作步骤进行。
四、数据处理：
各组计量资料均以均数±标准差(
±s)表示。用第三军医大学数理统计教研室医用统计程序对各组数据行单因素方差分析及相关性分析。
结果
胆道梗阻各组肝线粒体RCR、Ca2+、Ca2+-uptake、MDA及SOD的变化(见表1)。
表1 胆道梗阻各组肝线粒体RCR、Ca2+,Ca2+-uptake,MDA及SOD的变化
, 百拇医药
Tab 1 The changes of mitochondrial RCR,Ca2+、Ca2+-uptake、MDA and SOD following biliary obstruction (
±s,n=6 ) Group
RCR
Ca2+
(nmol/mgMtPro)
Ca2+-uptake
(nmol/mgMtPro)
MDA
, 百拇医药
(nmol/mgMtPro)
SOD
(ng/mgMtPro)
Ⅰ
4.46±0.44
1.99±0.40
17.53±2.01
99.10±12.13
27.53±3.15
Ⅱ
3.68±0.29*
3.17±0.58*
, 百拇医药
14.13±1.85*
139.25±21.14**
22.32±2.51*
Ⅲ
2.38±0.31**
4.99±0.65**
12.08±1.52**
181.35±28.42**
20.02±2.46**
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Ⅳ
1.96±0.24**
6.52±1.23**
10.91±1.63**
211.96±27.84**
17.32±2.59**
Ⅴ
1.74±0.22**
7.78±1.41**
10.13±1.54**
, 百拇医药
221.43±32.39**
14.29±1.98**
*P<0.05,**P<0.01,vs Ⅰ ; I=Sham,biliary obstruction-2 weeks (Ⅱ),3 weeks (Ⅲ),4 weeks (Ⅳ),5 weeks (Ⅴ)
从表1中可见，胆道梗阻2周、3周、4周及5周各组(Ⅱ～Ⅴ组)分别与Ⅰ组比较：①肝线粒体RCR分别下降17%、47%、56%及61%。②线粒体Ca2+含量分别升高59%、151%、228%及291%； Ca2+-uptake分别下降19%、31%、38%及42%。③线粒体MDA含量分别升高41%、83%、114%及123%；SOD含量分别减少19%、27%、37%及48%。
此外，相关分析提示：线粒体钙含量与线粒体RCR变化之间呈显著负相关(r=-0.8527,P<0.01);线粒体MDA含量与线粒体RCR变化之间亦呈现显著负相关(r=-0.8741,P<0.01)。
, 百拇医药
讨论
线粒体RCR是评价线粒体结构完整性和氧化磷酸化机能状态的极为灵敏的指标[1]。本研究显示，胆道梗阻各组肝线粒体RCR较假手术组明显下降，随梗阻时间延长而加重，表明胆道梗阻后肝线粒体呼吸功能受到明显损伤。其损伤机制目前尚不清楚。钙超载及脂质过氧化反应在各种类型细胞损伤中的作用已被广泛证实。本实验发现，胆道梗阻各组肝线粒体Ca2+含量及MDA含量明显升高，而钙摄取率及SOD含量则明显减少。说明胆道梗阻后肝线粒体内存在明显的钙代谢紊乱及脂质过氧化反应。线粒体钙超载可使线粒体膜电位降低，使组织ATP含量下降[4]，线粒体内过多的钙尚可激活磷脂酶，激发脂质过氧化反应导致线粒体膜损伤[5]。线粒体钙摄取率下降即是线粒体结构破坏的一种表现，已经证实磷脂是钙的一种载体[6]，线粒体膜磷脂的降解必然会使钙载体缺乏，使其主动摄钙能力下降。而MDA及SOD含量的减少则说明线粒体自由基清除能力下降，脂质过氧化损伤加重。线粒体膜的脂质过氧化损伤，不仅可影响膜流动性及通透性，使膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase等的脂质微环境失常，导致膜离子转运紊乱，影响ATP生成；MDA尚可与参与氧化生能的酶分子中的巯基交联，使酶活性丧失，并可致膜蛋白降解，膜结构破坏[7]。本实验的相关分析提示，线粒体钙及MDA含量的升高与RCR下降之间均呈现显著的负相关，表明胆道梗阻后线粒体钙超载及脂质过氧化反应是导致线粒体功能损伤的可能机制。
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参考文献
1 方学军，迟彦邦，李 靖.胆道梗阻再通后肝线粒体呼吸功能恢复的实验研究.中国病理生理杂志，1997，13：313.
2 岳 平，傅世英，黄永麟，等.再灌注损伤心肌线粒体钙代谢与呼吸功能关系的研究.中国病理生理杂志，1991，7(3)：272.
3 金田尚志，植田伸夫.过酸化脂质实验法.见：金田尚志，植田伸夫主编.过酸化脂实验法.第1版.东京：医学药业出版株式会社，1983.36～45.
4 Richelmi P,Mirabelli F,Salis A,et al.On the role of mitochondria in cell injury caused by Vanadate-induced Ca2+ overload.Toxicology,1989,57:29.
, http://www.100md.com
5 Malis CD,Bonvente JV.Mechanism of calcium potentiation of oxygen free radical injury to renal mitohondria.J Biol Chem,1986,261:14201.
6 Keneth DP.The role of phospholipids in the Ca2+ binding of isolated cardiac sarcolemma.J Mol cell Cardiol,1980,12:1159.
7 Wolff SP.Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis.Biochem J,1986,234:399.
(1998年3月17日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药
单位：李靖 迟彦邦：第三军医大学新桥医院肝胆外科(重庆 400037)；方学军：*第一军医大学南方医院肝胆外科
关键词：胆汁郁积；线粒体；肝；钙；脂质过氧化作用
中国病理生理杂志991014
摘要 目的：初步探讨胆道梗阻对肝线粒体功能损伤的机制。方法：复制犬胆道梗阻模型，观察梗阻的不同时段肝线粒体呼吸功能、钙含量、钙摄取率、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化。结果：胆道梗阻2周、3周、4周及5周各组(Ⅱ～Ⅴ组)分别与假手术组(Ⅰ组)比较：①肝线粒体呼吸控制率、钙摄取率及SOD含量均明显下降(Ⅱ组P<0.05，其余组P<0.01)；②线粒体钙含量均明显升高(Ⅱ组P<0.05，其余组P<0.01)；③线粒体MDA含量明显升高(各组P<0.01)。相关分析显示，线粒体钙含量、MDA含量与线粒体呼吸控制率变化之间均呈现显著的负相关(P<0.01)。结论：胆道梗阻后肝线粒体呼吸功能受到明显损伤，钙超载及脂质过氧化反应是造成线粒体功能损害的可能机制。
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Preliminary studies on the mechanism of liver mitochondrial
function injury following biliary obstruction
LI Jing,CHI Yan-Bang,FANG Xue-Jun
Department of Hepatobiliary Surgery,Xinqiao Hospital,the Thrid Military Medical University,Chongqing (400037)
Abstract AIM:Preliminary studies on the mechanism of liver mitochondrial function injury following biliary obstructioin.METHODS：The changes of hepatic mitochondrial respiratory function,calcium content,calcium uptake,malondialdehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) content following biliary obstruction in dogs were observed.RESULTS：Each group of 2,3,4,5 weeks following biliary obstruction were compared with sham group,the results showed:① hepatic mitochondrial respiratory control rate (RCR),Ca2+-uptake and SOD content were reduced significantly (2 weeks group P<0.05,other groups P<0.01); ②hepatic mitochondrial Ca2+ content was increased significantly (2 weeks group P<0.05,other groups P<0.01); ③ hepatic mitochondrial MDA content were increased significantly (P<0.01).Mitochondrial calcium content and MDA content were highly negative correlated with mitochondrial RCR(P<0.01).CONCLUSION：The hepatic mitochondrial respiratory function is obviously damaged after biliary obstructioin.Mitochondrial calcium overload and lipid peroxidation may be the mechanisms of mitochondrial dysfunction.
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MeSH Cholestasis; Mitochondria,liver; Calcium; Lipid peroxidation
胆道梗阻对肝线粒体呼吸功能有明显的损伤作用[1]，对其损伤机制研究甚少。本文通过复制犬胆道梗阻模型，动态观察肝线粒体呼吸控制率、钙含量、钙摄取率、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量的变化，对胆道梗阻后肝线粒体的损伤及其机制作初步探讨。
材料与方法
一、动物分组及模型复制：
选用本地健康杂种犬30只，雌雄不拘，体重10～15 kg。随机分成5组，每组6只。Ⅰ组：假手术组；Ⅱ组：梗阻2周组；Ⅲ组：梗阻3周组；Ⅳ组：梗阻4周组；Ⅴ组：梗阻5周组。采用胆总管结扎、横断复制犬胆道梗阻模型。各组动物术前禁食12 h，用3%戊巴比妥钠(1 mg/kg体重)静注麻醉，经上腹正中切口进腹，于肝十二指肠韧带内分出胆总管，双重结扎、横断。Ⅰ组分出胆总管后不结扎，仅楔形切取肝组织，逐层关腹。术后普通饲养。各组动物到梗阻时间后再次开腹取肝组织检测。
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二、主要仪器与试剂：
低温高速离心机(长沙离心机厂)、752型紫外分光光度计(上海第一分析仪表厂)、水平式记录仪(四川仪表厂)、溶氧测定仪(上海植物研究所)、超级恒温循环水浴机(上海微电机厂)、日立Z-8000型偏振塞曼原子吸收分光光度计(日本)、2008G自动γ免疫计数器(西安262厂)。ADP(美国，Sigma)考马斯亮蓝G-250(德国，华美公司分装)、结晶牛血清白蛋白(德国，华美公司分装)、SOD放免药盒(成都同位素应用技术研究所)、琥珀酸钠、四乙氧基丙烷等均为国产市售分析纯产品。
三、实验方法：
1.肝线粒体分离制备：按Aprille等的方法进行[1]。蛋白定量用考马斯亮蓝法，以结晶牛血清白蛋白为标准。
2.线粒体呼吸功能测定：参照Estabrook氧电极法进行[1]。以溶氧测定仪测定Ⅲ态氧耗量(S3)及Ⅳ态氧耗量(S4)，计算出呼吸控制率(respiratory control rate,RCR)。
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3.线粒体钙含量测定：线粒体制成每毫升含3 mg线粒体蛋白的悬液，其中含0.25% HCl及0.6% LaCl3。在原子吸收分光光度计上以火焰法直接测定钙含量。测定波长为4 228 nm，测定高度为12.5 mm，狭逢0.5， Air压力1.6 kg/cm2，C2H2压力0.4 kg/cm2。结果以nmol/mg 线粒体蛋白表示。
4.线粒体钙摄取率测定[2]：测定体系总体积为1 mL，反应介质含0.01 mol/L pH7.4 磷酸缓冲液，0.25 mol/L蔗糖、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L琥珀酸钠，3 mmol/L ATP。加入线粒体蛋白1 mg,37℃温育3 min，加入75 μmol/L [45] CaCl2，继续温育5 min，取0.1 mL(双份)，以微孔滤膜过滤，2 mL双蒸水冲洗滤膜，置于闪烁杯中自然干燥后，加入5 mL闪烁液，在液闪计数器上测定放射性强度，计算钙摄取率。
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5.线粒体MDA及SOD含量测定：MDA含量测定参照紫外法[3]；SOD含量测定用放射免疫法，按SOD放免药盒说明书操作步骤进行。
四、数据处理：
各组计量资料均以均数±标准差(
±s)表示。用第三军医大学数理统计教研室医用统计程序对各组数据行单因素方差分析及相关性分析。结果
胆道梗阻各组肝线粒体RCR、Ca2+、Ca2+-uptake、MDA及SOD的变化(见表1)。
表1 胆道梗阻各组肝线粒体RCR、Ca2+,Ca2+-uptake,MDA及SOD的变化
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Tab 1 The changes of mitochondrial RCR,Ca2+、Ca2+-uptake、MDA and SOD following biliary obstruction (
±s,n=6 ) GroupRCR
Ca2+
(nmol/mgMtPro)
Ca2+-uptake
(nmol/mgMtPro)
MDA
, 百拇医药
(nmol/mgMtPro)
SOD
(ng/mgMtPro)
Ⅰ
4.46±0.44
1.99±0.40
17.53±2.01
99.10±12.13
27.53±3.15
Ⅱ
3.68±0.29*
3.17±0.58*
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14.13±1.85*
139.25±21.14**
22.32±2.51*
Ⅲ
2.38±0.31**
4.99±0.65**
12.08±1.52**
181.35±28.42**
20.02±2.46**
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Ⅳ
1.96±0.24**
6.52±1.23**
10.91±1.63**
211.96±27.84**
17.32±2.59**
Ⅴ
1.74±0.22**
7.78±1.41**
10.13±1.54**
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221.43±32.39**
14.29±1.98**
*P<0.05,**P<0.01,vs Ⅰ ; I=Sham,biliary obstruction-2 weeks (Ⅱ),3 weeks (Ⅲ),4 weeks (Ⅳ),5 weeks (Ⅴ)
从表1中可见，胆道梗阻2周、3周、4周及5周各组(Ⅱ～Ⅴ组)分别与Ⅰ组比较：①肝线粒体RCR分别下降17%、47%、56%及61%。②线粒体Ca2+含量分别升高59%、151%、228%及291%； Ca2+-uptake分别下降19%、31%、38%及42%。③线粒体MDA含量分别升高41%、83%、114%及123%；SOD含量分别减少19%、27%、37%及48%。
此外，相关分析提示：线粒体钙含量与线粒体RCR变化之间呈显著负相关(r=-0.8527,P<0.01);线粒体MDA含量与线粒体RCR变化之间亦呈现显著负相关(r=-0.8741,P<0.01)。
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线粒体RCR是评价线粒体结构完整性和氧化磷酸化机能状态的极为灵敏的指标[1]。本研究显示，胆道梗阻各组肝线粒体RCR较假手术组明显下降，随梗阻时间延长而加重，表明胆道梗阻后肝线粒体呼吸功能受到明显损伤。其损伤机制目前尚不清楚。钙超载及脂质过氧化反应在各种类型细胞损伤中的作用已被广泛证实。本实验发现，胆道梗阻各组肝线粒体Ca2+含量及MDA含量明显升高，而钙摄取率及SOD含量则明显减少。说明胆道梗阻后肝线粒体内存在明显的钙代谢紊乱及脂质过氧化反应。线粒体钙超载可使线粒体膜电位降低，使组织ATP含量下降[4]，线粒体内过多的钙尚可激活磷脂酶，激发脂质过氧化反应导致线粒体膜损伤[5]。线粒体钙摄取率下降即是线粒体结构破坏的一种表现，已经证实磷脂是钙的一种载体[6]，线粒体膜磷脂的降解必然会使钙载体缺乏，使其主动摄钙能力下降。而MDA及SOD含量的减少则说明线粒体自由基清除能力下降，脂质过氧化损伤加重。线粒体膜的脂质过氧化损伤，不仅可影响膜流动性及通透性，使膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase等的脂质微环境失常，导致膜离子转运紊乱，影响ATP生成；MDA尚可与参与氧化生能的酶分子中的巯基交联，使酶活性丧失，并可致膜蛋白降解，膜结构破坏[7]。本实验的相关分析提示，线粒体钙及MDA含量的升高与RCR下降之间均呈现显著的负相关，表明胆道梗阻后线粒体钙超载及脂质过氧化反应是导致线粒体功能损伤的可能机制。
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参考文献
1 方学军，迟彦邦，李 靖.胆道梗阻再通后肝线粒体呼吸功能恢复的实验研究.中国病理生理杂志，1997，13：313.
2 岳 平，傅世英，黄永麟，等.再灌注损伤心肌线粒体钙代谢与呼吸功能关系的研究.中国病理生理杂志，1991，7(3)：272.
3 金田尚志，植田伸夫.过酸化脂质实验法.见：金田尚志，植田伸夫主编.过酸化脂实验法.第1版.东京：医学药业出版株式会社，1983.36～45.
4 Richelmi P,Mirabelli F,Salis A,et al.On the role of mitochondria in cell injury caused by Vanadate-induced Ca2+ overload.Toxicology,1989,57:29.
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5 Malis CD,Bonvente JV.Mechanism of calcium potentiation of oxygen free radical injury to renal mitohondria.J Biol Chem,1986,261:14201.
6 Keneth DP.The role of phospholipids in the Ca2+ binding of isolated cardiac sarcolemma.J Mol cell Cardiol,1980,12:1159.
7 Wolff SP.Fragmentation of proteins by free radicals and its effect on their susceptibility to enzymic hydrolysis.Biochem J,1986,234:399.
(1998年3月17日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药