大鼠脑缺血/再灌流中钙与神经元凋亡关系的研究
作者：陈康宁 董为伟
单位：陈康宁(第三军医大学西南医院神经内科，重庆 400038)；董为伟(重庆医科大学神经病学研究所 400016)
关键词：钙超载；脑缺血；再灌流；神经元凋亡
中国老年学杂志000522摘 要 目的 观察钙超载与神经元凋亡的关系。方法 采用大鼠全脑缺血模型，观察脑缺血/再灌流后突触体游离钙、神经元凋亡的变化。结果 脑缺血/再灌流可以导致突触体游离钙增加及神经元的凋亡，脑缺血/再灌流神经元内游离钙浓度的变化与神经元凋亡的变化是一致的。结论 脑缺血/再灌流诱导钙超载参与了神经元凋亡。
An investigation of the relationship of calcium overload and neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion injury rats model
, 百拇医药
Chen Kangning,Dong Weiwei
(The South-West Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract：Objective To explore the relation between calcium overload induced by cerebral ischemia/reperfusion and neuronal apoptosis.Methods After the ischemia/reperfusion model was established in male Wistar rat,the changes of intraneuronal free calcium content and neuronal apoptosis were observed.Results cerebral ischemia/reperfusion could result in calcium overload and incerase of neuronal apoptosis.The change of intracellular free calcium content was in accordance with that of neuronal apoptosis induced by cerebral ischemia/reperfusion injury.Conclusions The calcium overload was involved in neuronal apoptosis induced by cerebral ischemia/reperfusion.
, 百拇医药
Key words Cerebral ischemia/reperfusion Calcium overload Neuronal apoptosis
近年来发现脑缺血/再灌流可以诱导神经元凋亡，神经元凋亡参与了脑缺血损伤〔1〕，但是脑缺血/再灌流诱导神经元凋亡的机理尚不清楚，这给神经元凋亡的防治带来了极大的困难。我们以往的研究发现，脑缺血/再灌流诱导神经元钙超载在神经元缺血损伤中起重要的作用。钙超载是否参与脑缺血/再灌流诱导的神经元的凋亡值得进一步研究。为此，我们采用Wistar大鼠全脑缺血/再灌流模型，观察脑缺血/再灌流脑组织突触小体游离钙与神经元凋亡的关系，旨在探讨钙在缺血诱导神经元凋亡中的作用，为临床缺血性脑血管病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物 健康Wistar大鼠随机分成缺血前、缺血20 min、缺血20 min再灌流1、6、24 h组，每组动物6只。实验动物由我校实验动物中心提供。主要试剂：Fura-2/AM从中国医学科学院购得。细胞凋亡测定试剂盒自德国Boehringer Mannheim GMbH购得。其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠全脑缺血模型制作 采用改良的Pulsinelli法〔2〕。
1.2.2 突触体内游离钙的测定 按照Dodd〔3〕的方法提取突触体。按照Giovanni等〔4〕的方法可测得突触体内的游离钙(nM)。
1.2.3 神经元凋亡的原位观察 用荧光标记的终末去氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TDT-mediated dUTP nick end labelling，TUNEL)〔5〕。实验动物达到缺血/再灌流时限时，迅速从左心室灌注10%福尔马林(4℃)，而后断头取脑，置灌注液中固定过夜(4℃)。常规石蜡包埋(软蜡)。常规切片(5 μm)，脱蜡，入水。蛋白酶K消化30 min(37℃)，0.15 MPBS冲洗。加入试剂盒中的反应成分37℃孵育60 min，0.15 MPBS冲洗。切片烤干，封片。用荧光显微镜观察，并记数每个切面的凋亡小体数目。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 采用Oxstat-Ⅱ进行统计学处理。
2 结 果
实验鼠脑缺血/再灌流突触体游离钙及神经元凋亡的变化 见表1。可见缺血后突触体游离钙含量明显高于缺血前的水平(P<0.001)。再灌流以后突触体游离钙含量进一步明显增高，不但明显高于缺血前水平，而且明显高于缺血20 min的水平(P均<0.001)。
表1 大鼠脑缺血/再灌流突触体游离钙及神经元凋亡数目(个/切面，n=6)的变化(
±s)
缺血前
缺血20 min
缺血20 min再灌流
, 百拇医药
1h
6h
24 h
〔Ca2+〕i
130.90±8.07
232.32±8.342)
427.34±37.362)
1 005.46±89.121)2)
907.58±39.911)2)
凋亡小体
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7.51±1.51
132.75±2.151)
24.57±2.441)2)
37.71±2.601)2)
115.14±5.271)2)
〔Ca2+〕i：触体游离钙的含量；1)P<0.001与缺血前组比较；2)P<0.001与缺血20 min组比较
3 讨 论
3.1 大鼠脑缺血/再灌流神经元凋亡的变化 我们的研究发现，在脑缺血前脑组织有一定的凋亡神经元，散布在皮层。这与Heron等〔6〕的观察是一致的，可能是一种生理性的细胞死亡，或者是与取材、紫外线的照射有关。而缺血以后，凋亡神经元明显增加。再灌流以后，随着再灌流的进行，凋亡神经元不断增加，这些增加的神经元主要分布在纹状体，这与Li〔7，8〕的实验结果一致。
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自Goto〔9〕1990年发现脑缺血可以引起神经元凋亡以来，很多学者都致力于这方面的研究。结合我们的观察，可以肯定脑缺血/再灌流可以引起神经元的凋亡，可见以往认为脑缺血/再灌流引起神经元坏死的观念是不全面的，因为凋亡也参与了缺血性脑损伤。很多研究表明凋亡的神经元主要存在于梗塞的内边缘，即缺血半影区。凋亡程度决定了缺血梗塞范围的大小，这迫使人们从防治凋亡的角度去探索缺血性脑血管病的治疗。
3.2 大鼠脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化 我们的研究发现，脑缺血时神经元内游离钙浓度明显增高；再灌流以后，神经元内游离钙浓度进一步升高，到再灌流6 h，神经元内游离钙浓度达到最高峰，以后钙浓度虽有下降，但仍高于缺血前水平。
正常神经元内的游离钙浓度很低，只有细胞外钙浓度的1/104。如此高的电化学梯度是依赖于细胞对钙的主动排出和细胞对钙的相对无通透性来完成的。细胞内的钙平衡对细胞生理功能的正常发挥是非常重要的。细胞通过以下机制来维持细胞内的钙平衡：①细胞对钙的主动泵出，这是一个消耗ATP的过程；②细胞内的钙储的缓冲；③某些蛋白的结合。如钙结合蛋白。而脑缺血/再灌流时，细胞内钙明显增高，这可能与以下因素有关：①脑缺血时细胞能量代谢受阻，钙排除受阻；②脑缺血时大量自由基生成，破坏了细胞膜对钙的屏障功能，大量钙流入细胞内；③脑缺血时谷氨酸大量释放导致钙内流；④脑缺血时蛋白激酶C(PKC)的激活通过多种途径参与了钙内流，如直接修饰钙通道〔10〕、促进自由基的生成、消耗ATP〔11〕及降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用〔12〕等。
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3.3 细胞内钙增高与神经元的凋亡 本观察发现脑缺血/再灌流后细胞内Ca2+浓度不断增加，伴有神经元凋亡的不断增加。这提示脑缺血导致的钙超载参与了神经元的凋亡。我们以往的研究发现，用钙通道阻滞剂尼莫通防止了脑缺血/再灌流导致的钙内流，同时也减少了脑缺血/再灌流导致神经元的凋亡，也证明钙超载参与了神经元的凋亡。
3.4 钙超载参与神经元凋亡的可能机理 钙超载参与神经元凋亡的机理目前尚不清楚，我们推测可能与以下因素有关：①钙超载破坏了线粒体的结构和功能，使细胞能量代谢受阻，ATP生成减少；②钙超载发生于细胞核，激活Ca2+-Mg2+依赖的内源性核酸内切酶，使DNA降解成185～200 bp核小体单位的DNA片段，神经元凋亡〔13〕；③钙超载可以促进自由基的生成从而导致神经元的凋亡；④钙超载可以激活PKC，PKC可通过多种途径引起神经元凋亡，如激活磷脂酶促进自由基生成、磷酸化核转录因子(NF-κΒ)，使其活化，使血管收缩，加重缺血缺氧等。值得一提的是钙超载可以激活PKC，PKC的激活又可以促进钙超载，形成恶性循环，导致神经元凋亡。
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国家自然科学基金资助项目(NO39670269)
作者简介：陈康宁，男，35岁，副教授，从事缺血性脑血管发病机理及防治的研究
参考文献
1，Okamoto M,Matsumoto M,Ohtsuki T et al.Internucleosomal DNA cleavage involved in ischemia-induced neuronal death.Biochem Biophys Res Commun，1993；196(3)：1356
2，Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral in the unanesthesized rat hemispheric ischemia.Stroke，1979；102(5)：267
, 百拇医药
3，Dodd PR.A rapid method for preparing synaptosome:Comparison with alternative procedures.Brain Res，1981；226(1-2)：107
4，Giovanni F,Blaustein MP.Calcium buffering and free Ca2+ in rat brain synaptosomes.J Neurochem，1993；60(3)：843
5，Clemins JA.Global cerebral ischemia activates nuclear factor-kB prior to evidence of DNA fragmentation.Mol Brain Res，1997；48(2)：187
6，Heron A,Pollard H,Dessi F et al.Regional variability in DNA fragmentation after global ischemia evidenced by combined histological and gel electrophresis obeservations in the rat brain.J Neurochem，1993；61(5)：1973
, http://www.100md.com
7，Li Y,Chopp M,Zhang Z et al.Ultrastructral and light microscopic evidence of apoptosis middle cerebral artery occulsion in the rat.Am J Pathol，1995；146(5)：1045
8，Li Y,Chopp M,Garcia JH et al.Induction of DNA fragmentation after 10～120 minutes of focal crerbral ischemia in rats.Stroke，1995；26(7)：1252
9，Goto K,Ishige A,Sekinguchi K et al.Effects of cycloheximide on delayed neuronal death in rat hippocampus.Brain Res，1990；534(1-2)：299
, 百拇医药
10，Chen L,Huang LYM.Protein kinase C reduces Mg2+ block of NMDA-Receptor channels as a mechanism of modulation.Nature，1992；356(6369)：521
11，王福庄，刘振伟，王要航 et al.降钙素基因相关肽对缺氧时海马细胞内游离钙的影响.中国应用生理杂志，1994；10(4)：325
12，Swartz KJ. Modulation of Ca2+ channels by kinase C in rat central and peripheral neurons:distribution of G protein-mediated inhitition.Neuron，1993；11(2)：305
13，Tominaga T,Kure S,Narisawa K et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain.Brain Res，1993；608(1)：21
收稿日期：1999-03-24
修回日期：2000-05-19, 百拇医药
单位：陈康宁(第三军医大学西南医院神经内科，重庆 400038)；董为伟(重庆医科大学神经病学研究所 400016)
关键词：钙超载；脑缺血；再灌流；神经元凋亡
中国老年学杂志000522摘 要 目的 观察钙超载与神经元凋亡的关系。方法 采用大鼠全脑缺血模型，观察脑缺血/再灌流后突触体游离钙、神经元凋亡的变化。结果 脑缺血/再灌流可以导致突触体游离钙增加及神经元的凋亡，脑缺血/再灌流神经元内游离钙浓度的变化与神经元凋亡的变化是一致的。结论 脑缺血/再灌流诱导钙超载参与了神经元凋亡。
An investigation of the relationship of calcium overload and neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion injury rats model
, 百拇医药
Chen Kangning,Dong Weiwei
(The South-West Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract：Objective To explore the relation between calcium overload induced by cerebral ischemia/reperfusion and neuronal apoptosis.Methods After the ischemia/reperfusion model was established in male Wistar rat,the changes of intraneuronal free calcium content and neuronal apoptosis were observed.Results cerebral ischemia/reperfusion could result in calcium overload and incerase of neuronal apoptosis.The change of intracellular free calcium content was in accordance with that of neuronal apoptosis induced by cerebral ischemia/reperfusion injury.Conclusions The calcium overload was involved in neuronal apoptosis induced by cerebral ischemia/reperfusion.
, 百拇医药
Key words Cerebral ischemia/reperfusion Calcium overload Neuronal apoptosis
近年来发现脑缺血/再灌流可以诱导神经元凋亡，神经元凋亡参与了脑缺血损伤〔1〕，但是脑缺血/再灌流诱导神经元凋亡的机理尚不清楚，这给神经元凋亡的防治带来了极大的困难。我们以往的研究发现，脑缺血/再灌流诱导神经元钙超载在神经元缺血损伤中起重要的作用。钙超载是否参与脑缺血/再灌流诱导的神经元的凋亡值得进一步研究。为此，我们采用Wistar大鼠全脑缺血/再灌流模型，观察脑缺血/再灌流脑组织突触小体游离钙与神经元凋亡的关系，旨在探讨钙在缺血诱导神经元凋亡中的作用，为临床缺血性脑血管病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物 健康Wistar大鼠随机分成缺血前、缺血20 min、缺血20 min再灌流1、6、24 h组，每组动物6只。实验动物由我校实验动物中心提供。主要试剂：Fura-2/AM从中国医学科学院购得。细胞凋亡测定试剂盒自德国Boehringer Mannheim GMbH购得。其他试剂均为国产分析纯。
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1.2 方法
1.2.1 Wistar大鼠全脑缺血模型制作 采用改良的Pulsinelli法〔2〕。
1.2.2 突触体内游离钙的测定 按照Dodd〔3〕的方法提取突触体。按照Giovanni等〔4〕的方法可测得突触体内的游离钙(nM)。
1.2.3 神经元凋亡的原位观察 用荧光标记的终末去氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TDT-mediated dUTP nick end labelling，TUNEL)〔5〕。实验动物达到缺血/再灌流时限时，迅速从左心室灌注10%福尔马林(4℃)，而后断头取脑，置灌注液中固定过夜(4℃)。常规石蜡包埋(软蜡)。常规切片(5 μm)，脱蜡，入水。蛋白酶K消化30 min(37℃)，0.15 MPBS冲洗。加入试剂盒中的反应成分37℃孵育60 min，0.15 MPBS冲洗。切片烤干，封片。用荧光显微镜观察，并记数每个切面的凋亡小体数目。
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1.3 统计学处理 采用Oxstat-Ⅱ进行统计学处理。
2 结 果
实验鼠脑缺血/再灌流突触体游离钙及神经元凋亡的变化 见表1。可见缺血后突触体游离钙含量明显高于缺血前的水平(P<0.001)。再灌流以后突触体游离钙含量进一步明显增高，不但明显高于缺血前水平，而且明显高于缺血20 min的水平(P均<0.001)。
表1 大鼠脑缺血/再灌流突触体游离钙及神经元凋亡数目(个/切面，n=6)的变化(
±s)缺血前
缺血20 min
缺血20 min再灌流
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1h
6h
24 h
〔Ca2+〕i
130.90±8.07
232.32±8.342)
427.34±37.362)
1 005.46±89.121)2)
907.58±39.911)2)
凋亡小体
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7.51±1.51
132.75±2.151)
24.57±2.441)2)
37.71±2.601)2)
115.14±5.271)2)
〔Ca2+〕i：触体游离钙的含量；1)P<0.001与缺血前组比较；2)P<0.001与缺血20 min组比较
3 讨 论
3.1 大鼠脑缺血/再灌流神经元凋亡的变化 我们的研究发现，在脑缺血前脑组织有一定的凋亡神经元，散布在皮层。这与Heron等〔6〕的观察是一致的，可能是一种生理性的细胞死亡，或者是与取材、紫外线的照射有关。而缺血以后，凋亡神经元明显增加。再灌流以后，随着再灌流的进行，凋亡神经元不断增加，这些增加的神经元主要分布在纹状体，这与Li〔7，8〕的实验结果一致。
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自Goto〔9〕1990年发现脑缺血可以引起神经元凋亡以来，很多学者都致力于这方面的研究。结合我们的观察，可以肯定脑缺血/再灌流可以引起神经元的凋亡，可见以往认为脑缺血/再灌流引起神经元坏死的观念是不全面的，因为凋亡也参与了缺血性脑损伤。很多研究表明凋亡的神经元主要存在于梗塞的内边缘，即缺血半影区。凋亡程度决定了缺血梗塞范围的大小，这迫使人们从防治凋亡的角度去探索缺血性脑血管病的治疗。
3.2 大鼠脑缺血/再灌流神经元游离钙的变化 我们的研究发现，脑缺血时神经元内游离钙浓度明显增高；再灌流以后，神经元内游离钙浓度进一步升高，到再灌流6 h，神经元内游离钙浓度达到最高峰，以后钙浓度虽有下降，但仍高于缺血前水平。
正常神经元内的游离钙浓度很低，只有细胞外钙浓度的1/104。如此高的电化学梯度是依赖于细胞对钙的主动排出和细胞对钙的相对无通透性来完成的。细胞内的钙平衡对细胞生理功能的正常发挥是非常重要的。细胞通过以下机制来维持细胞内的钙平衡：①细胞对钙的主动泵出，这是一个消耗ATP的过程；②细胞内的钙储的缓冲；③某些蛋白的结合。如钙结合蛋白。而脑缺血/再灌流时，细胞内钙明显增高，这可能与以下因素有关：①脑缺血时细胞能量代谢受阻，钙排除受阻；②脑缺血时大量自由基生成，破坏了细胞膜对钙的屏障功能，大量钙流入细胞内；③脑缺血时谷氨酸大量释放导致钙内流；④脑缺血时蛋白激酶C(PKC)的激活通过多种途径参与了钙内流，如直接修饰钙通道〔10〕、促进自由基的生成、消耗ATP〔11〕及降低G蛋白依赖的钙通道抑制作用〔12〕等。
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3.3 细胞内钙增高与神经元的凋亡 本观察发现脑缺血/再灌流后细胞内Ca2+浓度不断增加，伴有神经元凋亡的不断增加。这提示脑缺血导致的钙超载参与了神经元的凋亡。我们以往的研究发现，用钙通道阻滞剂尼莫通防止了脑缺血/再灌流导致的钙内流，同时也减少了脑缺血/再灌流导致神经元的凋亡，也证明钙超载参与了神经元的凋亡。
3.4 钙超载参与神经元凋亡的可能机理 钙超载参与神经元凋亡的机理目前尚不清楚，我们推测可能与以下因素有关：①钙超载破坏了线粒体的结构和功能，使细胞能量代谢受阻，ATP生成减少；②钙超载发生于细胞核，激活Ca2+-Mg2+依赖的内源性核酸内切酶，使DNA降解成185～200 bp核小体单位的DNA片段，神经元凋亡〔13〕；③钙超载可以促进自由基的生成从而导致神经元的凋亡；④钙超载可以激活PKC，PKC可通过多种途径引起神经元凋亡，如激活磷脂酶促进自由基生成、磷酸化核转录因子(NF-κΒ)，使其活化，使血管收缩，加重缺血缺氧等。值得一提的是钙超载可以激活PKC，PKC的激活又可以促进钙超载，形成恶性循环，导致神经元凋亡。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助项目(NO39670269)
作者简介：陈康宁，男，35岁，副教授，从事缺血性脑血管发病机理及防治的研究
参考文献
1，Okamoto M,Matsumoto M,Ohtsuki T et al.Internucleosomal DNA cleavage involved in ischemia-induced neuronal death.Biochem Biophys Res Commun，1993；196(3)：1356
2，Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral in the unanesthesized rat hemispheric ischemia.Stroke，1979；102(5)：267
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3，Dodd PR.A rapid method for preparing synaptosome:Comparison with alternative procedures.Brain Res，1981；226(1-2)：107
4，Giovanni F,Blaustein MP.Calcium buffering and free Ca2+ in rat brain synaptosomes.J Neurochem，1993；60(3)：843
5，Clemins JA.Global cerebral ischemia activates nuclear factor-kB prior to evidence of DNA fragmentation.Mol Brain Res，1997；48(2)：187
6，Heron A,Pollard H,Dessi F et al.Regional variability in DNA fragmentation after global ischemia evidenced by combined histological and gel electrophresis obeservations in the rat brain.J Neurochem，1993；61(5)：1973
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7，Li Y,Chopp M,Zhang Z et al.Ultrastructral and light microscopic evidence of apoptosis middle cerebral artery occulsion in the rat.Am J Pathol，1995；146(5)：1045
8，Li Y,Chopp M,Garcia JH et al.Induction of DNA fragmentation after 10～120 minutes of focal crerbral ischemia in rats.Stroke，1995；26(7)：1252
9，Goto K,Ishige A,Sekinguchi K et al.Effects of cycloheximide on delayed neuronal death in rat hippocampus.Brain Res，1990；534(1-2)：299
, 百拇医药
10，Chen L,Huang LYM.Protein kinase C reduces Mg2+ block of NMDA-Receptor channels as a mechanism of modulation.Nature，1992；356(6369)：521
11，王福庄，刘振伟，王要航 et al.降钙素基因相关肽对缺氧时海马细胞内游离钙的影响.中国应用生理杂志，1994；10(4)：325
12，Swartz KJ. Modulation of Ca2+ channels by kinase C in rat central and peripheral neurons:distribution of G protein-mediated inhitition.Neuron，1993；11(2)：305
13，Tominaga T,Kure S,Narisawa K et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain.Brain Res，1993；608(1)：21
收稿日期：1999-03-24
修回日期：2000-05-19, 百拇医药