添加剂对脂肪酶促酮基布洛芬立体选择性酯化反应的影响
作者：杜伟 宗敏华 郭勇 李琼
单位：杜伟(华南理工大学生物工程系，广州 510640) ；宗敏华(华南理工大学生物工程系，广州 510640)；郭勇(华南理工大学生物工程系，广州 510640)；李琼(华南理工大学现代化工重点实验室，广州 510640)
关键词：添加剂；脂肪酶；对映体选择性；酮基布洛芬
中国药物化学杂志000114 摘 要：探讨了添加剂对脂肪酶 Novozym 435催化酮基布洛芬立体选择性酯化反应的影响.极性助溶剂苯、甲苯的添加有利于提高酶反应的对映体选择性；此外，添加少量冠醚，既能提高酯化反应速度又能提高酶反应的对映体选择性，而N,N-二甲基甲酰胺的添加不利于酶反应对映体选择性的提高.
The Effect of Additives on the Lipase-Catalyzed
, 百拇医药
Enantioselective Esterification of Ketoprofen
Du Wei Zong Minhua Guo Yong Li Qiong
(Biotechnology Department,South China University of Technology,Guangzhou 510640)
Abstract：Additives have profound effect on Novozym 435-catalyzed enantioselective esterification of ketoprofen:addition of the polar cosolvent of benzene and toluene can improve the enzymatic enantioselectivity by adding 2 mL of toluene to 8 mL of cyclohexane in the enantiomeric excess of 95%,at 50% conversion ratio after incubation of the mixture for 47 h (17 mg of ketoprofen,0.06 mL of propanol and 50 mg of Novozym 435).Addition of a small amount of 18-Crown-6 could increase the esterification rate and enantioselectivity.DMF couldn′t improve the enzymatic enantioselectivity during the scope studied.
, 百拇医药
Key words：additives;lipase;enantioselectivity;ketoprofen▲
药物的生物活性与其立体构型密切相关〔1〕.目前，临床上所用的1 200多种化学药物中，有480种为手性药物，其中只有20%是单一对映体形式，其余80%是以外消旋体用于临床.然而，一般起治疗作用的是其中一个对映体，而另一对映体无药效甚至有毒副作用〔2〕.非甾体消炎镇痛药物2-芳基丙酸(2-APA)类化合物，其α-位有一个手性碳原子，存在一对光学异构体，其中，S-构型具有生理活性，而R-构型活性低或无活性.如S-萘普生的活性为R-萘普生的28倍；S-布洛芬的活性为R-布洛芬的160倍〔3〕.2-APA类药物历来用化学方法合成，一般总得到等量的一对对映体混合物(外消旋体)，其拆分通常是利用手性试剂将外消旋体混合物中一对对映体转化为两种非对映体，然后利用非对映体理化性质的差异将其分开，但此拆分过程较繁杂，且手性试剂价格昂贵，多数情况下难以得到满意的收率〔4〕.
, http://www.100md.com
酶作为一种特殊的催化剂，越来越受到人们的重视.从生物体系的酶到非生物体的酶的催化，从酶的固定化到非水相酶反应，酶的潜在能力正获得越来越多的开发和应用.由于许多药物是水不溶性的，所以利用非水相酶反应，对消旋体药物进行拆分，进而得到具有光学活性的单一对映体.研究发现：脂肪酶Novozym 435在环己烷中能立体选择性催化酮基布洛芬(α-甲基-3-苯甲酰基-苯乙酸)的酯化反应(另文报道).本文报道不同添加剂对脂肪酶立体选择性催化酮基布洛芬酯化反应的影响.
1 材料与实验方法
脂肪酶Novozym 435来源于Candida antarctica,固定化在大孔阴离子交换树脂上(丹麦Novo公司赠送).Ketoprofen购自Sigma公司.冠醚(18-Crown-6)购自Aldrich公司.其它化学试剂均为市售分析纯.
1.1 有机溶剂脱水
, http://www.100md.com
将4 !分子筛于180 ℃干燥箱内活化2 h，置干燥器中冷却后，加入有机溶剂中，室温振荡48 h，滤去分子筛，得脱水有机溶剂.
1.2 脂肪酶促酯化反应
在50 mL带塞三角瓶中装入预定量的反应底物(酮基布洛芬和丙醇)、脱水有机溶剂及不同的添加剂，加酶开始反应，在30℃，50 r/min振荡，取样0.1 mL供液相色谱分析用.根据酮基布洛芬的减少来计算反应的转化率及酶反应对映体选择性(%ee or E).其它条件相同的不加酶作为对照实验表明：48 h时转化率为零.
1.3 液相色谱分析
高效液相色谱仪：HP 1100(美国惠普公司)，由华南理工大学现代化工重点实验室提供；手性柱：Sumichiral OA-2500(日本Sumika Chemical Analysis Service,Ltd公司)；检测器：UV-HP 1100，波长254 nm；流动相：0.03 mol/L乙酸铵甲醇溶液；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；采用外标法.在该分析条件下，(R)及(S)对映体的保留时间分别为20.6 min和23.0 min； α=1.55.
, 百拇医药
转化率C%＝1-(A+B)/(A0+B0);
对映体过剩值%ee=(B-A)/(B+A)；
对映体选择性E=ln〔(1-C)(1-ee)〕/ln〔(1-C)(1+ee)〕
其中：A0,B0分别为酶促反应前酮基布洛芬两对映体的浓度(mmol/L)； A，B表示反应后残余酮基布洛芬两对映体的浓度(mmol/L);E表示酶反应对映体选择性的大小.E值越大，酶的对映体选择性越好；E值为1，表示酶无对映体选择性〔5〕.
2 结果与讨论
2.1 极性有机溶剂对立体选择性酯化反应的影响
, http://www.100md.com 在环己烷中添加极性比环己烷大的有机溶剂苯、甲苯后，酶促酯化反应速度变慢，但酶反应对映体选择性提高；添加少量的四氢呋喃，酶完全失活，这是由于强极性的四氢呋喃完全剥夺掉酶分子维持其构象的“必需水”从而导致酶活性丧失.添加不同溶液时反应转化率C%及对映体选择性E见表1.
Tab.1 The effect of cosolvent on the lipase-catalyzed
esterification Reaction media
C%
E
10 mL cyclohexane
77
4.7
, http://www.100md.com
8 mL cyclohexane+2 mL benzene
65
7.6
8 mL cyclohexane+2 mL toluene
61
8.0
8 mL cyclohexane+2 mL tetrahydrofuran
0
0
Reaction conditions:17 mg ketoprofen+0.04 mL 1-propanol;Novozym 435 50 mg,34℃;28 h
, http://www.100md.com
有机溶剂的性质对酶的催化活性及对映体选择性有显著的影响〔6〕.一方面，溶剂直接影响酶的构象，从而影响酶的催化功能；另一方面，溶剂还通过改变底物及产物在酶分子表面的浓度来影响整个反应，对有底物或产物抑制的反应尤为如此.此外，溶剂还可影响酶分子表面的水化层进而影响酶的催化特性.实验发现，Novozym 435在疏水性较大的有机溶剂中催化酮基布洛芬酯化反应的速度较快，但酶对映体选择性却较低.而在疏水性较小的极性溶剂中虽然反应速度较慢，但对映体选择性较高(另文报道).因此，将疏水性较大与较小的溶剂混合作为反应介质可同时得到高催化活性和立体选择性.
2.2 甲苯的添加量对选择性酯化反应的影响
在反应条件为17 mg酮基布洛芬+0.06 mL丙醇， Novozym 435 50 mg，30℃，50 r/min的情况下，分别考察a(10 mL环己烷体系)、b(9 mL 环己烷+1 mL甲苯)、 c(8 mL环己烷+2 mL甲苯)、 d(7 mL 环己烷+3 mL甲苯)、e(6 mL环己烷+4 mL 甲苯)五个溶剂体系对该酶促反应的影响，结果见图1和图2.
, 百拇医药
Fig.1 The effect of the addition of toluene on the reaction
rate of lipase-catalyzed esterification
Fig.2 The effect of the amount of toluene on the stereose-
lectivity of lipase-catalyzed esterification
2.3 冠醚18-Crown-6对酯化反应的影响
在10 mL环己烷中，分别添加不同量的冠醚，反应进行41.5 h和48.5 h的转化率C%和对映体过剩值%ee分别列于表2中.
, 百拇医药
Tab.2 The effect of the addition of 18-Crown-6
on the lipase-catalyzed esterification 18-crown-6/mg
C/%
%ee
C/%
%ee
t=41.5 h
t=48.5 h
0.068
62
92
, http://www.100md.com
69
89
0.136
63
95
75
93
0.34
63
95
76
95
0.68
, http://www.100md.com 66
96
77
96
1.2
58
88
72
96
2.04
54
82
70
93
, http://www.100md.com
Reaction condition:17 mg ketoprofen+0.06 mL 1-propanol,10 mL water-removed cyclohexane,Novozym 435 50 mg,30℃,50 r/min
结果表明：当添加冠醚量较少时，随着冠醚量的增多，酶促酯化反应速度及酶反应对映体选择性均提高；当冠醚添加量较多时，酶促酯化反应速度及酶反应对映体选择性均降低.这是由于添加少量冠醚时，冠醚和酶分子间形成复合物，这种复合物的形成加速了活性中心水分子的脱离，使酶更易于与底物“契合”，从而提高了酶的活性.另外，该复合物的形成可能对酶分子的局部构象进行了修饰，在此构象下，酶更易与(R)-异构体“契合”，酶反应对映体选择性有所增加；当冠醚的添加量较大时，冠醚从酶分子活性中心替代过多的水，使酶分子的“挠度”变小，此构象不仅不利于(S)-异构体与酶的“契合”，使得(R)-异构体与酶的“契合”亦受阻，故酯化反应速度及酶反应对映体选择性均下降.实验结果表明：冠醚的添加量以0.34 mg为宜.
, 百拇医药
2.4 N，N-二甲基甲酰胺对立体选择性酯化反应的影响
有学者报道，添加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)可以提高脂肪酶促2-芳基丙酸类药物与醇形成的酯水解反应的对映体选择性.作者在研究中，尝试添加DMF，考察其对非水相脂肪酶促酯化反应的影响，结果见表3.
Fig.3 The effect of DMF on the lipase-catalyzed
enantioselective esterification DMF/mL
C/%
%ee
C/%
%ee
, 百拇医药
t=31 h
t=40 h
0.01
65
87
70
90
0.05
59
80
67
85
0.1
, 百拇医药
54
72
61
79
0.2
50
60
66
73
Reaction condition:17 mg ketoprofen+0.06 mL 1-propanol,10 mL water-removed cyclohexane,Novozym 435 50 mg,30℃,50 r/min
从表3可以看出，随着DMF的增加，酯化反应速度及酶反应对映体选择性均降低.DMF对非水相中脂肪酶催化作用的影响可能源于其对酶分子的毒害作用.此极性添加剂和酶蛋白之间形成氢键可能改变了酶的构象，从而降低了酶对(R)-异构体的识别能力.
, http://www.100md.com
综上所述，在脂肪酶Novozym 435催化酮基布洛芬立体选择性酯化反应中：添加极性助溶剂苯、甲苯可提高酶反应对映体选择性；50 mg Novozym 435催化17 mg酮基布洛芬和0.06 mL丙醇酯化，在8 mL环己烷中，添加2 mL甲苯，反应进行47 h，转化率为50%时，对映体选择性达到95%；添加少量冠醚，可提高酯化反应速度及酶反应对映体选择性，而N，N-二甲基甲酰胺的添加不利于酶反应对映体选择性的提高.■
基金项目：广东省自然科学基金资助项目No.980543
参考文献：
[1]庄英萍，许建和，张嗣良.手性药物的酶法拆分近况.中国药学杂志，1998，33(4)：197～201
[2]李全，谢毓元.药物的光学异构体与药效.中国药物化学杂志，1996，6(2)：151～155
, http://www.100md.com
[3]Trani M,Ducret A,Pepin P,et al.Scale-up of the enantioselective reaction for the enzymatic resolution of (R，S)-ibuprofen.Biotechnology Letters,1995,17(10):1095～1098
[4]徐诗伟，徐清.手性色谱分离2-芳基丙酸类药物对映体.中国医药工业杂志，1995，26(1)：38～42
[5]Ching-Shin Chen,Yoshinori Fujimoto,Garg Girdaukas.Quantitative analyses of biochemical kinetic resolution of enantiomers.J Am Chem Soc,1982,104(25):7294～7299
[6]Shubhada S,Sundaram PV.The role of pH change caused by the addition of water-miscible organic solvents in the distabilization of an enzyme.Enzyme and Microbial Technology,1995,17(4):330～335
收稿日期:1999-08-23, http://www.100md.com
单位：杜伟(华南理工大学生物工程系，广州 510640) ；宗敏华(华南理工大学生物工程系，广州 510640)；郭勇(华南理工大学生物工程系，广州 510640)；李琼(华南理工大学现代化工重点实验室，广州 510640)
关键词：添加剂；脂肪酶；对映体选择性；酮基布洛芬
中国药物化学杂志000114 摘 要：探讨了添加剂对脂肪酶 Novozym 435催化酮基布洛芬立体选择性酯化反应的影响.极性助溶剂苯、甲苯的添加有利于提高酶反应的对映体选择性；此外，添加少量冠醚，既能提高酯化反应速度又能提高酶反应的对映体选择性，而N,N-二甲基甲酰胺的添加不利于酶反应对映体选择性的提高.
The Effect of Additives on the Lipase-Catalyzed
, 百拇医药
Enantioselective Esterification of Ketoprofen
Du Wei Zong Minhua Guo Yong Li Qiong
(Biotechnology Department,South China University of Technology,Guangzhou 510640)
Abstract：Additives have profound effect on Novozym 435-catalyzed enantioselective esterification of ketoprofen:addition of the polar cosolvent of benzene and toluene can improve the enzymatic enantioselectivity by adding 2 mL of toluene to 8 mL of cyclohexane in the enantiomeric excess of 95%,at 50% conversion ratio after incubation of the mixture for 47 h (17 mg of ketoprofen,0.06 mL of propanol and 50 mg of Novozym 435).Addition of a small amount of 18-Crown-6 could increase the esterification rate and enantioselectivity.DMF couldn′t improve the enzymatic enantioselectivity during the scope studied.
, 百拇医药
Key words：additives;lipase;enantioselectivity;ketoprofen▲
药物的生物活性与其立体构型密切相关〔1〕.目前，临床上所用的1 200多种化学药物中，有480种为手性药物，其中只有20%是单一对映体形式，其余80%是以外消旋体用于临床.然而，一般起治疗作用的是其中一个对映体，而另一对映体无药效甚至有毒副作用〔2〕.非甾体消炎镇痛药物2-芳基丙酸(2-APA)类化合物，其α-位有一个手性碳原子，存在一对光学异构体，其中，S-构型具有生理活性，而R-构型活性低或无活性.如S-萘普生的活性为R-萘普生的28倍；S-布洛芬的活性为R-布洛芬的160倍〔3〕.2-APA类药物历来用化学方法合成，一般总得到等量的一对对映体混合物(外消旋体)，其拆分通常是利用手性试剂将外消旋体混合物中一对对映体转化为两种非对映体，然后利用非对映体理化性质的差异将其分开，但此拆分过程较繁杂，且手性试剂价格昂贵，多数情况下难以得到满意的收率〔4〕.
, http://www.100md.com
酶作为一种特殊的催化剂，越来越受到人们的重视.从生物体系的酶到非生物体的酶的催化，从酶的固定化到非水相酶反应，酶的潜在能力正获得越来越多的开发和应用.由于许多药物是水不溶性的，所以利用非水相酶反应，对消旋体药物进行拆分，进而得到具有光学活性的单一对映体.研究发现：脂肪酶Novozym 435在环己烷中能立体选择性催化酮基布洛芬(α-甲基-3-苯甲酰基-苯乙酸)的酯化反应(另文报道).本文报道不同添加剂对脂肪酶立体选择性催化酮基布洛芬酯化反应的影响.
1 材料与实验方法
脂肪酶Novozym 435来源于Candida antarctica,固定化在大孔阴离子交换树脂上(丹麦Novo公司赠送).Ketoprofen购自Sigma公司.冠醚(18-Crown-6)购自Aldrich公司.其它化学试剂均为市售分析纯.
1.1 有机溶剂脱水
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将4 !分子筛于180 ℃干燥箱内活化2 h，置干燥器中冷却后，加入有机溶剂中，室温振荡48 h，滤去分子筛，得脱水有机溶剂.
1.2 脂肪酶促酯化反应
在50 mL带塞三角瓶中装入预定量的反应底物(酮基布洛芬和丙醇)、脱水有机溶剂及不同的添加剂，加酶开始反应，在30℃，50 r/min振荡，取样0.1 mL供液相色谱分析用.根据酮基布洛芬的减少来计算反应的转化率及酶反应对映体选择性(%ee or E).其它条件相同的不加酶作为对照实验表明：48 h时转化率为零.
1.3 液相色谱分析
高效液相色谱仪：HP 1100(美国惠普公司)，由华南理工大学现代化工重点实验室提供；手性柱：Sumichiral OA-2500(日本Sumika Chemical Analysis Service,Ltd公司)；检测器：UV-HP 1100，波长254 nm；流动相：0.03 mol/L乙酸铵甲醇溶液；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；采用外标法.在该分析条件下，(R)及(S)对映体的保留时间分别为20.6 min和23.0 min； α=1.55.
, 百拇医药
转化率C%＝1-(A+B)/(A0+B0);
对映体过剩值%ee=(B-A)/(B+A)；
对映体选择性E=ln〔(1-C)(1-ee)〕/ln〔(1-C)(1+ee)〕
其中：A0,B0分别为酶促反应前酮基布洛芬两对映体的浓度(mmol/L)； A，B表示反应后残余酮基布洛芬两对映体的浓度(mmol/L);E表示酶反应对映体选择性的大小.E值越大，酶的对映体选择性越好；E值为1，表示酶无对映体选择性〔5〕.
2 结果与讨论
2.1 极性有机溶剂对立体选择性酯化反应的影响
, http://www.100md.com 在环己烷中添加极性比环己烷大的有机溶剂苯、甲苯后，酶促酯化反应速度变慢，但酶反应对映体选择性提高；添加少量的四氢呋喃，酶完全失活，这是由于强极性的四氢呋喃完全剥夺掉酶分子维持其构象的“必需水”从而导致酶活性丧失.添加不同溶液时反应转化率C%及对映体选择性E见表1.
Tab.1 The effect of cosolvent on the lipase-catalyzed
esterification Reaction media
C%
E
10 mL cyclohexane
77
4.7
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8 mL cyclohexane+2 mL benzene
65
7.6
8 mL cyclohexane+2 mL toluene
61
8.0
8 mL cyclohexane+2 mL tetrahydrofuran
0
0
Reaction conditions:17 mg ketoprofen+0.04 mL 1-propanol;Novozym 435 50 mg,34℃;28 h
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有机溶剂的性质对酶的催化活性及对映体选择性有显著的影响〔6〕.一方面，溶剂直接影响酶的构象，从而影响酶的催化功能；另一方面，溶剂还通过改变底物及产物在酶分子表面的浓度来影响整个反应，对有底物或产物抑制的反应尤为如此.此外，溶剂还可影响酶分子表面的水化层进而影响酶的催化特性.实验发现，Novozym 435在疏水性较大的有机溶剂中催化酮基布洛芬酯化反应的速度较快，但酶对映体选择性却较低.而在疏水性较小的极性溶剂中虽然反应速度较慢，但对映体选择性较高(另文报道).因此，将疏水性较大与较小的溶剂混合作为反应介质可同时得到高催化活性和立体选择性.
2.2 甲苯的添加量对选择性酯化反应的影响
在反应条件为17 mg酮基布洛芬+0.06 mL丙醇， Novozym 435 50 mg，30℃，50 r/min的情况下，分别考察a(10 mL环己烷体系)、b(9 mL 环己烷+1 mL甲苯)、 c(8 mL环己烷+2 mL甲苯)、 d(7 mL 环己烷+3 mL甲苯)、e(6 mL环己烷+4 mL 甲苯)五个溶剂体系对该酶促反应的影响，结果见图1和图2.
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Fig.1 The effect of the addition of toluene on the reaction
rate of lipase-catalyzed esterification
Fig.2 The effect of the amount of toluene on the stereose-
lectivity of lipase-catalyzed esterification
2.3 冠醚18-Crown-6对酯化反应的影响
在10 mL环己烷中，分别添加不同量的冠醚，反应进行41.5 h和48.5 h的转化率C%和对映体过剩值%ee分别列于表2中.
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Tab.2 The effect of the addition of 18-Crown-6
on the lipase-catalyzed esterification 18-crown-6/mg
C/%
%ee
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t=41.5 h
t=48.5 h
0.068
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54
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Reaction condition:17 mg ketoprofen+0.06 mL 1-propanol,10 mL water-removed cyclohexane,Novozym 435 50 mg,30℃,50 r/min
结果表明：当添加冠醚量较少时，随着冠醚量的增多，酶促酯化反应速度及酶反应对映体选择性均提高；当冠醚添加量较多时，酶促酯化反应速度及酶反应对映体选择性均降低.这是由于添加少量冠醚时，冠醚和酶分子间形成复合物，这种复合物的形成加速了活性中心水分子的脱离，使酶更易于与底物“契合”，从而提高了酶的活性.另外，该复合物的形成可能对酶分子的局部构象进行了修饰，在此构象下，酶更易与(R)-异构体“契合”，酶反应对映体选择性有所增加；当冠醚的添加量较大时，冠醚从酶分子活性中心替代过多的水，使酶分子的“挠度”变小，此构象不仅不利于(S)-异构体与酶的“契合”，使得(R)-异构体与酶的“契合”亦受阻，故酯化反应速度及酶反应对映体选择性均下降.实验结果表明：冠醚的添加量以0.34 mg为宜.
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2.4 N，N-二甲基甲酰胺对立体选择性酯化反应的影响
有学者报道，添加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)可以提高脂肪酶促2-芳基丙酸类药物与醇形成的酯水解反应的对映体选择性.作者在研究中，尝试添加DMF，考察其对非水相脂肪酶促酯化反应的影响，结果见表3.
Fig.3 The effect of DMF on the lipase-catalyzed
enantioselective esterification DMF/mL
C/%
%ee
C/%
%ee
, 百拇医药
t=31 h
t=40 h
0.01
65
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61
79
0.2
50
60
66
73
Reaction condition:17 mg ketoprofen+0.06 mL 1-propanol,10 mL water-removed cyclohexane,Novozym 435 50 mg,30℃,50 r/min
从表3可以看出，随着DMF的增加，酯化反应速度及酶反应对映体选择性均降低.DMF对非水相中脂肪酶催化作用的影响可能源于其对酶分子的毒害作用.此极性添加剂和酶蛋白之间形成氢键可能改变了酶的构象，从而降低了酶对(R)-异构体的识别能力.
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综上所述，在脂肪酶Novozym 435催化酮基布洛芬立体选择性酯化反应中：添加极性助溶剂苯、甲苯可提高酶反应对映体选择性；50 mg Novozym 435催化17 mg酮基布洛芬和0.06 mL丙醇酯化，在8 mL环己烷中，添加2 mL甲苯，反应进行47 h，转化率为50%时，对映体选择性达到95%；添加少量冠醚，可提高酯化反应速度及酶反应对映体选择性，而N，N-二甲基甲酰胺的添加不利于酶反应对映体选择性的提高.■
基金项目：广东省自然科学基金资助项目No.980543
参考文献：
[1]庄英萍，许建和，张嗣良.手性药物的酶法拆分近况.中国药学杂志，1998，33(4)：197～201
[2]李全，谢毓元.药物的光学异构体与药效.中国药物化学杂志，1996，6(2)：151～155
, http://www.100md.com
[3]Trani M,Ducret A,Pepin P,et al.Scale-up of the enantioselective reaction for the enzymatic resolution of (R，S)-ibuprofen.Biotechnology Letters,1995,17(10):1095～1098
[4]徐诗伟，徐清.手性色谱分离2-芳基丙酸类药物对映体.中国医药工业杂志，1995，26(1)：38～42
[5]Ching-Shin Chen,Yoshinori Fujimoto,Garg Girdaukas.Quantitative analyses of biochemical kinetic resolution of enantiomers.J Am Chem Soc,1982,104(25):7294～7299
[6]Shubhada S,Sundaram PV.The role of pH change caused by the addition of water-miscible organic solvents in the distabilization of an enzyme.Enzyme and Microbial Technology,1995,17(4):330～335
收稿日期:1999-08-23, http://www.100md.com