反相高效液相色谱法选择性测定血浆中普罗帕酮对映体
作者：陈鹰 裘军 吴梅 张宜 李高汤韧
单位：州军区武汉总医院药局 430070， 同济医科大学药学院，九七届实习生
关键词：反相液相色谱法；普罗帕酮/对映体；血药浓度
中国药师000119
摘 要 采用GITC柱前衍生化法同时分离和测定人血浆中(R)-PPF和(S)-PPF的浓度， 在50～500 ng.ml-1浓度范围内有良好的线性关系； 血浆中(S)-PPF的提取回收率、 相对回收率、 日内RSD、 日间RSD分别为88.76%～91.45%、 98.76%～101.22%、 5.62%～6.79%、 7.65%～9.01%； (R)-PPF的分别为88.98%～91.33%、 98.31%～100.56%、 5.02%～7.03%、 7.88%～9.05%。
, http://www.100md.com
Selective Determination of Propafenone Enantiomers Level in Human Plasma by Reversed-Phase Liquid Chromatography
Chen Ying, Qiu Jun, Wu Mei，Zhang Yi, Li Gao, Tang Ren
(Wuhan General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Wuhan 430070, 97 gratuaded student)
ABSTRACT A reversed-phase liquid chromatography analysis with pre-coloum derivatization for determining the level of Propafenone enantiomers in human plasma was established. The standard curves were linear in the range of 50～500 ng/ml. The refined-recovery rate, relative recovery rate, within-day RSD and between-day RSD for (S)-PPF were 88.76%～91.45%, 98.76%～101.22%, 5.62%～6.79%, and 7.65%～9.01%, respectively. Those for (R)-PPF were 88.98%～91.33%, 98.31%～100.56%, 5.02%～7.03%, and 7.88%～9.05%, respectively.
, 百拇医药
KEY WORDS Reversed-phase liquid chromatography; Propafenone enantiomers; Drug concerntration in plasma▲
普罗帕酮(propafenone, 简称PPF，心律平)是目前较理想的Ic类抗心律失常药[1]，中国药典(二部)1995年版已收载其盐酸盐。目前临床用的PPF为消旋体，含有(R)-PPF和(S)-PPF两种对映体。为了同时分离和测定人体口服PPF消旋体后血浆中两种对映体的浓度，国外多采用手性流动相[2]或手性固定相[3]分离。本文参照Mehvar[4]和周晔[5]的报道，采用PPF和GITC生成物理行为有差异的非对映体衍生物，并通过反相液相色谱法将它们分开。该方法快速、准确、易行。
1 实验材料
, http://www.100md.com
1.1 仪器 高效液相色谱仪(日立655A-12HPLC泵、655A-22可变波长紫外检测器、D-2000数据处理器)；SK-1型旋涡混匀器；多孔道氮气蒸发装置。
1.2 试药 (R)-、(S)-和(R/S)-PPF标准品，及3-苯基-1-{2-[3-(乙氨基)-2-羟基丙氧基]苯基}-1-丙酮盐酸盐(简称Li1115)均由德国斯图加特市临床药理研究所惠赠；乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(简称GITC)购于Sigma化学公司；三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)上海化学试剂采购供应站分装；甲醇、乙腈(色谱纯)；丙酮、二氯甲烷(分析纯，需重蒸)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件的确定 色谱柱spherisorbODSⅡ(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈-水(3∶2)，每升混合液中加入100μl冰醋酸；流动相流速1.0ml.min-1；紫外检测波长208nm；灵敏度0.01AFUS；记录纸速为2.5mm.min-1；进样量20μl。在该色谱条件下，理论板数约为5000，PPF两对映体分离度R=1.58>1.5。
, 百拇医药
2.2 样品处理
2.2.1 血浆中PPF的提取 取含药血浆1ml，置10ml离心管中，加内标Li1115甲醇溶液(20ng.μl-1)20μl、Tris缓冲液(0.1mol.L-1)500μl和丙酮2ml，振摇，沉淀后离心，取上层置另一10ml离心管中，再加入二氯甲烷3ml，用快速旋涡混匀器混旋提取1min，离心15min(2500r.min-1)，吸取下层有机层，于40℃水浴中用N2挥干，即得含PPF和Li1115的残留物。
2.2.2 衍生化反应 在上述得到的含PPF和Li1115的残留物中加入GITC乙腈溶液(1mg.ml-1)40μl，用快速旋涡混匀器混旋1min，室温放置20min后，取20μl进样，进行色谱分析。在本测试条件下，血浆杂质无干扰，内标衍生物峰a与峰b的保留时间分别为10.23min与11.09min，PPF衍生物峰c的保留时间为12.94min与(S)-PPF标准品衍生物相同，PPF衍生物峰d的保留时间为14.00min与(R)-PPF标准品衍生物相同，见图1。
, http://www.100md.com
a 内标峰 1 b 内标峰 2 c (S)-PPF 峰 d (R)-PPF 峰
图1 血浆中(R/S)-PPF和内标Li1115衍生后的RP-HPLC拆分图谱
2.3 标准曲线的制备
2.3.1 经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线 取空白血浆各1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液(10ng.μl-1)10，20，40，80，100μl，相当于血浆中(S)-PPF和(R)-PPF的浓度各为50，100，200，400，500ng.ml-1的两条标准系列，按“2.2样品处理”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比(Y)，相对对映体浓度(X：ng.ml-1)作线性回归，回归方程如下：
, http://www.100md.com
(S)-PPF：Y=-0.096+0.00508X(r=0.9946)
(R)-PPF：Y=-0.125+0.00492X(r=0.9955)
2.3.2 未经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线 取蒸馏水各1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液(10ng.μl-1)10，20，40，80，100μl，相当于(S)-PPF和(R)-PPF曲线浓度各为50，100，200，400，500ng.ml-1的两条标准系列，再加入20μl内标Li1115甲醇溶液(20ng.μl-1)，混匀后，按“2.2.2衍生化反应”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2面积比(Y)，相对对映体浓度(X：ng.ml-1)作线性回归，得回归方程如下：
, 百拇医药
(S)-PPF： Y=-0.121+0.005 07 X (r=0.999 4)
(R)-PPF： Y=-0.140+0.005 13 X (r=0.999 9)
2.4 最低检测浓度 结果表明10 ng.ml-1为最低检测浓度。
2.5 回收率测定
2.5.1 提取回收率 取空白血浆各1 ml，置10 ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液10，40，100μl，平行做4份，相当于(S)-PPF和(R)-PPF浓度各为50，200，500ng.ml-1的含药血浆，按“2.2样品处理”项下进行，但内标Li1115甲醇液20μl改在“吸取下层有机层”后加入。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比，代入未经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF的标准曲线中，计算提取后的药物量，再与投入量相比，即得(S)-PPF和(R)-PPF的提取回收率。
, 百拇医药
2.5.2 回收率 由“2.6精密度测定”项下测得的药物量与投入量相比，可得回收率。
2.6 精密度测定
2.6.1 日内变异 取空白血浆1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液10，40，100μl，相当于(S)-PPF和(R)-PPF浓度分别为50，200，500ng.ml-1的含药血浆。再加入20μl内标Li1115甲醇液，混匀后，按“2.2样品处理”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比，代入经血经提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线，测得药物量，求得变异系数。
表1 血浆中(S)-PPF、(R)-PPF的回收率和
精密度测定结果(n=4) PPF
, 百拇医药
(ng.ml-1)
(S)-PPF
(R)-PPF
50
200
500
50
200
500
提取回收率
(%)
91.5
, 百拇医药
±6.2
89.2
±4.8
88.8
±5.6
91.3
±6.0
89.6
±4.3
89.0
±5.8
回收率(%)
101.2
, http://www.100md.com
±6.8
100.0
±5.6
98.8
±6.7
100.6
±6.7
100.6
±5.0
98.3
±6.9
日内RSD(%)
6.7
, 百拇医药
5.6
6.8
6.6
5.0
7.0
日间RSD(%)
8.9
7.7
9.0
9.1
7.9
8.7
2.6.2 日间变异 重复上述操作，连续在4d内完成。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 手性柱分离速度快、结果好，但价格昂贵、柱寿命短。柱前衍生化虽然操作时间较长，但成本低，使用方便。
3.2 本文参照周晔[5]报道GITC可作为β-氨基醇类药物对映体衍生化试剂，与mehvar报道[4]的用R(-)-乙萘异氰酸酯相比更为常用，且易合成，同时，改进了提取方法，使提取回收率提高。GITC与对映体的衍生化反应40min达到最完全，但20min时已基本反应完全，为节省时间，采用20min即可，反应温度在20～35℃，24h内能保持稳定，但如遇长时间强光直射会发生部分分解。
3.3 本文采用的内标物Li1115是盐酸普罗帕酮的同系物，其衍生化反应保留时间与血浆提取率等与普罗帕酮行为较相似，可使定量更准确方便，内标峰1与2的分离度也为1.58>1.5，我们可采用峰1或峰2或两峰的平均值作内标值。
, 百拇医药
3.4 曾采用二氯甲烷直接提取，但提取回收率偏低，很容易乳化。后改用丙酮沉淀蛋白，再与二氯甲烷混合提取，提取回收率增加，不易乳化，血浆杂质峰仍与前者相似。流动相中加入冰醋酸的目的是为使流动相显弱酸性，使分离效果更好，减少拖尾现象。选择波长时，为提高方法灵敏度，在溶剂(乙腈)不干扰吸收的情况下，采用208nm处作检测波长。重溶时，衍生物用乙腈溶解比用流动相溶解要好。
3.5 有关药物对映体研究近年发展很快，国外报道[6]PPF两种对映体在药理学和药代动力学方面呈现明显的立体选择性差异，且与代谢分型有关。本法的建立为以后进一步开展PPF对映体的药动学、药效学等的研究提供了一种简便易行的分析手段。
参 考 文 献
[1]高诚. 普罗帕酮的临床应用及其联合用药. 国外医学心血管疾病分册， 1994， 21(2)：79
, 百拇医药
[2]Hollenhorst T, Blaschke G. Direct seperation of the enantiomers of propafenone, dipropaferone and their major metabolites by HPLC on madifycellulose and a mylose chiral stationary phace. J Chromatogr, 1991, 585(2):329～32
[3]Mwhvar R. Liquid chromatogrophic analysis of propafenone enantiomers in human plasma. J Chomatogr, 1990, 527(1):79～89
[4]Mehavar R. Liquid chromatographic analysis of propafenone enantiomers in human plasma. J Chromatogr, 1990, 527(1):79～89
[5]周晔， 孙曾培. 用GITC手性试剂衍生化高效液相色谱法拆分β-氨基酸类药物对映体. 药学学报， 1990， 25(4)：311～4
[6]Volz M, Mrtrovic V. Schlepper M, et al. Steady-state plasma concentrations of propafenonechirality and metabolism. Int J Clin pharmacol and Ther, 1994, 32(7):370
(19990324收稿 19990813修回), 百拇医药
单位：州军区武汉总医院药局 430070， 同济医科大学药学院，九七届实习生
关键词：反相液相色谱法；普罗帕酮/对映体；血药浓度
中国药师000119
摘 要 采用GITC柱前衍生化法同时分离和测定人血浆中(R)-PPF和(S)-PPF的浓度， 在50～500 ng.ml-1浓度范围内有良好的线性关系； 血浆中(S)-PPF的提取回收率、 相对回收率、 日内RSD、 日间RSD分别为88.76%～91.45%、 98.76%～101.22%、 5.62%～6.79%、 7.65%～9.01%； (R)-PPF的分别为88.98%～91.33%、 98.31%～100.56%、 5.02%～7.03%、 7.88%～9.05%。
, http://www.100md.com
Selective Determination of Propafenone Enantiomers Level in Human Plasma by Reversed-Phase Liquid Chromatography
Chen Ying, Qiu Jun, Wu Mei，Zhang Yi, Li Gao, Tang Ren
(Wuhan General Hospital of Guangzhou Command of PLA, Wuhan 430070, 97 gratuaded student)
ABSTRACT A reversed-phase liquid chromatography analysis with pre-coloum derivatization for determining the level of Propafenone enantiomers in human plasma was established. The standard curves were linear in the range of 50～500 ng/ml. The refined-recovery rate, relative recovery rate, within-day RSD and between-day RSD for (S)-PPF were 88.76%～91.45%, 98.76%～101.22%, 5.62%～6.79%, and 7.65%～9.01%, respectively. Those for (R)-PPF were 88.98%～91.33%, 98.31%～100.56%, 5.02%～7.03%, and 7.88%～9.05%, respectively.
, 百拇医药
KEY WORDS Reversed-phase liquid chromatography; Propafenone enantiomers; Drug concerntration in plasma▲
普罗帕酮(propafenone, 简称PPF，心律平)是目前较理想的Ic类抗心律失常药[1]，中国药典(二部)1995年版已收载其盐酸盐。目前临床用的PPF为消旋体，含有(R)-PPF和(S)-PPF两种对映体。为了同时分离和测定人体口服PPF消旋体后血浆中两种对映体的浓度，国外多采用手性流动相[2]或手性固定相[3]分离。本文参照Mehvar[4]和周晔[5]的报道，采用PPF和GITC生成物理行为有差异的非对映体衍生物，并通过反相液相色谱法将它们分开。该方法快速、准确、易行。
1 实验材料
, http://www.100md.com
1.1 仪器 高效液相色谱仪(日立655A-12HPLC泵、655A-22可变波长紫外检测器、D-2000数据处理器)；SK-1型旋涡混匀器；多孔道氮气蒸发装置。
1.2 试药 (R)-、(S)-和(R/S)-PPF标准品，及3-苯基-1-{2-[3-(乙氨基)-2-羟基丙氧基]苯基}-1-丙酮盐酸盐(简称Li1115)均由德国斯图加特市临床药理研究所惠赠；乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(简称GITC)购于Sigma化学公司；三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)上海化学试剂采购供应站分装；甲醇、乙腈(色谱纯)；丙酮、二氯甲烷(分析纯，需重蒸)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件的确定 色谱柱spherisorbODSⅡ(4.6mm×250mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈-水(3∶2)，每升混合液中加入100μl冰醋酸；流动相流速1.0ml.min-1；紫外检测波长208nm；灵敏度0.01AFUS；记录纸速为2.5mm.min-1；进样量20μl。在该色谱条件下，理论板数约为5000，PPF两对映体分离度R=1.58>1.5。
, 百拇医药
2.2 样品处理
2.2.1 血浆中PPF的提取 取含药血浆1ml，置10ml离心管中，加内标Li1115甲醇溶液(20ng.μl-1)20μl、Tris缓冲液(0.1mol.L-1)500μl和丙酮2ml，振摇，沉淀后离心，取上层置另一10ml离心管中，再加入二氯甲烷3ml，用快速旋涡混匀器混旋提取1min，离心15min(2500r.min-1)，吸取下层有机层，于40℃水浴中用N2挥干，即得含PPF和Li1115的残留物。
2.2.2 衍生化反应 在上述得到的含PPF和Li1115的残留物中加入GITC乙腈溶液(1mg.ml-1)40μl，用快速旋涡混匀器混旋1min，室温放置20min后，取20μl进样，进行色谱分析。在本测试条件下，血浆杂质无干扰，内标衍生物峰a与峰b的保留时间分别为10.23min与11.09min，PPF衍生物峰c的保留时间为12.94min与(S)-PPF标准品衍生物相同，PPF衍生物峰d的保留时间为14.00min与(R)-PPF标准品衍生物相同，见图1。
, http://www.100md.com
a 内标峰 1 b 内标峰 2 c (S)-PPF 峰 d (R)-PPF 峰
图1 血浆中(R/S)-PPF和内标Li1115衍生后的RP-HPLC拆分图谱
2.3 标准曲线的制备
2.3.1 经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线 取空白血浆各1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液(10ng.μl-1)10，20，40，80，100μl，相当于血浆中(S)-PPF和(R)-PPF的浓度各为50，100，200，400，500ng.ml-1的两条标准系列，按“2.2样品处理”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比(Y)，相对对映体浓度(X：ng.ml-1)作线性回归，回归方程如下：
, http://www.100md.com
(S)-PPF：Y=-0.096+0.00508X(r=0.9946)
(R)-PPF：Y=-0.125+0.00492X(r=0.9955)
2.3.2 未经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线 取蒸馏水各1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液(10ng.μl-1)10，20，40，80，100μl，相当于(S)-PPF和(R)-PPF曲线浓度各为50，100，200，400，500ng.ml-1的两条标准系列，再加入20μl内标Li1115甲醇溶液(20ng.μl-1)，混匀后，按“2.2.2衍生化反应”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2面积比(Y)，相对对映体浓度(X：ng.ml-1)作线性回归，得回归方程如下：
, 百拇医药
(S)-PPF： Y=-0.121+0.005 07 X (r=0.999 4)
(R)-PPF： Y=-0.140+0.005 13 X (r=0.999 9)
2.4 最低检测浓度 结果表明10 ng.ml-1为最低检测浓度。
2.5 回收率测定
2.5.1 提取回收率 取空白血浆各1 ml，置10 ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液10，40，100μl，平行做4份，相当于(S)-PPF和(R)-PPF浓度各为50，200，500ng.ml-1的含药血浆，按“2.2样品处理”项下进行，但内标Li1115甲醇液20μl改在“吸取下层有机层”后加入。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比，代入未经血浆提取的(S)-PPF和(R)-PPF的标准曲线中，计算提取后的药物量，再与投入量相比，即得(S)-PPF和(R)-PPF的提取回收率。
, 百拇医药
2.5.2 回收率 由“2.6精密度测定”项下测得的药物量与投入量相比，可得回收率。
2.6 精密度测定
2.6.1 日内变异 取空白血浆1ml，置10ml离心管中，再分别加入(R/S)-PPF甲醇液10，40，100μl，相当于(S)-PPF和(R)-PPF浓度分别为50，200，500ng.ml-1的含药血浆。再加入20μl内标Li1115甲醇液，混匀后，按“2.2样品处理”项下进行。分别以(S)-PPF峰、(R)-PPF峰与内标峰2的峰面积比，代入经血经提取的(S)-PPF和(R)-PPF标准曲线，测得药物量，求得变异系数。
表1 血浆中(S)-PPF、(R)-PPF的回收率和
精密度测定结果(n=4) PPF
, 百拇医药
(ng.ml-1)
(S)-PPF
(R)-PPF
50
200
500
50
200
500
提取回收率
(%)
91.5
, 百拇医药
±6.2
89.2
±4.8
88.8
±5.6
91.3
±6.0
89.6
±4.3
89.0
±5.8
回收率(%)
101.2
, http://www.100md.com
±6.8
100.0
±5.6
98.8
±6.7
100.6
±6.7
100.6
±5.0
98.3
±6.9
日内RSD(%)
6.7
, 百拇医药
5.6
6.8
6.6
5.0
7.0
日间RSD(%)
8.9
7.7
9.0
9.1
7.9
8.7
2.6.2 日间变异 重复上述操作，连续在4d内完成。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 手性柱分离速度快、结果好，但价格昂贵、柱寿命短。柱前衍生化虽然操作时间较长，但成本低，使用方便。
3.2 本文参照周晔[5]报道GITC可作为β-氨基醇类药物对映体衍生化试剂，与mehvar报道[4]的用R(-)-乙萘异氰酸酯相比更为常用，且易合成，同时，改进了提取方法，使提取回收率提高。GITC与对映体的衍生化反应40min达到最完全，但20min时已基本反应完全，为节省时间，采用20min即可，反应温度在20～35℃，24h内能保持稳定，但如遇长时间强光直射会发生部分分解。
3.3 本文采用的内标物Li1115是盐酸普罗帕酮的同系物，其衍生化反应保留时间与血浆提取率等与普罗帕酮行为较相似，可使定量更准确方便，内标峰1与2的分离度也为1.58>1.5，我们可采用峰1或峰2或两峰的平均值作内标值。
, 百拇医药
3.4 曾采用二氯甲烷直接提取，但提取回收率偏低，很容易乳化。后改用丙酮沉淀蛋白，再与二氯甲烷混合提取，提取回收率增加，不易乳化，血浆杂质峰仍与前者相似。流动相中加入冰醋酸的目的是为使流动相显弱酸性，使分离效果更好，减少拖尾现象。选择波长时，为提高方法灵敏度，在溶剂(乙腈)不干扰吸收的情况下，采用208nm处作检测波长。重溶时，衍生物用乙腈溶解比用流动相溶解要好。
3.5 有关药物对映体研究近年发展很快，国外报道[6]PPF两种对映体在药理学和药代动力学方面呈现明显的立体选择性差异，且与代谢分型有关。本法的建立为以后进一步开展PPF对映体的药动学、药效学等的研究提供了一种简便易行的分析手段。
参 考 文 献
[1]高诚. 普罗帕酮的临床应用及其联合用药. 国外医学心血管疾病分册， 1994， 21(2)：79
, 百拇医药
[2]Hollenhorst T, Blaschke G. Direct seperation of the enantiomers of propafenone, dipropaferone and their major metabolites by HPLC on madifycellulose and a mylose chiral stationary phace. J Chromatogr, 1991, 585(2):329～32
[3]Mwhvar R. Liquid chromatogrophic analysis of propafenone enantiomers in human plasma. J Chomatogr, 1990, 527(1):79～89
[4]Mehavar R. Liquid chromatographic analysis of propafenone enantiomers in human plasma. J Chromatogr, 1990, 527(1):79～89
[5]周晔， 孙曾培. 用GITC手性试剂衍生化高效液相色谱法拆分β-氨基酸类药物对映体. 药学学报， 1990， 25(4)：311～4
[6]Volz M, Mrtrovic V. Schlepper M, et al. Steady-state plasma concentrations of propafenonechirality and metabolism. Int J Clin pharmacol and Ther, 1994, 32(7):370
(19990324收稿 19990813修回), 百拇医药