免疫毒素去除脐血T细胞效率及对造血祖细胞的影响
作者：许蔓春 吕善根 沈倍奋 黎燕
单位：100853 北京，解放军总医院小儿内科[许蔓春(现在 510010 广州军区广州总医院小儿科)、吕善根]；军事医学科学院分子免疫室(沈倍奋、黎燕)
关键词：胎血；免疫毒素类；T淋巴细胞；造血干细胞
中华儿科杂志/980317
【摘要】 目的 探讨抗T细胞免疫毒素(immunotoxin, IT)体外对脐血T细胞的清除效率及对造血干/祖细胞的影响。方法 (1)用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术法(APAAP)分别测定了脐血、骨髓、外周血标本CD+5、CD+8 T细胞的百分率；(2)用单向混合淋巴细胞培养(MLC)方法比较了外周血与脐血MLC增殖反应；(3)分别用MLC法和噻唑蓝(MTT)比色法，观察了两组抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体(CD+5、CD+8)与完整蓖麻毒素(Ricin)偶联制备的两组免疫毒素(CD5：Ricin、CD8：Ricin) 对脐血T细胞增殖反应及对T淋巴细胞转化功能抑制的影响；(4)用造血祖细胞培养的方法观察两组免疫毒素对脐血粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)及混合系祖细胞(CFU-Mix)的影响。 结果(1)脐血含有一定比例的CD+5及CD+8 T细胞亚群；(2)在MLC中外周血与脐血对异源抗原的增殖反应相似；(3) CD5：Ricin 10-10～10-8 mmol/L (M)、CD8：Ricin在10-9～10-8mmol/L浓度范围内均能有效降低脐血T淋巴细胞在MLC中的增殖反应，并能有效抑制T淋巴细胞转化功能；(4)两组IT在10-10～10-9mmol/L浓度下对三种造血祖细胞增殖反应无明显影响。结论 CD5:Ricin、CD8:Ricin在一定剂量范围内可以安全有效地去除脐血中T细胞，并且对造血祖细胞无明显影响。
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Effects of immunotoxin on the depletion of T cells and on hematopoietic progenitor cells in human cord blood
Xu Manchun, L
Shangen, Shen Beifen, et al.
* Department of Pediatrics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the selective toxicity of immunotoxin (IT) on T cells and to determine its effect on hematopoietic progenitor cells. Methods The percentage of CD+5 and CD+8 T cell subsets in cord blood (CB) and bone marrow (BM) as well as peripheral blood (PB) was measured by using alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP) technique. One-way mixed lymphocyte culture (MLC) was performed to compare the proliferative response of CB with that of PB. The proliferative capability of cord blood T cells and T lymphocytes transformation capacity were evaluated in the presence of anti-CD8 or anti-CD5 immunotoxin by one-way MLC and colorimetric MTT (tetrazolium) assay, respectively. The effects of IT on the growth of hematopoietic progenitor cells of colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM), burst forming unit-erythroid (BFU-E) and multipotential hematopoietic progenitors (CFU-Mix) from CB were estimated by colony-forming assays. Results (1) A certain proportion of CD+5 and CD+8 T cells existed in CB. (2) The alloproliferative capacity of CB was the same as that of PB. (3) CD5:Ricin at the dosage of 10-10～10-8 mmol/L (M) and CD8:Ricin at the range of 10-9～10-8 M could effectively decrease both the proliferative capability of CB and T cell transformation. (4) At the range of 10-10～10-9 M, both kinds of IT didn′t affect the growth of hematopoietic progenitor cells. Conclusion Graft versus host disease (GVHD) might occur after cord blood transplantation (CBT). CD5:Ricin and CD8:Ricin might effictively deplete T cell and might potentially be used to decrease and prevent GVHD in HLA-mismatched related and unrelated CBT.
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【Key words】 Fetal blood Immunotoxins T-lymphocytes Hemotopoietic stem cells
脐血是造血干细胞移植的又一重要供源。脐血移植(CBT)亦可发生不同程度的移植物抗宿主病(GVHD)，尤其是人类白细胞抗原(HLA)配型不合的CBT[1]。已知GVHD与T细胞的数量和特性有极密切的关系。在异基因骨髓移植(BMT)中采用抗T细胞免疫毒素能安全有效地去除骨髓中T细胞，并已取得了预防和减轻重度GVHD的效果[2]。但有关用免疫毒素去除脐血T细胞的研究在国内外尚未见报道。对此，我们进行了一些研究，现报告如下。
材料和方法
一、标本
1.脐血：采自正常分娩的健康产妇，胎盘未脱离母体前在脐带断端留取标本(5份)，后加肝素25 U/ml抗凝。
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2.外周血：采自健康献血员新鲜静脉血(4份)。
3.骨髓：采自胸外科手术切除的非病理性肋骨(3份)。
二、主要试剂及材料
抗CD5、抗CD8单抗与蓖麻毒素(Ricin)组成的抗T细胞免疫毒素(CD5：Ricin, CD8:Ricin)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)均为军事医学科学院三所分子免疫室研制；促红细胞生成素(EPO)为日本Toyobo公司产品；噻唑蓝(MTT)为Servar公司产品；3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)为中国原子能研究所生产；植物血凝素(PHA-P)、2-巯基乙醇(2-ME)：购自Sigma公司；碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)试剂盒由北京帮定生物医学公司提供。
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三、实验方法
1.APAAP法测脐血、外周血、骨髓中CD+5、CD+8 T细胞亚群。
2.单向混合淋巴细胞(MLC)方法：按参考文献[3]的方法；免疫毒素去除T细胞的方法：按参考文献[4]的方法。MLC实验结果分别以每分钟脉冲数(cpm)、刺激指数(SI)值、相对反应(RR)值及增加cpm(Δcpm)表示。
Δcpm=实验组平均cpm-对照组培养cpm
以未用免疫毒素(IT)为对照组的增殖反应率为100%，经IT作用后：
残留T细胞增殖反应率=
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3.MTT法测定脐血T淋巴细胞转化功能：参考文献[5]。T淋巴细胞转化功能以SI值表示：
以未用IT为对照组的T淋巴细胞转化功能为100%，则：
IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制率=
4.造血细胞培养：经不同浓度免疫毒素处理后的脐血单个核细胞分别做粒单系祖细胞(CFU-GM)培养、早期红系祖细胞(BFU-E)培养：按参考文献[4]的方法及混合系祖细胞(CFU-Mix)培养：按参考文献[6]的方法。以未用IT为对照组的造血祖细胞增殖率为100%，经IT处理后：
造血祖细胞增殖率=
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5.统计学处理：实验数据以平均数±标准差(
±s)、中位数(M)表示；两组比较采用t检验；方差不齐用秩和检验；多组比较采用F检验。
结果
一、脐血CD+5、CD+8细胞含量与外周血、骨髓比较
我们观察脐血(5份)、外周血(4份)和骨髓(3份)的CD+5、CD+8细胞的百分率，结果脐血分别为47.0±7.6和19.9±5.1；外周血分别为59.4±7.2和23.9±3.3；骨髓分别为12.9±2.1和5.9±3.1。三组比较经F检验，P<0.01。提示脐血中含有一定比例的CD+5、CD+8细胞，其含量低于外周血，高于骨髓。
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二、脐血与外周血在单向MLC中增殖反应的比较
在MLC中，以RR值或Δcpm表示，经秩和检验脐血增殖反应与外周血无统计学差异。而脐血SI值低于外周血，差异有显著意义。原因是SI值易受自身对照增殖反应的影响，在MLC中，脐血自身cpm(5 815±3 053，中位数5 786)明显高于外周血cpm(2 035±1 644，中位数1 687)，秩和检验u=2.8, P<0.01。因此结果提示脐血与外周血有同样的增殖反应能力(表1)。
三、在MLC中观察IT对脐血T细胞增殖反应的影响
通过MLC观察了2组IT分别在10-10、10-9、10-8 mmol/L剂量下对14份脐血T细胞增殖反应
表1 脐血与外周血的单向MLC结果比较 组别
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份数
RR(%)
SI
Δcpm
M±s
M±s
M±s
对照组
14
74
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69±25
25
35±27
39 808
43 551±24 014
实验组
19
70
66±24
9
10± 5
39 116
43 647±18 137
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u值
0.57
3.46*
0.25
注：两组间比较用秩和检验，* P<0.01，M为中位数；表中对照组为外周血+外周血，实验组为脐血+外周血表2 不同浓度IT对脐血MLC增殖反应率的影响(%) IT
份
数
10-10(mmol/L)
10-9(mmol/L)
10-8(mmol/L)
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F值
M±s
M±s
M±s
CD5：
Ricin
14
23.5
23± 8
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1.0
1.1±1.0
0.6
0.6±0.4
121.8*
CD8：Ricin
14
76.0
77±11
21.6
24.0±9.9
0.4
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0.5±0.3
314.0*
u值
4.64**
4.64**
0.39
注：三组间比较F检验：* P<0.01；两组间比较秩和检验 ** P<0.01；M为中位数表3 IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制(±s，%) 免疫毒素
份
数
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T细胞转化功能抑制率
10-10
(mmol/L)
10-9
(mmol/L)
10-8
(mmol/L)
F值
CD5：Ricin
12
55±12
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85± 4
90±5
4.8*
CD8：Ricin
14
22± 8
52±18
82±8
56.0**
t值
8.46△
6.33△
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3.12△
注：三组间比较F检验，* P<0.05，** P<0.01；两组间比较t检验，△ P<0.01表4 不同浓度IT对造血祖细胞CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix增殖反应的影响(±s，%) 浓度
(mmol/L)
CFU-GM (n=10)
BFU-E (n=10)
CFU-Mix (n=6)
Ⅰ
Ⅱ
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t值
Ⅰ
Ⅱ
t值
Ⅰ
Ⅱ
t值
10-10
92± 6
100±10
2.27*
89± 4
83± 4
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93± 5
3.79**
10-9
81± 8
94± 4
2.50*
78± 7
90± 8
3.55**
73± 7
85± 9
2.52*
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10-8
52±13
65±14
2.10*
46±12
59±14
2.22*
30±14
45±12
2.00
F值
33.1△
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25.21△
52.96△
6.0(t)△
66.1△
48.8△
注：Ⅰ、Ⅱ分别为CD5：Ricin、CD8：Ricin；n为每组样本数；t为t检验值两组间比较t检验，* P<0.05，** P<0.01；三组间比较，△ P<0.01的影响。 表2显示：CD5:Ricin在10-10～10-8 mmol/L、CD8:Ricin在10-9～10-8 mmol/L均能有效抑制脐血T细胞增殖反应(平均抑制率为76%以上，残留T细胞增殖反应率在24%以下)；同时随着IT浓度的增加，对脐血T细胞增殖反应的抑制作用增强，残留T细胞增殖反应率下降。除10-8 mmol/L外，在相同浓度下(10-10或10-9 mmol/L)，CD5:Ricin作用效果显著强于CD8:Ricin。
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四、MTT法观察IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制
观察了2组IT分别在不同剂量下对12～14份脐血T淋巴细胞转化功能的抑制。
表3显示：CD5:Ricin在10-10～10-8 mmol/L、CD8:Ricin在10-9～10-8 mmol/L能有效抑制脐血T淋巴细胞转化功能(平均抑制率大于50%)。随着IT浓度增加，其对T淋巴细胞转化功能抑制增强。相同剂量下CD5:Ricin对T淋巴细胞转化功能抑制作用显著强于CD8:Ricin。
五、观察2种IT在不同浓度下分别对CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix增殖反应的影响
表4结果显示：(1)在10-9～10-10 mmol/L范围内，两组IT分别对三种造血祖细胞无明显的抑制作用，增殖率均大于70%。(2)两组IT的抑制作用均随着IT浓度增加而增强。(3)在相同剂量下，CD5:Ricin的抑制作用均强于CD8：Ricin，除在10-8 mmol/L浓度下，对CFU-Mix的抑制作用无统计学差异外，其余均有显著意义的差异。
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此外，我们还初步观察了IT对CD+34细胞的影响，结果与上述情况相同。
综上所述，CD5：Ricin在10-10～10-9mmol/L、CD8：Ricin在10-9 mmol/L，均能有效抑制脐血T细胞增殖反应及T淋巴细胞转化功能，而对三种造血祖细胞无显著非特异毒性作用。本研究中IT剂量可作为临床CBT中去T细胞时的参考。
讨论
一、脐血与外周血在MLC中增殖反应的比较
MLC是骨髓移植前进行HLA组织配型的传统方法之一，用以检测供、受者的淋巴细胞Ⅱ类抗原表型相容的程度。MLC的观察指标以SI或RR为代表，由于SI值受自身刺激指数的影响，目前多用RR表示。国内一般以RR值大于10%为标准，超过上述值则被认为不相合，从而有可能发生GVHD。在无关供者选择中，MLC的结果(RR值)与GVHD发生有一定的相关性，能预测GVHD的发生，但不能评估GVHD的严重程度[6]。
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本实验以脐血与外周血作为供者，分别与接受照射的外周血(受者)进行单向MLC(相当于GVHD反应)，受者与供者均为随机来源。结果显示脐血与外周血在单向MLC中的RR值无显著差异，RR均约为65%，说明配型不合脐血与外周血在MLC中能产生同样的增殖反应。这一结果与文献相符[7]，预示配型不合的CBT可能会发生不同程度的GVHD。
二、CD5：Ricin、CD8：Ricin去除脐血T细胞的剂量和效果
近年来的研究结果表明：对于主要组织相溶性复合物(MHC)相合及次要抗原不合的BMT，CD+8 T细胞的去除能有效的预防重症GVHD，并易于植入，且仍保留移植物抗白血病(GVL)。临床报道CD5单克隆抗体免疫毒素可选择性杀伤携带CD5抗原的成熟T细胞保留无CD5抗原的未成熟T细胞，从而预防和减少GVHD发生，又不影响免疫系统发育。因此，我们选用了CD5：Ricin、CD8：Ricin两组免疫毒素，在剂量为10-9 mmol/L时能去除3个对数级T细胞(相当于清除99.9% T细胞)，而对非靶细胞无毒性作用[6]。
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本实验结果还表明，两组IT随着剂量的增加，对T细胞清除效率提高的同时，对造血祖细胞抑制作用也增加，其原因是随着IT浓度的增加，尤其达到10-8 mmol/L时，IT中Ricin的β链产生了非特异细胞毒作用，难于在体外被100 mmol/L浓度的半乳糖完全阻断[8]；其次，在相同剂量的IT作用下，CD5：Ricin的细胞毒作用强于CD8：Ricin。推测其原因：一方面可能是CD5:Ricin去除全部T细胞，而CD8：Ricin去除T细胞亚群。这与黎燕等[4]报道混合抗T免疫毒素(CD5:Ricin、CD27：Ricin及CD2：Ricin)对T细胞转化功能的抑制强于任何一种单一抗T免疫毒素结果相似；另一方面可能与CD8：Ricin去除了抑制脐血造血细胞增殖的T细胞亚群有关。这种现象在骨髓移植去除CD+8 T细胞的研究中也有类似报道。此外，CD5：Ricin类似抗OKT1单克隆抗体，当浓度高时与造血祖细胞可能有交叉反应[9]。
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上述结果提示：对于HLA配型不全相合的相关或无关供者的CBT，合理应用CD5:Ricin或CD8：Ricin去除脐血部分成熟T细胞或T细胞亚群，有可能有效预防或减轻重症GVHD发生，从而提高移植成功率。
参考文献
1 Rubinstein P, Carrier C, Adamson J, et al. New York blood center′s program for unrelated placental /umibilical cord blood transplantation 243 transplants in the first 3 years. Blood, 1996, (Suppl 1):142a.
2 沈倍奋，黎燕，贺永怀，等.免疫毒素作用于自体骨髓移植治疗白血病的实验研究及初步临床.单克隆抗体通讯，1991，7：6-10.
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3 Mickelson EM, Longton G, Anasetti E, et al. Evaluation of the mixed lymphocyte culture (MLC) assay as a method for selecting unrelated donors for marrow transplantation. Tissue Antigens, 1996, 47:27-36.
4 黎燕，沈倍奋，陈兴，等.抗T免疫毒素对骨髓T细胞清除效应及对造血祖细胞的影响.中国免疫学杂志，1989，5：197-200.
5 Mosman T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-63.
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6 黎燕，贺永怀，陈兴，等.CD9、CD8单克隆抗体免疫毒素对白血病细胞的清除效率及对造血细胞的影响.中国免疫学杂志，1991，7：303-306.
7 Keever CA, Abu-Hajir M, Graf W, et al. Characterization of the alloreactivity and anti-leukemia reactivity of cord blood mononuclears cells. Bone Marrow Transplant, 1995, 15:407-419.
8 沈倍奋，姚志健，张建宗，等.免疫毒素Ⅱ抗人T细胞单克隆抗体和蓖麻毒素结合物的制备及其细胞毒性质.中华微生物和免疫杂志，1985，5：209-213.
9 Champlin R, Jansen J, Ho W, et al. Retention of graft-versus-leukemia using selective depletion of CD8 positive T lymphocytes for prevention of graft-versus-host disease following bone marrow transplantation for chronic myelogenous leukemia. Transplant Proc, 1991, 23:1695-1696., 百拇医药
单位：100853 北京，解放军总医院小儿内科[许蔓春(现在 510010 广州军区广州总医院小儿科)、吕善根]；军事医学科学院分子免疫室(沈倍奋、黎燕)
关键词：胎血；免疫毒素类；T淋巴细胞；造血干细胞
中华儿科杂志/980317
【摘要】 目的 探讨抗T细胞免疫毒素(immunotoxin, IT)体外对脐血T细胞的清除效率及对造血干/祖细胞的影响。方法 (1)用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术法(APAAP)分别测定了脐血、骨髓、外周血标本CD+5、CD+8 T细胞的百分率；(2)用单向混合淋巴细胞培养(MLC)方法比较了外周血与脐血MLC增殖反应；(3)分别用MLC法和噻唑蓝(MTT)比色法，观察了两组抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体(CD+5、CD+8)与完整蓖麻毒素(Ricin)偶联制备的两组免疫毒素(CD5：Ricin、CD8：Ricin) 对脐血T细胞增殖反应及对T淋巴细胞转化功能抑制的影响；(4)用造血祖细胞培养的方法观察两组免疫毒素对脐血粒单系祖细胞(CFU-GM)、早期红系祖细胞(BFU-E)及混合系祖细胞(CFU-Mix)的影响。 结果(1)脐血含有一定比例的CD+5及CD+8 T细胞亚群；(2)在MLC中外周血与脐血对异源抗原的增殖反应相似；(3) CD5：Ricin 10-10～10-8 mmol/L (M)、CD8：Ricin在10-9～10-8mmol/L浓度范围内均能有效降低脐血T淋巴细胞在MLC中的增殖反应，并能有效抑制T淋巴细胞转化功能；(4)两组IT在10-10～10-9mmol/L浓度下对三种造血祖细胞增殖反应无明显影响。结论 CD5:Ricin、CD8:Ricin在一定剂量范围内可以安全有效地去除脐血中T细胞，并且对造血祖细胞无明显影响。
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Effects of immunotoxin on the depletion of T cells and on hematopoietic progenitor cells in human cord blood
Xu Manchun, L
Shangen, Shen Beifen, et al.* Department of Pediatrics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the selective toxicity of immunotoxin (IT) on T cells and to determine its effect on hematopoietic progenitor cells. Methods The percentage of CD+5 and CD+8 T cell subsets in cord blood (CB) and bone marrow (BM) as well as peripheral blood (PB) was measured by using alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP) technique. One-way mixed lymphocyte culture (MLC) was performed to compare the proliferative response of CB with that of PB. The proliferative capability of cord blood T cells and T lymphocytes transformation capacity were evaluated in the presence of anti-CD8 or anti-CD5 immunotoxin by one-way MLC and colorimetric MTT (tetrazolium) assay, respectively. The effects of IT on the growth of hematopoietic progenitor cells of colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM), burst forming unit-erythroid (BFU-E) and multipotential hematopoietic progenitors (CFU-Mix) from CB were estimated by colony-forming assays. Results (1) A certain proportion of CD+5 and CD+8 T cells existed in CB. (2) The alloproliferative capacity of CB was the same as that of PB. (3) CD5:Ricin at the dosage of 10-10～10-8 mmol/L (M) and CD8:Ricin at the range of 10-9～10-8 M could effectively decrease both the proliferative capability of CB and T cell transformation. (4) At the range of 10-10～10-9 M, both kinds of IT didn′t affect the growth of hematopoietic progenitor cells. Conclusion Graft versus host disease (GVHD) might occur after cord blood transplantation (CBT). CD5:Ricin and CD8:Ricin might effictively deplete T cell and might potentially be used to decrease and prevent GVHD in HLA-mismatched related and unrelated CBT.
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【Key words】 Fetal blood Immunotoxins T-lymphocytes Hemotopoietic stem cells
脐血是造血干细胞移植的又一重要供源。脐血移植(CBT)亦可发生不同程度的移植物抗宿主病(GVHD)，尤其是人类白细胞抗原(HLA)配型不合的CBT[1]。已知GVHD与T细胞的数量和特性有极密切的关系。在异基因骨髓移植(BMT)中采用抗T细胞免疫毒素能安全有效地去除骨髓中T细胞，并已取得了预防和减轻重度GVHD的效果[2]。但有关用免疫毒素去除脐血T细胞的研究在国内外尚未见报道。对此，我们进行了一些研究，现报告如下。
材料和方法
一、标本
1.脐血：采自正常分娩的健康产妇，胎盘未脱离母体前在脐带断端留取标本(5份)，后加肝素25 U/ml抗凝。
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2.外周血：采自健康献血员新鲜静脉血(4份)。
3.骨髓：采自胸外科手术切除的非病理性肋骨(3份)。
二、主要试剂及材料
抗CD5、抗CD8单抗与蓖麻毒素(Ricin)组成的抗T细胞免疫毒素(CD5：Ricin, CD8:Ricin)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)均为军事医学科学院三所分子免疫室研制；促红细胞生成素(EPO)为日本Toyobo公司产品；噻唑蓝(MTT)为Servar公司产品；3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)为中国原子能研究所生产；植物血凝素(PHA-P)、2-巯基乙醇(2-ME)：购自Sigma公司；碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)试剂盒由北京帮定生物医学公司提供。
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三、实验方法
1.APAAP法测脐血、外周血、骨髓中CD+5、CD+8 T细胞亚群。
2.单向混合淋巴细胞(MLC)方法：按参考文献[3]的方法；免疫毒素去除T细胞的方法：按参考文献[4]的方法。MLC实验结果分别以每分钟脉冲数(cpm)、刺激指数(SI)值、相对反应(RR)值及增加cpm(Δcpm)表示。
Δcpm=实验组平均cpm-对照组培养cpm
以未用免疫毒素(IT)为对照组的增殖反应率为100%，经IT作用后：
残留T细胞增殖反应率=
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3.MTT法测定脐血T淋巴细胞转化功能：参考文献[5]。T淋巴细胞转化功能以SI值表示：
以未用IT为对照组的T淋巴细胞转化功能为100%，则：
IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制率=
4.造血细胞培养：经不同浓度免疫毒素处理后的脐血单个核细胞分别做粒单系祖细胞(CFU-GM)培养、早期红系祖细胞(BFU-E)培养：按参考文献[4]的方法及混合系祖细胞(CFU-Mix)培养：按参考文献[6]的方法。以未用IT为对照组的造血祖细胞增殖率为100%，经IT处理后：
造血祖细胞增殖率=
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5.统计学处理：实验数据以平均数±标准差(
±s)、中位数(M)表示；两组比较采用t检验；方差不齐用秩和检验；多组比较采用F检验。结果
一、脐血CD+5、CD+8细胞含量与外周血、骨髓比较
我们观察脐血(5份)、外周血(4份)和骨髓(3份)的CD+5、CD+8细胞的百分率，结果脐血分别为47.0±7.6和19.9±5.1；外周血分别为59.4±7.2和23.9±3.3；骨髓分别为12.9±2.1和5.9±3.1。三组比较经F检验，P<0.01。提示脐血中含有一定比例的CD+5、CD+8细胞，其含量低于外周血，高于骨髓。
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二、脐血与外周血在单向MLC中增殖反应的比较
在MLC中，以RR值或Δcpm表示，经秩和检验脐血增殖反应与外周血无统计学差异。而脐血SI值低于外周血，差异有显著意义。原因是SI值易受自身对照增殖反应的影响，在MLC中，脐血自身cpm(5 815±3 053，中位数5 786)明显高于外周血cpm(2 035±1 644，中位数1 687)，秩和检验u=2.8, P<0.01。因此结果提示脐血与外周血有同样的增殖反应能力(表1)。
三、在MLC中观察IT对脐血T细胞增殖反应的影响
通过MLC观察了2组IT分别在10-10、10-9、10-8 mmol/L剂量下对14份脐血T细胞增殖反应
表1 脐血与外周血的单向MLC结果比较 组别
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份数
RR(%)
SI
Δcpm
M
±sM
±sM
±s对照组
14
74
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69±25
25
35±27
39 808
43 551±24 014
实验组
19
70
66±24
9
10± 5
39 116
43 647±18 137
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u值
0.57
3.46*
0.25
注：两组间比较用秩和检验，* P<0.01，M为中位数；表中对照组为外周血+外周血，实验组为脐血+外周血表2 不同浓度IT对脐血MLC增殖反应率的影响(%) IT
份
数
10-10(mmol/L)
10-9(mmol/L)
10-8(mmol/L)
, 百拇医药
F值
M
±sM
±sM
±sCD5：
Ricin
14
23.5
23± 8
, 百拇医药
1.0
1.1±1.0
0.6
0.6±0.4
121.8*
CD8：Ricin
14
76.0
77±11
21.6
24.0±9.9
0.4
, 百拇医药
0.5±0.3
314.0*
u值
4.64**
4.64**
0.39
注：三组间比较F检验：* P<0.01；两组间比较秩和检验 ** P<0.01；M为中位数表3 IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制(
±s，%) 免疫毒素份
数
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T细胞转化功能抑制率
10-10
(mmol/L)
10-9
(mmol/L)
10-8
(mmol/L)
F值
CD5：Ricin
12
55±12
, 百拇医药
85± 4
90±5
4.8*
CD8：Ricin
14
22± 8
52±18
82±8
56.0**
t值
8.46△
6.33△
, 百拇医药
3.12△
注：三组间比较F检验，* P<0.05，** P<0.01；两组间比较t检验，△ P<0.01表4 不同浓度IT对造血祖细胞CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix增殖反应的影响(
±s，%) 浓度(mmol/L)
CFU-GM (n=10)
BFU-E (n=10)
CFU-Mix (n=6)
Ⅰ
Ⅱ
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t值
Ⅰ
Ⅱ
t值
Ⅰ
Ⅱ
t值
10-10
92± 6
100±10
2.27*
89± 4
83± 4
, 百拇医药
93± 5
3.79**
10-9
81± 8
94± 4
2.50*
78± 7
90± 8
3.55**
73± 7
85± 9
2.52*
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10-8
52±13
65±14
2.10*
46±12
59±14
2.22*
30±14
45±12
2.00
F值
33.1△
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25.21△
52.96△
6.0(t)△
66.1△
48.8△
注：Ⅰ、Ⅱ分别为CD5：Ricin、CD8：Ricin；n为每组样本数；t为t检验值两组间比较t检验，* P<0.05，** P<0.01；三组间比较，△ P<0.01的影响。 表2显示：CD5:Ricin在10-10～10-8 mmol/L、CD8:Ricin在10-9～10-8 mmol/L均能有效抑制脐血T细胞增殖反应(平均抑制率为76%以上，残留T细胞增殖反应率在24%以下)；同时随着IT浓度的增加，对脐血T细胞增殖反应的抑制作用增强，残留T细胞增殖反应率下降。除10-8 mmol/L外，在相同浓度下(10-10或10-9 mmol/L)，CD5:Ricin作用效果显著强于CD8:Ricin。
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四、MTT法观察IT对脐血T淋巴细胞转化功能的抑制
观察了2组IT分别在不同剂量下对12～14份脐血T淋巴细胞转化功能的抑制。
表3显示：CD5:Ricin在10-10～10-8 mmol/L、CD8:Ricin在10-9～10-8 mmol/L能有效抑制脐血T淋巴细胞转化功能(平均抑制率大于50%)。随着IT浓度增加，其对T淋巴细胞转化功能抑制增强。相同剂量下CD5:Ricin对T淋巴细胞转化功能抑制作用显著强于CD8:Ricin。
五、观察2种IT在不同浓度下分别对CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix增殖反应的影响
表4结果显示：(1)在10-9～10-10 mmol/L范围内，两组IT分别对三种造血祖细胞无明显的抑制作用，增殖率均大于70%。(2)两组IT的抑制作用均随着IT浓度增加而增强。(3)在相同剂量下，CD5:Ricin的抑制作用均强于CD8：Ricin，除在10-8 mmol/L浓度下，对CFU-Mix的抑制作用无统计学差异外，其余均有显著意义的差异。
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此外，我们还初步观察了IT对CD+34细胞的影响，结果与上述情况相同。
综上所述，CD5：Ricin在10-10～10-9mmol/L、CD8：Ricin在10-9 mmol/L，均能有效抑制脐血T细胞增殖反应及T淋巴细胞转化功能，而对三种造血祖细胞无显著非特异毒性作用。本研究中IT剂量可作为临床CBT中去T细胞时的参考。
讨论
一、脐血与外周血在MLC中增殖反应的比较
MLC是骨髓移植前进行HLA组织配型的传统方法之一，用以检测供、受者的淋巴细胞Ⅱ类抗原表型相容的程度。MLC的观察指标以SI或RR为代表，由于SI值受自身刺激指数的影响，目前多用RR表示。国内一般以RR值大于10%为标准，超过上述值则被认为不相合，从而有可能发生GVHD。在无关供者选择中，MLC的结果(RR值)与GVHD发生有一定的相关性，能预测GVHD的发生，但不能评估GVHD的严重程度[6]。
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本实验以脐血与外周血作为供者，分别与接受照射的外周血(受者)进行单向MLC(相当于GVHD反应)，受者与供者均为随机来源。结果显示脐血与外周血在单向MLC中的RR值无显著差异，RR均约为65%，说明配型不合脐血与外周血在MLC中能产生同样的增殖反应。这一结果与文献相符[7]，预示配型不合的CBT可能会发生不同程度的GVHD。
二、CD5：Ricin、CD8：Ricin去除脐血T细胞的剂量和效果
近年来的研究结果表明：对于主要组织相溶性复合物(MHC)相合及次要抗原不合的BMT，CD+8 T细胞的去除能有效的预防重症GVHD，并易于植入，且仍保留移植物抗白血病(GVL)。临床报道CD5单克隆抗体免疫毒素可选择性杀伤携带CD5抗原的成熟T细胞保留无CD5抗原的未成熟T细胞，从而预防和减少GVHD发生，又不影响免疫系统发育。因此，我们选用了CD5：Ricin、CD8：Ricin两组免疫毒素，在剂量为10-9 mmol/L时能去除3个对数级T细胞(相当于清除99.9% T细胞)，而对非靶细胞无毒性作用[6]。
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本实验结果还表明，两组IT随着剂量的增加，对T细胞清除效率提高的同时，对造血祖细胞抑制作用也增加，其原因是随着IT浓度的增加，尤其达到10-8 mmol/L时，IT中Ricin的β链产生了非特异细胞毒作用，难于在体外被100 mmol/L浓度的半乳糖完全阻断[8]；其次，在相同剂量的IT作用下，CD5：Ricin的细胞毒作用强于CD8：Ricin。推测其原因：一方面可能是CD5:Ricin去除全部T细胞，而CD8：Ricin去除T细胞亚群。这与黎燕等[4]报道混合抗T免疫毒素(CD5:Ricin、CD27：Ricin及CD2：Ricin)对T细胞转化功能的抑制强于任何一种单一抗T免疫毒素结果相似；另一方面可能与CD8：Ricin去除了抑制脐血造血细胞增殖的T细胞亚群有关。这种现象在骨髓移植去除CD+8 T细胞的研究中也有类似报道。此外，CD5：Ricin类似抗OKT1单克隆抗体，当浓度高时与造血祖细胞可能有交叉反应[9]。
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上述结果提示：对于HLA配型不全相合的相关或无关供者的CBT，合理应用CD5:Ricin或CD8：Ricin去除脐血部分成熟T细胞或T细胞亚群，有可能有效预防或减轻重症GVHD发生，从而提高移植成功率。
参考文献
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5 Mosman T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65:55-63.
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8 沈倍奋，姚志健，张建宗，等.免疫毒素Ⅱ抗人T细胞单克隆抗体和蓖麻毒素结合物的制备及其细胞毒性质.中华微生物和免疫杂志，1985，5：209-213.
9 Champlin R, Jansen J, Ho W, et al. Retention of graft-versus-leukemia using selective depletion of CD8 positive T lymphocytes for prevention of graft-versus-host disease following bone marrow transplantation for chronic myelogenous leukemia. Transplant Proc, 1991, 23:1695-1696., 百拇医药