错配修复基因相连锁的微卫星与慢性粒细胞白血病急性变的关系
作者：李戈 宋玉华 钱林生 马小彤 林永敏 王敏慧 吴克复
单位：(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所 300020 天津)
关键词：白血病，髓样，慢性；DNA突变分析
中华医学杂志000307摘 要：目的 探讨错配修复基因连锁的微卫星DNA的遗传改变与慢性粒细胞白血病(CML)加速急变之间的关系。方法 采用PCR-银染方法对18例CML患者加速期或急变期的骨髓细胞与其慢性期进行比较。结果 5例CML患者中出现D2s123和 D3s1298微卫星的改变,占27.8%, 其中1例出现在加速期,4例出现在急变期。3例患者D2s123微卫星发生改变, 1例出现在加速期,为等位基因微卫星序列的杂合性缺失; 2例出现在急变期, 杂合性缺失和微卫星遗传不稳定性各1例。2例患者D3s1298微卫星发生改变,出现在急变期,均为微卫星遗传不稳定性。结论 与错配修复基因连锁的微卫星DNA的遗传改变可能与部分CML患者的加速急变有一定的关系。
, 百拇医药
The genetic instability of mismatch repair gene linked microsatellite and the evolution of CML
LI Ge SONG Yuhua QIAN Linsheng, et al.
(Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China)
Abstract：Objective To explore the relationship between the genetic instability of microsatellite linked with mismatch repair gene and the evolution of CML to blast crisis. Methods The loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MSI) of two polymorphic microsatellite markers, D2s123 and D3s1298, linked with mismatch repair gene hMSH2 and hMLH1 respectively, were detected by PCR-silver staining method on the bone marrow cells of 18 CML patients, who clinically progressed from the chronic phase to accelerated phase or blast crisis. Results Differences in microsatellite D2s123 and D3s1298 at the CML accelerated phase or blast crisis in 5 (27.8%) of the 18 patients were demonstrated compared with chronic phase. For D2s123, MSI and LOH were observed in 1 of 8 patients with accelerated phase (12.5%) and 2 of 10 patients in blast crisis (20%). For D3s1298, MSI and LOH were observed in 2 of 10 patients in blast crisis (20%). Conclusion The genetic alteration of microsatellite D2s123 and D3s1298 may play a role in the progress of some CML cases.
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Key words：Leukemia, myeloid, chronic; DNA mutational analysis
错配修复基因 (mismatch repair gene) 是一组高度保守的看家基因, 参与细胞复制后的错配修复，对于维持微卫星序列的遗传稳定有重要作用[1]。近年来的研究表明, 肿瘤的发生、发展与基因组微卫星DNA的遗传不稳定性(MSI) 和等位基因微卫星序列的杂合性缺失(LOH)有关[2]。但与错配修复基因相连锁微卫星DNA的遗传改变与慢性粒细胞白血病(CML)急性变的关系尚少见报道。我们用多聚酶链反应 (PCR)-银染方法对与错配修复基因hMSH2 (human mut S homologue-2) 和hMLH1 (human mut L homologue-1)连锁的微卫星D2s123及D3s1298在CML患者加速、急变过程的变化情况与其慢性期进行了比较研究。
对象与方法
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一、对象
中国医学科学院血液病医院按FAB分型标准确诊的CML患者18例, 其中男11例,女7例。患者年龄从18岁到70岁,中位年龄42岁。从慢性期发展到加速期或急变期的时间间隔为21个月至84个月,中位间隔47个月。
二、方法
1.DNA提取:采用改良酚抽提法。按本室常规方法患者慢性期标本从Wright's染色骨髓涂片上提取基因组DNA,加速期和急变期标本从新鲜骨髓中提取基因组DNA[3]。
2.细胞遗传学检测：采用常规G-带法检测Ph染色体。
3.bcr-abl融合基因的检测:由t(9:22)(q34,q11)形成的bcr-abl融合基因按本室常规采用RT-PCR方法检测[4]。
, 百拇医药
4.微卫星遗传不稳定性分析:微卫星引物序列参照文献[5，6]:D2s123为P1:5′-AAACAGGAT-GCCTGCCTTTA-3′和P2:5′-GGACTTTCCACCTAT-GGGAC-3′。D3s1298为P1:5′-AGCTCTCAGTGCCAC-CCC-3′和P2:5′-GAAAAATCCCCTGTGAAGCG-3′，由上海Sangon公司合成。 PCR反应的条件为： 50 μl体系中含MgCl2 2.0 mmol/L, 4×dNTPs (GIBCO BRL 公司)各200 μmol/L,引物各25 pmol/L, 模板DNA 1 μg,Taq酶(北京高登沃德公司) 2.0 U。94℃变性5 min以后,按照94℃30 s,55℃45 s,72℃60 s,反应35个循环, 最后72℃延伸10 min。聚丙烯酰胺(PAGE)电泳及银染方法同文献[3]。
5.结果判断:将同一患者加速期或急变期标本与其慢性期标本的PCR扩增产物同时上样进行电泳,对加速或急变期的PCR扩增产物的电泳条带与其慢性期的条带进行比较,若出现某一位置条带消失或相对密度减少50%以上,则计为LOH;若出现某一位置条带增加或位置发生改变,计为MSI[3，7]。阳性病例均经2次以上PCR扩增证实。
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结果
1.为进一步对本组研究的CML患者进行确认，我们检测了所有CML患者的Ph染色体和bcr-abl融合基因。结果18例患者均存在Ph染色体，bcr-abl融合基因也均为阳性,其中融合型为b2a2的有7例,是由bcr基因中BCR区域内的exon2(bcr2)与abl基因exon2(abl2)拼接而成的; b3a2的有11例,是由bcr基因中BCR区域内的exon3(bcr3)与abl基因的exon2(abl2)拼接而成的(表1)。
表1 18例CML患者的临床资料及微卫星D2s123和D3s1298的检测结果 病例
性别/
年龄
间隔
(月)
, 百拇医药
病程
Ph
染色体
bcr-abl
融合型
微卫星遗传不稳定性
D2s123
D3s1298
1
M/38
45
加速期
+
, 百拇医药
b3a2
-
-
2
F/44
25
加速期
+
b3a2
LOH
-
3
M/30
31
, 百拇医药
加速期
+
b3a2
-
-
4
F/42
60
加速期
+
b2a2
-
-
5
, http://www.100md.com
M/70
54
加速期
+
b2a2
-
-
6
F/48
72
加速期
+
b3a2
-
, http://www.100md.com
-
7
M/23
55
加速期
+
b2a2
-
-
8
M/42
43
加速期
+
, 百拇医药
b3a2
-
-
9
F/18
21
急粒变
+
b3a2
LOH
-
10
M/64
75
, 百拇医药
急粒变
+
b2a2
MSI
-
11
M/32
15
急粒变
+
b3a2
-
-
12
, 百拇医药
F/56
39
急粒变
+
b3a2
-
-
13
F/38
76
急粒变
+
b2a2
, 百拇医药 -
-
14
F/20
50
急粒变
+
b2a2
-
MSI
15
M/50
26
急单变
, http://www.100md.com
+
b3a2
-
-
16
M/42
37
急单变
+
b3a2
-
-
17
M/44
, http://www.100md.com
84
急巨变
+
b3a2
-
-
18
M/40
48
急粒变
+
b2a2
-
MSI
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阳性率
16.7%
11.1%
注：M.男性; F.女性; +.阳性; MSI.微卫星不稳定性; LOH.杂合性缺失;-.无变化
2.基因组DNA D2s123和D3s1298微卫星遗传不稳定性分析: 18例CML加速或急变患者的骨髓标本与其慢性期相比较,有5例患者出现D2s123和 D3s1298微卫星的改变,占总病例的27.8%。其中1例出现在加速期 (占12.5%), 4例出现在急变期(占40%),急变期微卫星改变的频率高于加速期(表1)。
3.3例患者出现D2s123微卫星改变, 其中1例出现在加速期,为LOH; 2例出现在急变期, LOH和MSI各1例(图1)。
, 百拇医药
例2、9为LOH，例10为MSI；M.pBR322/MspI；C.慢性期；A.加速期；B.急变期
图1 3例CML患者出现D2s123微卫星位点的遗传改变
4.2例患者出现D3s1298微卫星改变,均出现在急变期,为MSI(图2)。
注：例14、18均为MSI；M.pBR322/MspI；C.慢性期；B.急变期
图2 2例CML患者出现D3s1298微卫星位点的遗传改变
讨论
错配修复是细胞复制后的一种修复机制，具有维持DNA复制保真度、控制基因变异的作用，对于维持细胞的遗传稳定起重要作用。目前发现的在人类细胞中参与错配修复的基因主要有hMSH2, hMSH3, hMLH1, hPMS1和 hPMS2。其中对hMSH2和hMLH1的研究最多。hMSH2位于2p22-21,是一个重要的错配修复基因, 其产物起着识别DNA的错配并启动修复反应的作用。hMLH1位于3p21.3-23，其产物与hMSH2 基因产物相结合，共同促成修复反应。 错配修复基因的突变将降低DNA复制的保真度,并导致微卫星DNA的遗传不稳定性和基因的遗传变异。研究发现, 分别有60%和30%的非家族性息肉型结肠癌与hMSH2和hMLH1的突变有关[8，9]。另外,在散发性胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌和神经胶质瘤以及成人急性白血病中也检测到hMSH2和 hMLH1基因的突变或异常表达[10]。
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微卫星DNA是1～6个核苷酸的重复序列,广泛分布于整个人类基因组中。微卫星重复序列的遗传改变可激活特定的原癌基因或失活抑癌基因,导致癌变的发生和发展。由复制/修复错误所导致的微卫星遗传改变已经在多种HNPCC及相关肿瘤中得到证实。我们曾报道分别有35.3%和11.8%的CML患者在加速急变过程中出现微卫星DCC基因和Mfd41的遗传改变[3]。微卫星D2s123和D3s1298分别与错配修复基因hMSH2及hMLH1连锁[8，9]。Macdonald 等报道在肝癌的发生过程中有19.6%的病例在hMSH2及hMLH1基因位点出现微卫星DNA的遗传改变[11]。本组结果提示错配修复基因连锁的D2s123和D3s1298微卫星与CML的进展可能有一定的相关性。
值得指出的是,本组有1例患者(例10)我们曾在其加速期检出微卫星DCC发生改变, 9个月之后发生急变,又出现微卫星D2s123的改变, 此间该患者经临床检查确诊患有结肠癌和膀胱癌。提示多个微卫星的遗传改变可能参与该患者的临床进展。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570322)
参考文献：
1 Jiricny J. Mismatch repair and cancer. Cancer Surv, 1996, 28:47-68.
2 Speicher MR. Microsatellite instability in human cancer. Oncol Res, 1995, 7:267-275.
3 李戈,宋玉华,钱林生，等.微卫星Mfd41和DCC的遗传不稳定性与慢性粒细胞白血病病程发展关系的研究.中华血液学杂志, 1998,19:405-408.
4 李戈,宋玉华,马小彤,等.不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究.实验血液学杂志, 1996,4:290-293.
, http://www.100md.com
5 Spurr NK, Naylor S. Report of the second international workshop on human chromosome 2 mapping 1992. Cytogenet.Cell Genet, 1993, 64:69-92.
6 Naylor SL, Buys CHCM, Carritt B. Report of the fourth international workshop on human chromosome 3 mapping 1993. Cytogenet. Cell Genet, 1994, 65:1-50.
7 Wada C, Shionoya S, Fujino Y, et al. Genomic instability of microsatellite repeats and its association with the evolution of chronic myelogenous leukemia. Blood, 1994, 83:3449-3453.
, 百拇医药
8 Fishel R,Lescoe MK, Rao MRS, et al. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell, 1993, 75:1027-1038.
9 Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, et al. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature, 1994,368:258-261.
10 Zhu YM, das Gupta EP, Russell NH, et al. Microsatellite instability and p53 mutations are associated with abnormal expression of the MSH2 gene in adult acute leukemia. Blood, 1999, 94:733-740.
11 Macdonald GA, Greenson JK, Saito K, et al. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at DNA mismatch repair gene loci occurs during hepatic carcinogenesis. Hepatology, 1998, 28: 90-97.
收稿日期：1999-04-01, 百拇医药
单位：(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所 300020 天津)
关键词：白血病，髓样，慢性；DNA突变分析
中华医学杂志000307摘 要：目的 探讨错配修复基因连锁的微卫星DNA的遗传改变与慢性粒细胞白血病(CML)加速急变之间的关系。方法 采用PCR-银染方法对18例CML患者加速期或急变期的骨髓细胞与其慢性期进行比较。结果 5例CML患者中出现D2s123和 D3s1298微卫星的改变,占27.8%, 其中1例出现在加速期,4例出现在急变期。3例患者D2s123微卫星发生改变, 1例出现在加速期,为等位基因微卫星序列的杂合性缺失; 2例出现在急变期, 杂合性缺失和微卫星遗传不稳定性各1例。2例患者D3s1298微卫星发生改变,出现在急变期,均为微卫星遗传不稳定性。结论 与错配修复基因连锁的微卫星DNA的遗传改变可能与部分CML患者的加速急变有一定的关系。
, 百拇医药
The genetic instability of mismatch repair gene linked microsatellite and the evolution of CML
LI Ge SONG Yuhua QIAN Linsheng, et al.
(Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China)
Abstract：Objective To explore the relationship between the genetic instability of microsatellite linked with mismatch repair gene and the evolution of CML to blast crisis. Methods The loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MSI) of two polymorphic microsatellite markers, D2s123 and D3s1298, linked with mismatch repair gene hMSH2 and hMLH1 respectively, were detected by PCR-silver staining method on the bone marrow cells of 18 CML patients, who clinically progressed from the chronic phase to accelerated phase or blast crisis. Results Differences in microsatellite D2s123 and D3s1298 at the CML accelerated phase or blast crisis in 5 (27.8%) of the 18 patients were demonstrated compared with chronic phase. For D2s123, MSI and LOH were observed in 1 of 8 patients with accelerated phase (12.5%) and 2 of 10 patients in blast crisis (20%). For D3s1298, MSI and LOH were observed in 2 of 10 patients in blast crisis (20%). Conclusion The genetic alteration of microsatellite D2s123 and D3s1298 may play a role in the progress of some CML cases.
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Key words：Leukemia, myeloid, chronic; DNA mutational analysis
错配修复基因 (mismatch repair gene) 是一组高度保守的看家基因, 参与细胞复制后的错配修复，对于维持微卫星序列的遗传稳定有重要作用[1]。近年来的研究表明, 肿瘤的发生、发展与基因组微卫星DNA的遗传不稳定性(MSI) 和等位基因微卫星序列的杂合性缺失(LOH)有关[2]。但与错配修复基因相连锁微卫星DNA的遗传改变与慢性粒细胞白血病(CML)急性变的关系尚少见报道。我们用多聚酶链反应 (PCR)-银染方法对与错配修复基因hMSH2 (human mut S homologue-2) 和hMLH1 (human mut L homologue-1)连锁的微卫星D2s123及D3s1298在CML患者加速、急变过程的变化情况与其慢性期进行了比较研究。
对象与方法
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一、对象
中国医学科学院血液病医院按FAB分型标准确诊的CML患者18例, 其中男11例,女7例。患者年龄从18岁到70岁,中位年龄42岁。从慢性期发展到加速期或急变期的时间间隔为21个月至84个月,中位间隔47个月。
二、方法
1.DNA提取:采用改良酚抽提法。按本室常规方法患者慢性期标本从Wright's染色骨髓涂片上提取基因组DNA,加速期和急变期标本从新鲜骨髓中提取基因组DNA[3]。
2.细胞遗传学检测：采用常规G-带法检测Ph染色体。
3.bcr-abl融合基因的检测:由t(9:22)(q34,q11)形成的bcr-abl融合基因按本室常规采用RT-PCR方法检测[4]。
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4.微卫星遗传不稳定性分析:微卫星引物序列参照文献[5，6]:D2s123为P1:5′-AAACAGGAT-GCCTGCCTTTA-3′和P2:5′-GGACTTTCCACCTAT-GGGAC-3′。D3s1298为P1:5′-AGCTCTCAGTGCCAC-CCC-3′和P2:5′-GAAAAATCCCCTGTGAAGCG-3′，由上海Sangon公司合成。 PCR反应的条件为： 50 μl体系中含MgCl2 2.0 mmol/L, 4×dNTPs (GIBCO BRL 公司)各200 μmol/L,引物各25 pmol/L, 模板DNA 1 μg,Taq酶(北京高登沃德公司) 2.0 U。94℃变性5 min以后,按照94℃30 s,55℃45 s,72℃60 s,反应35个循环, 最后72℃延伸10 min。聚丙烯酰胺(PAGE)电泳及银染方法同文献[3]。
5.结果判断:将同一患者加速期或急变期标本与其慢性期标本的PCR扩增产物同时上样进行电泳,对加速或急变期的PCR扩增产物的电泳条带与其慢性期的条带进行比较,若出现某一位置条带消失或相对密度减少50%以上,则计为LOH;若出现某一位置条带增加或位置发生改变,计为MSI[3，7]。阳性病例均经2次以上PCR扩增证实。
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结果
1.为进一步对本组研究的CML患者进行确认，我们检测了所有CML患者的Ph染色体和bcr-abl融合基因。结果18例患者均存在Ph染色体，bcr-abl融合基因也均为阳性,其中融合型为b2a2的有7例,是由bcr基因中BCR区域内的exon2(bcr2)与abl基因exon2(abl2)拼接而成的; b3a2的有11例,是由bcr基因中BCR区域内的exon3(bcr3)与abl基因的exon2(abl2)拼接而成的(表1)。
表1 18例CML患者的临床资料及微卫星D2s123和D3s1298的检测结果 病例
性别/
年龄
间隔
(月)
, 百拇医药
病程
Ph
染色体
bcr-abl
融合型
微卫星遗传不稳定性
D2s123
D3s1298
1
M/38
45
加速期
+
, 百拇医药
b3a2
-
-
2
F/44
25
加速期
+
b3a2
LOH
-
3
M/30
31
, 百拇医药
加速期
+
b3a2
-
-
4
F/42
60
加速期
+
b2a2
-
-
5
, http://www.100md.com
M/70
54
加速期
+
b2a2
-
-
6
F/48
72
加速期
+
b3a2
-
, http://www.100md.com
-
7
M/23
55
加速期
+
b2a2
-
-
8
M/42
43
加速期
+
, 百拇医药
b3a2
-
-
9
F/18
21
急粒变
+
b3a2
LOH
-
10
M/64
75
, 百拇医药
急粒变
+
b2a2
MSI
-
11
M/32
15
急粒变
+
b3a2
-
-
12
, 百拇医药
F/56
39
急粒变
+
b3a2
-
-
13
F/38
76
急粒变
+
b2a2
, 百拇医药 -
-
14
F/20
50
急粒变
+
b2a2
-
MSI
15
M/50
26
急单变
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+
b3a2
-
-
16
M/42
37
急单变
+
b3a2
-
-
17
M/44
, http://www.100md.com
84
急巨变
+
b3a2
-
-
18
M/40
48
急粒变
+
b2a2
-
MSI
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阳性率
16.7%
11.1%
注：M.男性; F.女性; +.阳性; MSI.微卫星不稳定性; LOH.杂合性缺失;-.无变化
2.基因组DNA D2s123和D3s1298微卫星遗传不稳定性分析: 18例CML加速或急变患者的骨髓标本与其慢性期相比较,有5例患者出现D2s123和 D3s1298微卫星的改变,占总病例的27.8%。其中1例出现在加速期 (占12.5%), 4例出现在急变期(占40%),急变期微卫星改变的频率高于加速期(表1)。
3.3例患者出现D2s123微卫星改变, 其中1例出现在加速期,为LOH; 2例出现在急变期, LOH和MSI各1例(图1)。
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例2、9为LOH，例10为MSI；M.pBR322/MspI；C.慢性期；A.加速期；B.急变期
图1 3例CML患者出现D2s123微卫星位点的遗传改变
4.2例患者出现D3s1298微卫星改变,均出现在急变期,为MSI(图2)。
注：例14、18均为MSI；M.pBR322/MspI；C.慢性期；B.急变期
图2 2例CML患者出现D3s1298微卫星位点的遗传改变
讨论
错配修复是细胞复制后的一种修复机制，具有维持DNA复制保真度、控制基因变异的作用，对于维持细胞的遗传稳定起重要作用。目前发现的在人类细胞中参与错配修复的基因主要有hMSH2, hMSH3, hMLH1, hPMS1和 hPMS2。其中对hMSH2和hMLH1的研究最多。hMSH2位于2p22-21,是一个重要的错配修复基因, 其产物起着识别DNA的错配并启动修复反应的作用。hMLH1位于3p21.3-23，其产物与hMSH2 基因产物相结合，共同促成修复反应。 错配修复基因的突变将降低DNA复制的保真度,并导致微卫星DNA的遗传不稳定性和基因的遗传变异。研究发现, 分别有60%和30%的非家族性息肉型结肠癌与hMSH2和hMLH1的突变有关[8，9]。另外,在散发性胰腺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌和神经胶质瘤以及成人急性白血病中也检测到hMSH2和 hMLH1基因的突变或异常表达[10]。
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微卫星DNA是1～6个核苷酸的重复序列,广泛分布于整个人类基因组中。微卫星重复序列的遗传改变可激活特定的原癌基因或失活抑癌基因,导致癌变的发生和发展。由复制/修复错误所导致的微卫星遗传改变已经在多种HNPCC及相关肿瘤中得到证实。我们曾报道分别有35.3%和11.8%的CML患者在加速急变过程中出现微卫星DCC基因和Mfd41的遗传改变[3]。微卫星D2s123和D3s1298分别与错配修复基因hMSH2及hMLH1连锁[8，9]。Macdonald 等报道在肝癌的发生过程中有19.6%的病例在hMSH2及hMLH1基因位点出现微卫星DNA的遗传改变[11]。本组结果提示错配修复基因连锁的D2s123和D3s1298微卫星与CML的进展可能有一定的相关性。
值得指出的是,本组有1例患者(例10)我们曾在其加速期检出微卫星DCC发生改变, 9个月之后发生急变,又出现微卫星D2s123的改变, 此间该患者经临床检查确诊患有结肠癌和膀胱癌。提示多个微卫星的遗传改变可能参与该患者的临床进展。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570322)
参考文献：
1 Jiricny J. Mismatch repair and cancer. Cancer Surv, 1996, 28:47-68.
2 Speicher MR. Microsatellite instability in human cancer. Oncol Res, 1995, 7:267-275.
3 李戈,宋玉华,钱林生，等.微卫星Mfd41和DCC的遗传不稳定性与慢性粒细胞白血病病程发展关系的研究.中华血液学杂志, 1998,19:405-408.
4 李戈,宋玉华,马小彤,等.不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究.实验血液学杂志, 1996,4:290-293.
, http://www.100md.com
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6 Naylor SL, Buys CHCM, Carritt B. Report of the fourth international workshop on human chromosome 3 mapping 1993. Cytogenet. Cell Genet, 1994, 65:1-50.
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收稿日期：1999-04-01, 百拇医药