不同方法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞的性状
作者：王关嵩 钱桂生 黄春基 杨晓静
单位：(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺动脉；肌，平滑；大鼠
中国病理生理杂志00328
[中图分类号] Q 813.1+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0286-03
[MeSH] Pulmonary artery; Muscle, smooth; Rats
高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病均以血管平滑肌细胞的异常增生和迁移为特征。为此，近几年来，血管平滑肌细胞的培养已经成为研究工作的基础。目前，仍然多采用贴块片[1]。因其方便经济、技术难度低，但贴块片确有不足之处，如细胞容易出现“去分化”或“调整”现象。故我们采用单纯胶原酶法(A)和复合胶原酶法(B，包括胶原酶弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂)培养肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell, PASMC)，并初步观察两种方法培养的PASMC生长状况。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、主要材料、试剂及配制
Hanks液：先配成贮存液A、B，用时再加等份双蒸水，而后用无菌NaHCO3调整pH值至7.2左右。A包括：NaCl 40 g, KCl 2 g, CaCl2 0.7 g, MgSO4.7H2O 0.5 g; MgCl2.6H2O 0.5 g加双蒸水溶解定量至250 mL。B包括Na2HPO4*12H2O 0.76 g，KH2PO4 0.3 g，葡萄糖5 g加双蒸水溶解定量至250 mL。D-Hanks液：NaCl 8.00 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4 0.06 g, NaHCO3 0.35 g，酚红0.02 g，溶于1000 mL双蒸水，高温消毒，4℃备用。胶原酶Ⅰ型(Sigma):0.2%，弹性蛋白酶Ⅲ型(Sigma):0.05%，胰蛋白酶抑制剂(Sigma):0.05%,牛血清蛋白:0.1%，胰蛋白酶(进口分装):0.1%，以上均用D-Hanks液配制而后过滤分装。A法仅用胶原酶,B法要用胶原酶、胰蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶。
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二、M199培养基(美国Gibco)
按说明书配制，加入10 mmol/L HEPES,1 mmol/L谷氨酰胺，加新鲜三蒸水至1000 mL，-20℃备用。使用时加入小牛血清，配成20%和10%的培养基，用后4℃保存。
三、主要方法及操作步骤
1.取心肺组织 购自本校实验动物中心的Wistar大鼠[有合格证号，雌雄各半，体重(200±18) g]，用0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织，放入预先装有无血清培养基的直径5 cm培养皿内。
2.取肺主动脉 直径5 cm培养皿移入超净工作台，在手术显微镜或解剖显微镜直视下分离出肺主动脉。用弯头眼科镊小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层，并用眼科剪沿血管外侧纵向剪开，在Hanks液中漂洗3次。将血管内膜面向上，铺于小木板上，用刀片自上而下刮1～2次，以去除内皮细胞。
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3.消化 先用钟表镊撕成1 mm×1 mm左右的小条，放置预先盛有2～3 mL的0.2%胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃ 25次/min振摆12～18 h。用复合酶消化法则把1 mm2左右的小条放预先盛有内含0.2%的复合消化酶液2 mL于37℃ CO2孵箱培养40 min。
4.原代培养 待小块组织完全消化溶解后，1000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制的20%小牛血清的M199培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 mL)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37℃孵箱里静置培养。
5.传代 静置3 d后，贴壁的细胞呈伸展，部分区域已融合生长，培养基的颜色变黄，换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的纤维。6～7 d后，细胞长成单层和多层交错的致密细胞层，即可传代。倾去原有液体，加入0.1%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合消化液1.5～2.5 mL消化30 s，镜下见细胞成片地收缩，呈颗粒状立即倾去消化液。最后加入10% M199培养液，用滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种。5 d后可再传代。
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6.鉴定 用过氧化酶标记的链霉卵白素(slreptaridin/peroxidase,SP)法进行抗α-actin免疫组化染色[1]，并依常规制做电镜标本进行观察。
四、生长性状的观察
1.计数分析 传至第3代细胞，用胰蛋白酶消化分散后按104/cm2密度接种于每组6孔板，培养9 d，逐日检测一组，计数操作见文献[2]。
2.接种存活率 细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/mm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值。用以表示细胞群的活力。
接种存活率=形成克隆数/接种细胞数×100%
五、蛋白质含量测定
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以BSA为标准，采用lowry改良法测定PASMC的蛋白质含量，生化试剂购自本校生物化学教研室。
六、胞内[Ca2+]含量测定
取汇合成单层的PASMC，弃培养液后用Hanks液冲洗3次，然后用无钙镁含1 mmol/L EDTA的Hanks液温育5 min，细胞从瓶底分离后用Hanks液洗涤3次，然后用培养基制成细胞悬液(106/mL)，并用台盼兰检查细胞存活率>95%者置4℃保存备用。以Fura-2(中国科学院药物研究所)为荧光指示剂测定细胞内钙释放。负载Fura-2时，向细胞悬液内加入5μmol/mL的Fura-2/AM 37℃温育45 min,以使细胞内Fura-2/AM完全水解为Fura-2。离心弃上清后将细胞悬浮于无钙镁的Hanks液(内含1 mmol/L EGTA)中于2 h内测定。另备未负载Fura-2的细胞以测自身荧光，于37℃恒温稳定后测试。[Ca2+]i的荧光检测：激发波长340 nm，发射波长500 nm，光栅5 nm；发射波长510 nm，光栅10 nm，分别加入1% Triton和20 mmol/L EGTA测量大和最小荧光强度。[Ca2+]i的计算参照Grynkiewicz等[3]的方法进行。平行检查5孔。结果采用单因素方差分析。
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结 果
一、两种消化酶法的特点及价值
用两种方法处理后，单纯酶法要消化11～18 h，一次收集细胞数(1.10～1.34)×106个，有较多的细胞碎片，台盼蓝排斥率为68%～83%，细胞的成片成团率为25%～30%。而复合酶法仅消化0.6～1 h，时间明显缩短，收集细胞数高达(6.8～9.5)×106个，且细胞碎片少，仅为单纯酶法的1/4～1/6。细胞成活率为95%～98%，成片成团率也高达50%～63%。复合酶法培养的细胞占有明显优势。
二、PASMC的生长状态
两种培养方法培养的PASMC其生长曲线和蛋白质含量无明显差别，二者均于7～8 d达高峰，而后由于融合抑制而下降。故应选择此时为消化传代的时机。见图1，2。
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Fig 1 Growth quantities of PASMC cultured by A or B method
图1 PASMC的生长情况
Fig 2 Protein content of PASMC cultured by A or B method
图2 PASMC的蛋白质含量情况
三、PASMC的钙含量
两种酶消化法培养的PASMC，其钙含量有明显差异(P<0.01)。单纯酶消化法的PASMC的[Ca2+]i为(202.00±15.18)nmol/L，而复合酶法为(153.20±11.34)nmol/L。
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讨 论
近年来，国外文献报道常用复合酶法培养PASMC[4，5]，但其与单纯酶法的优劣缺少比较。从本研究的结果看，复合酶法确有一些优点。(1)明显缩短消化时间，更具良好的选择性；(2)收获的细胞数量多，对细胞膜的损害程度较轻；(3)成活的细胞数量和质量都有提高；(4)由于酶作用时间短，分离细胞的纯度也有所提高；(5)较好地保护了离体PASMC的性状和代谢。但是应该看到，单纯酶法分离的PASMC与复合酶法相比虽有差距，但不显著，其简便可行，无需配制很多酶液；经济，仅一种酶；技术难度相对的较低，容易掌握和推广。可根据具体情况选用。
本研究还显示两种方法培养的PASMC生长状态、蛋白质含量和[Ca2+]i浓度均有差异，故在一种系列研究中应该采用一种方法，不可混用，否则无法进行统计学的分析和比较。
[基金项目] 国家自然科学基金资助(39700057)
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[参 考 文 献]
[1] 王关嵩，杨晓静，钱桂生，等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨[J]. 第三军医大学学报，1998, 20(4)：348～350.
[2] 鄂征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术[M]. 第1版. 北京：北京出版社，1995. 153～156.
[3] Grynkiewicz G, Poeine M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties [J]. J Biol Chem, 1985， 260(6):3440～3450.
[4] Rothman A, Kulik TJ, Taubman MB, et al. Development and characterization of a cloned rat pulmonary arterial smooth muscle cell line [J]. Circulation, 1992，86(6):1977～1986.
[5] Powell RJ, Hydowski J, Frank O, et al. Endothelial cell effect on smooth muscle cell collagen synthesis [J]. J Surg Res, 1997, 69(1):113～118.
[收稿日期]1999-04-19 [修回日期]1999-07-27
, http://www.100md.com
单位：(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：肺动脉；肌，平滑；大鼠
中国病理生理杂志00328
[中图分类号] Q 813.1+1 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0286-03
[MeSH] Pulmonary artery; Muscle, smooth; Rats
高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压等疾病均以血管平滑肌细胞的异常增生和迁移为特征。为此，近几年来，血管平滑肌细胞的培养已经成为研究工作的基础。目前，仍然多采用贴块片[1]。因其方便经济、技术难度低，但贴块片确有不足之处，如细胞容易出现“去分化”或“调整”现象。故我们采用单纯胶原酶法(A)和复合胶原酶法(B，包括胶原酶弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂)培养肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell, PASMC)，并初步观察两种方法培养的PASMC生长状况。
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材 料 和 方 法
一、主要材料、试剂及配制
Hanks液：先配成贮存液A、B，用时再加等份双蒸水，而后用无菌NaHCO3调整pH值至7.2左右。A包括：NaCl 40 g, KCl 2 g, CaCl2 0.7 g, MgSO4.7H2O 0.5 g; MgCl2.6H2O 0.5 g加双蒸水溶解定量至250 mL。B包括Na2HPO4*12H2O 0.76 g，KH2PO4 0.3 g，葡萄糖5 g加双蒸水溶解定量至250 mL。D-Hanks液：NaCl 8.00 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4 0.06 g, NaHCO3 0.35 g，酚红0.02 g，溶于1000 mL双蒸水，高温消毒，4℃备用。胶原酶Ⅰ型(Sigma):0.2%，弹性蛋白酶Ⅲ型(Sigma):0.05%，胰蛋白酶抑制剂(Sigma):0.05%,牛血清蛋白:0.1%，胰蛋白酶(进口分装):0.1%，以上均用D-Hanks液配制而后过滤分装。A法仅用胶原酶,B法要用胶原酶、胰蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶。
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二、M199培养基(美国Gibco)
按说明书配制，加入10 mmol/L HEPES,1 mmol/L谷氨酰胺，加新鲜三蒸水至1000 mL，-20℃备用。使用时加入小牛血清，配成20%和10%的培养基，用后4℃保存。
三、主要方法及操作步骤
1.取心肺组织 购自本校实验动物中心的Wistar大鼠[有合格证号，雌雄各半，体重(200±18) g]，用0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后经颈动脉放血处死，无菌迅速取出心肺组织，放入预先装有无血清培养基的直径5 cm培养皿内。
2.取肺主动脉 直径5 cm培养皿移入超净工作台，在手术显微镜或解剖显微镜直视下分离出肺主动脉。用弯头眼科镊小心仔细地剥除外膜的纤维脂肪层，并用眼科剪沿血管外侧纵向剪开，在Hanks液中漂洗3次。将血管内膜面向上，铺于小木板上，用刀片自上而下刮1～2次，以去除内皮细胞。
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3.消化 先用钟表镊撕成1 mm×1 mm左右的小条，放置预先盛有2～3 mL的0.2%胶原酶液，盖紧瓶塞，置摇摆仪上37℃ 25次/min振摆12～18 h。用复合酶消化法则把1 mm2左右的小条放预先盛有内含0.2%的复合消化酶液2 mL于37℃ CO2孵箱培养40 min。
4.原代培养 待小块组织完全消化溶解后，1000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制的20%小牛血清的M199培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 mL)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37℃孵箱里静置培养。
5.传代 静置3 d后，贴壁的细胞呈伸展，部分区域已融合生长，培养基的颜色变黄，换新鲜培养基，以去掉没有贴壁的纤维。6～7 d后，细胞长成单层和多层交错的致密细胞层，即可传代。倾去原有液体，加入0.1%胰蛋白酶及0.02% EDTA混合消化液1.5～2.5 mL消化30 s，镜下见细胞成片地收缩，呈颗粒状立即倾去消化液。最后加入10% M199培养液，用滴管将细胞自瓶壁上吹打下来，以1∶2分装接种。5 d后可再传代。
, 百拇医药
6.鉴定 用过氧化酶标记的链霉卵白素(slreptaridin/peroxidase,SP)法进行抗α-actin免疫组化染色[1]，并依常规制做电镜标本进行观察。
四、生长性状的观察
1.计数分析 传至第3代细胞，用胰蛋白酶消化分散后按104/cm2密度接种于每组6孔板，培养9 d，逐日检测一组，计数操作见文献[2]。
2.接种存活率 细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/mm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值。用以表示细胞群的活力。
接种存活率=形成克隆数/接种细胞数×100%
五、蛋白质含量测定
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以BSA为标准，采用lowry改良法测定PASMC的蛋白质含量，生化试剂购自本校生物化学教研室。
六、胞内[Ca2+]含量测定
取汇合成单层的PASMC，弃培养液后用Hanks液冲洗3次，然后用无钙镁含1 mmol/L EDTA的Hanks液温育5 min，细胞从瓶底分离后用Hanks液洗涤3次，然后用培养基制成细胞悬液(106/mL)，并用台盼兰检查细胞存活率>95%者置4℃保存备用。以Fura-2(中国科学院药物研究所)为荧光指示剂测定细胞内钙释放。负载Fura-2时，向细胞悬液内加入5μmol/mL的Fura-2/AM 37℃温育45 min,以使细胞内Fura-2/AM完全水解为Fura-2。离心弃上清后将细胞悬浮于无钙镁的Hanks液(内含1 mmol/L EGTA)中于2 h内测定。另备未负载Fura-2的细胞以测自身荧光，于37℃恒温稳定后测试。[Ca2+]i的荧光检测：激发波长340 nm，发射波长500 nm，光栅5 nm；发射波长510 nm，光栅10 nm，分别加入1% Triton和20 mmol/L EGTA测量大和最小荧光强度。[Ca2+]i的计算参照Grynkiewicz等[3]的方法进行。平行检查5孔。结果采用单因素方差分析。
, 百拇医药
结 果
一、两种消化酶法的特点及价值
用两种方法处理后，单纯酶法要消化11～18 h，一次收集细胞数(1.10～1.34)×106个，有较多的细胞碎片，台盼蓝排斥率为68%～83%，细胞的成片成团率为25%～30%。而复合酶法仅消化0.6～1 h，时间明显缩短，收集细胞数高达(6.8～9.5)×106个，且细胞碎片少，仅为单纯酶法的1/4～1/6。细胞成活率为95%～98%，成片成团率也高达50%～63%。复合酶法培养的细胞占有明显优势。
二、PASMC的生长状态
两种培养方法培养的PASMC其生长曲线和蛋白质含量无明显差别，二者均于7～8 d达高峰，而后由于融合抑制而下降。故应选择此时为消化传代的时机。见图1，2。
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Fig 1 Growth quantities of PASMC cultured by A or B method
图1 PASMC的生长情况
Fig 2 Protein content of PASMC cultured by A or B method
图2 PASMC的蛋白质含量情况
三、PASMC的钙含量
两种酶消化法培养的PASMC，其钙含量有明显差异(P<0.01)。单纯酶消化法的PASMC的[Ca2+]i为(202.00±15.18)nmol/L，而复合酶法为(153.20±11.34)nmol/L。
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讨 论
近年来，国外文献报道常用复合酶法培养PASMC[4，5]，但其与单纯酶法的优劣缺少比较。从本研究的结果看，复合酶法确有一些优点。(1)明显缩短消化时间，更具良好的选择性；(2)收获的细胞数量多，对细胞膜的损害程度较轻；(3)成活的细胞数量和质量都有提高；(4)由于酶作用时间短，分离细胞的纯度也有所提高；(5)较好地保护了离体PASMC的性状和代谢。但是应该看到，单纯酶法分离的PASMC与复合酶法相比虽有差距，但不显著，其简便可行，无需配制很多酶液；经济，仅一种酶；技术难度相对的较低，容易掌握和推广。可根据具体情况选用。
本研究还显示两种方法培养的PASMC生长状态、蛋白质含量和[Ca2+]i浓度均有差异，故在一种系列研究中应该采用一种方法，不可混用，否则无法进行统计学的分析和比较。
[基金项目] 国家自然科学基金资助(39700057)
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[参 考 文 献]
[1] 王关嵩，杨晓静，钱桂生，等. 大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨[J]. 第三军医大学学报，1998, 20(4)：348～350.
[2] 鄂征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术[M]. 第1版. 北京：北京出版社，1995. 153～156.
[3] Grynkiewicz G, Poeine M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties [J]. J Biol Chem, 1985， 260(6):3440～3450.
[4] Rothman A, Kulik TJ, Taubman MB, et al. Development and characterization of a cloned rat pulmonary arterial smooth muscle cell line [J]. Circulation, 1992，86(6):1977～1986.
[5] Powell RJ, Hydowski J, Frank O, et al. Endothelial cell effect on smooth muscle cell collagen synthesis [J]. J Surg Res, 1997, 69(1):113～118.
[收稿日期]1999-04-19 [修回日期]1999-07-27
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