Calcineurin 在大鼠心脏缺血预处理中的作用
作者：李淑莲 齐永芬 陈亚红 张英 王晓红 唐朝枢
单位：李淑莲(开封医学专科学校病理生理学教研室， 河南省开封市 475001)；齐永芬(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；陈亚红(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；张英(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；王晓红(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；唐朝枢(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)
关键词：缺血；Calcineurin；环孢霉素 A；再灌注损伤；大鼠
中国动脉硬化杂志000204[摘 要] 为观察环孢霉素(syclosporin A)对缺血预处理心脏保护作用的影响，探讨Calcineurin信号通路在心脏缺血预处理中的作用，制备离体大鼠心肌缺血/再灌注模型，测定心功能和心肌Calcineurin活性。结果发现，缺血预处理明显减轻缺血/再灌注的心功能抑制，与单纯缺血/再灌注比较，冠状动脉灌流量、收缩期左室内压最大变化速率和舒张期左室内压最大变化速率分别减少39%(P<0.05)、33%(P<0.01)和52%(P<0.05)，心肌钙含量下降21%(P<0.01)。Calcineurin 抑制剂环孢霉素A可抵消缺血预处理的心肌保护作用。此外，缺血45 min /再灌15 min 使心肌Calcineurin 活性升高，与对照组相比较，Calcineurin活性增加1.9倍(P<0.01)。单纯缺血预处理组心肌Calcineurin的活性较对照组增加2.3倍(P<0.01)。环孢霉素A预先处理心脏则完全阻断了缺血预处理诱导的Calcineurin激活，与缺血预处理组相比较，其活性下降75%(P<0.01)。以上提示Calcineurin途径介导了缺血预处理的心脏保护作用。
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[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-02-0103-04
The Role of Calcineurin in Ischemia Preconditioning of Rat Heart
LI Shu-Lian, QI Yong-Fen, CHEN YA-Hong, ZHANG Ying, WANG Xiao-Hong， and TANG Chao-Shu
(Institute of Cardiovascular Disease Research, the First Hospital, Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
, 百拇医药 ABSTRACT Aim To observe the effect of cyclosporin A( a inhibitor of calcineurin). On cardioprotection induced by ischemia preconditioning (IPC) and explore the role of calcineurin (CaN) signal pathway in IPC. Methods The model of ischemia /reperfusion (I/R) was produced in isolated rat heart. The cardic functions and the activity of myocardium calcineurin were mersured. Results It was found that IPC apparently attenuated the inhibition of cardic function induced by I/R. Compared with I/R group, in IPC group coronary perfusion flow(CPF),+LVdp/dt max and -LVdp/dt max decreased by 39%(P<0.01),33%(P<0.01) and 52%(P<0.01) respectively. Myocardial calcium content decreased by 21%(P<0.01). However CsA, the inhibitor of CaN, can conteract the cardioprotection effect of IPC. In addition, the activity of cardiac calcineurin was activated by cardiac I/R, compared with control group, the activity of CaN increased by 1.9 folds; ischemia preconditoning alone activated the activity of cardiac calcineurin and increased by 2.3 folds (P<0.01) compared with control group. Before ischemia preconditioning administration of CsA completely blocked the activation of calcineurin stimulated by IPC. Compared with IPC group, its activity decreased by 75%(P<0.01). Conclusion The results suggest that IPC-induced cardioprotective efffects are mediated by calcineurin pathway.
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MeSH Ischemia; Calcineurin; Cyclosporin A; Reperfusion Injury; Rat
预先反复短暂缺血可使心肌在后续的长期缺血中得到保护的现象称为缺血预处理(ischemia preconditioning, IPC)。缺血预处理现象在多种动物及人的心脏都获得证实,但其作用机理尚未完全阐明[1，2]。大量实验资料提示细胞蛋白激酶C激活及蛋白激酶C介导的蛋白磷酸化增强是预处理细胞保护的共同环节，但蛋白激酶C共同途径学说不能解释预处理细胞保护的全部现象[2]。现已发现丝裂素活化蛋白激酶系统也介导了IPC的细胞保护作用，并提出IPC现象的细胞内信号转导多途径的观点[1～3]。Calcineurin(CaN,钙调神经磷酸酶)是一种分布广泛、参与多种细胞功能调节的多功能Ca2+依赖蛋白磷酸酶，是Ca2+介导的细胞内信号转导途径中的重要因子[4,5]。本工作在离体大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)模型上观察CaN阻断剂环孢霉素A(cyclosporin A , CsA)对IPC心脏保护作用的影响，并观察IPC过程中CaN活性的变化，以探讨Ca2+-CaN去磷酸化细胞内信号转导途径在心脏缺血预处理中的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材 料
Wistar 大鼠由北京医科大学实验动物部提供；主要生物化学试剂和三磷酸腺苷测定药盒均购于Sigma 公司。32 P-三磷酸腺苷为NEN DoPont 产品。
1.2 离体大鼠心脏灌注模型制备
雄性Wistar 大鼠，体重200±50 g，戊巴比妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉，股静脉注射1%肝素(0.2 mL)抗凝。快速摘取心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，以37℃、95%O2-5%CO2平衡的Krebs-Henseleit(KH)液经主动脉逆插管以80 mmHg 恒压灌流。
1.3 分 组
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平衡预灌流15 min后随机分5组(每组6例)。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min；②单纯I/R组：大鼠心脏停灌45 min、再灌注15 min；③IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理之后，停灌45 min/再灌15 min；④IPC+CsA组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L,然后停灌45 min/再灌流15 min；⑤I/R+CsA组：操作同单纯I/R组，但再灌注的KH液中含CsA 1 μmol/L。
另取一批雄性Wistar 大鼠分4组(n=5)。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min;②I/R组：大鼠心脏停灌45 min/再灌注15 min；③单纯IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理；④CsA+IPC组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L。
1.4 观察指标
, 百拇医药
1.4.1 心功能 从左心耳插入球囊导管至左心室，经换能器在生理多导仪上检测收缩期左室内压最大变化速率(+dp/dt max)和舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dt max)。
1.4.2 心肌损伤指标 收集再灌15 min内的全部冠状动脉流出液并记录总量；以自动生物化学分析仪测乳酸脱氢酶活性；考马氏亮蓝法测心肌蛋白漏出量和比色法测肌红蛋白(Mb)漏出量。灌流结束后，留取100 mg心尖组织用试剂药盒测定心肌三磷酸腺苷含量。余下部分心肌组织制备匀浆，离心取上清用硫代巴比妥酸法测定心肌组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，部分心肌经硝酸消化后在原子吸收分光光度计上测定组织钙含量。
1.5 心肌组织Calcineurin活性测定[6]
灌流结束后取心尖部肌肉200 mg,加2 mL匀浆液(mmol/L: 50 Hepes， pH7.4, 28 mercaptoethanol, 0.5 PMSF, 0.1 Leupeptide, 0.1 Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, 2 benzamidine)，离心后上清液置于反应缓冲液中(mmol/L: 50 Hepes, pH7.4, 0.6 CaCl2, 28 mercaptoethanol，50 nmol/L Calmodulin, 3 g/L BSA, 30 nmol/L Calyculin A), 取50 μL含匀浆上清液的反应液加到25 μL 32 Pi标记的反应底物液中，30℃反应30 min，以冷Trichloroacetic acid(TCA) 15 μL终止反应。将反应体系置冰上15 min后离心，取上清45 μL点样于Whatman P81 paper, 干燥15 min后液闪计数，计算CaN 活性,以每分钟mmol 32 Pi/g Pr表示。
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1.6 32 P标记的底物液制备[7]
32 P标记的磷酸化组蛋白由 PKA 催化亚基催化组蛋白II-S磷酸化而成。90 mg组蛋白溶于15 mL 50 mmol /L Hepes 缓冲液(10 mmol/L Mg acetate,1 mmol/L DTT)中 。然后，加入0.6 mL 40 mmol/L DTT, 30 μg PKA，5 μmol/L 三磷酸腺苷和30 μCi γ-32 P-三磷酸腺苷到上述组蛋白溶液中，25℃孵育1 h，加TCA终止反应。离心，弃上清，沉淀用 15%的冷TCA洗2次后溶于7.5 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，然后置于 PBS 溶液中透析4 h，换含2.8 mmol/L mercaptoethanol的50 mmol/L Hepes pH7.4缓冲液透析过夜。32P标记的底物液4℃保存备用。
, http://www.100md.com 1.7 统计学处理
实验结果以均数±标准差表示,以单因素方差分析和组间q检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 离体灌流心脏冠状动脉灌流量和心功能的变化
与对照组相比较，缺血再灌注(I/R组)使大鼠冠状动脉灌流量降低36%(P<0.05),大鼠心脏+dp/dt max及-dp/dt max分别降低58%和72%(P<0.01)。缺血预处理(IPC组)明显减轻I/R的心功能抑制，其冠状动脉灌流量、+dp/dt max及-dp/dt max分别较单纯I/R组增加67%(P<0.05)、93%和126%(P<0.01)。但IPC前给予CaN的抑制剂CsA(CsA+IPC组)可部分抵消IPC的上述作用，与IPC组比较，冠状动脉灌流量、+dp/dt max和- dp/dt max分别下降38%、40%和41%(P<0.05)，其值与单纯I/R组相近(P>0.05) 。再灌流同时给予CsA(CsA+I/R组)对I/R引起的改变无明显影响，结果见表1(Table 1)所示。
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表1. 缺血预处理对大鼠冠状动脉灌流量、左室+dp/dt max和-dp/dt max的影响.
Table 1. Effects of IPC on CPF, LV+dp/dt max and -dp/dt max (
±s,n=6). Groups
CPF(mL/min)
+dp/dtmax
-dp/dtmax
Control
7.83±2
1 958±277
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1 429±435
I/R
4.98±1.33a
814±318b
407±130b
IPC
8.34±1.62c
1 569±240d
919±271c
CsA+IPC
, 百拇医药 5.20±1.55e
948±194e
545±75f
CsA+I/R
5.13±1.06
910±222
426±77
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, f: P<0.01,compared with IPC group.
, 百拇医药
2.2 心肌损伤指标的变化
缺血/再灌注引起心肌损伤，表现为细胞内酶(乳酸脱氢酶)、蛋白和肌红蛋白大量漏出；心肌脂质过氧化终产物和心肌钙含量增加而心肌能量生成(三磷酸腺苷含量)减少。IPC明显减轻上述损伤，与单纯I/R组比较，其心肌蛋白、肌红蛋白和乳酸脱氢酶漏出分别减少39%、33%和52%(P<0.01)；心肌钙含量下降21%(P<0.01)。但CaN抑制剂CsA可抵消IPC的保护作用，CsA+IPC组心脏的上述各项指标均高于IPC组(P<0.05或P<0.01)而接近单纯I/R组。在再灌注时给予CsA (CsA+I/R组)对I/R引起的损伤无明显影响，各指标与单纯I/R相近(P>0.05)。结果见表2 (Table 2)和表3 (Table 3)。
表2. 实验各组冠状动脉灌洗液中肌红蛋白、心肌蛋白含量和乳酸脱氢酶活性.
Table 2. Contents of Mb,myocardium protein and LDH activity(±s). Groups
, 百拇医药
Mb
(mg/L)
Protein
(mg/L)
LDH activity
(u/L)
Control
0.79±0.17
88.9±35.7
158±32
I/R
2.12±0.44b
, 百拇医药
255.7±75b
743±127b
IPC
1.41±0.4c
156.8±33.7d
360±116d
CsA+IPC
2.47±0.68e
302.7±72.1f
663±116f
, 百拇医药
CsA+I/R
2.14±0.34
218.9±34.2
708±115
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, f: P<0.01, compared with IPC group.表3. 实验各组心肌丙二醛、三磷酸腺苷和钙含量.
Table 3. Contents of calcium,MDA and ATP in all experimen groups (±s). Groups
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MDA
(μmol/g)
ATP
(mmol/g)
Calcium
(mmol/g)
Control
1.23±0.16
4.24±0.55
2.04±0.15
I/R
2.16±0.46a
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2.45±0.58b
2.78±0.17b
IPC
1.9±0.32
3.35±0.56c
2.21±0.2d
CsA+IPC
2.38±0.38
2.45±0.32
2.72±0.24e
, 百拇医药 CsA+I/R
2.14±0.5
2.38±0.31
2.65±0.24
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, compared with IPC group.
2.3 心肌组织Calcineurin活性变化
45 min停灌/15 min再灌刺激心脏CaN活性，与对照组相比较增加1.9倍(22.06±3.72比11.7±2.24,P<0.01)。单纯IPC (5 min停灌→5 min再灌重复3次)激活心脏CaN, 较对照组CaN活性增加2.3倍(26.68±2.56比11.27±2.24,P<0.01)。预先给予CsA可完全阻断IPC诱导的CaN活性，与IPC相比较其活性下降75% (6.6±2.25比26.68±2.56,P<0.01)。
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3 讨 论
不仅短暂的缺血能诱导心肌适应性保护作用，加热、内毒素、内皮素、去甲肾上腺素和血管紧张素等多种理化和药物及毒素的预先小剂量处理，均能诱导与缺血预处理相似的保护作用[2]。实验资料表明这些预处理因素均在不同程度上激活细胞蛋白激酶C，蛋白激酶C引起底物蛋白磷酸化参与了心肌适应性反应[1,2]。分析这些预处理因素刺激心肌细胞时除激活蛋白激酶C外，均可引起胞浆[Ca2+]的增加，因而推测细胞内Ca2+信号转导途径亦可能参与了IPC的心肌保护反应。近年证实磷酸酶1、2A、2B和2C可引起多种底物蛋白的去磷酸化而参与细胞内信号转导，其中只有磷酸酶2B(calcineurin)是Ca2+/Calmodulin依赖的。Ca2+/Calmodulin 激活CaN，后者通过使其多种底物蛋白如转录因子NF-ATs和收缩蛋白轻链等去磷酸化，从而参与基因表达和细胞收缩等多种功能反应[6，8]。
, 百拇医药
本工作在大鼠离体心脏灌流模型上发现IPC明显减轻后继I/R引起的心肌损伤。其作用表现为增加心肌收缩功能，增加冠状动脉灌流量和降低心肌组织损伤(乳酸脱氢酶、肌红蛋白和心肌组织蛋白漏出)、降低心肌钙超载，减轻能量(三磷酸腺苷)的严重缺失，同时还观察到IPC诱导心肌CaN活性成倍增加。而预先应用CaN抑制剂CsA则阻断了IPC诱导的CaN的激活，并消除了IPC的心脏保护作用。所观察的各项指标(IPC+CsA组)均劣于IPC组而接近单纯I/R组。本研究提示CaN途径介导了IPC的心脏保护作用。
在T细胞Cacineurin激活参与免疫反应；在心肌细胞CaN可能通过对转录因子NF-AT3去磷酸化，而使后者转位入细胞核，NF-AT3与锌指(zinc finger)转录因子GATA4相互作用导致了基因转录活化、基因表达增加而介导心肌肥大反应[9]；在血管平滑肌细胞通过磷脂酶C偶联到细胞表面受体而使NF-AT介导的转录增加参与血管舒缩反应与增殖[10]；在血管内皮细胞调节血管内皮通透性[6]。CaN/CaM-CaN介导心脏IPC适应性反应的机制目前尚不清楚，与蛋白激酶C途径和丝裂素活化蛋白激酶途径间是否存在交联(cross-talk)关系尚需进一步研究。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39730220)
[作者简介] 李淑莲，女，进修生，1989年毕业于河南医科大学，现任河南开封医学专科学校病理生理教研室讲师。唐朝枢，男，教授，博士生导师，1945年生，多年从事病理生理学教学和科研工作，在国内外发表数百篇论文。
参考文献
[1] 刘秀华. 预处理保护作用的普遍性及其机理探讨 [J]. 生理科学进展， 1998， 29： 39-41
[2] 刘秀华，王士雯，杨 军，等. 丝裂素活化蛋白激酶系统参与大鼠心脏缺血预处理的保护机制 [J]. 中华医学杂志， 1999， 79： 542-546
[3] Liu XH, Pang YZ, Tang CS, et al. Effect of hypoxic preconditioning on protein kinase C -mediated protein phosphorylation of vascular smooth muscle cells [J]. Pathophysiology, 1997, 4: 191-195
, 百拇医药
[4] Guerini D. Calcineurin: not just a simple protein phosphatase [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 235: 271-275
[5] Klee B, Ren H, Wang X. Regulation of the calmodulin stimulated protein phosphatase Calcineurin [J]. J Bio Chem, 1998, 273: 13 367-370
[6] Verin AD, Cooke C, Herenyiova M, et al. Role of Ca2+/calmoduliln-dependent phosphatase 2B in thrombin-induced endothelial cells contractile responses [J]. Am J Physiol, 1998, 275: L788-L799
, 百拇医药
[7] Ranger AM , Grushy MJ, Hodge MR, et al. The transcription factor NF-ATc is essential for cardiac valve formation [J]. Nature, 1998, 392(6 672): 186-196
[8] De-La -Pompa JL, Timmerman LA, Takimota H, et al. Role of the NF-ATc transcription factor in morphogenesis of cardiac valves and septum [J]. Nature, 1998, 392(6 672): 182-186
[9] Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin-dependent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy [J]. Cell, 1998, 93: 215-228
, 百拇医药
[10] Boss V, Abbott KL, Wang XF, et al. The cyclosporin A sensitive nuclaer factor of activited T cells (NFAT) proteins are expressed in vascular smooth muscle cells. Differential localization of NFAT isoforms and induction of NFAT-mediated transcription by phosphlipase C-coupled cell surface receptors [J]. J Biol Chem, 1998, 273: 19 664-671
1999-11-26 收到
2000-05-18 修回, 百拇医药
单位：李淑莲(开封医学专科学校病理生理学教研室， 河南省开封市 475001)；齐永芬(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；陈亚红(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；张英(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；王晓红(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)；唐朝枢(京医科大学第一医院心血管研究所， 北京市 100034)
关键词：缺血；Calcineurin；环孢霉素 A；再灌注损伤；大鼠
中国动脉硬化杂志000204[摘 要] 为观察环孢霉素(syclosporin A)对缺血预处理心脏保护作用的影响，探讨Calcineurin信号通路在心脏缺血预处理中的作用，制备离体大鼠心肌缺血/再灌注模型，测定心功能和心肌Calcineurin活性。结果发现，缺血预处理明显减轻缺血/再灌注的心功能抑制，与单纯缺血/再灌注比较，冠状动脉灌流量、收缩期左室内压最大变化速率和舒张期左室内压最大变化速率分别减少39%(P<0.05)、33%(P<0.01)和52%(P<0.05)，心肌钙含量下降21%(P<0.01)。Calcineurin 抑制剂环孢霉素A可抵消缺血预处理的心肌保护作用。此外，缺血45 min /再灌15 min 使心肌Calcineurin 活性升高，与对照组相比较，Calcineurin活性增加1.9倍(P<0.01)。单纯缺血预处理组心肌Calcineurin的活性较对照组增加2.3倍(P<0.01)。环孢霉素A预先处理心脏则完全阻断了缺血预处理诱导的Calcineurin激活，与缺血预处理组相比较，其活性下降75%(P<0.01)。以上提示Calcineurin途径介导了缺血预处理的心脏保护作用。
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[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-02-0103-04
The Role of Calcineurin in Ischemia Preconditioning of Rat Heart
LI Shu-Lian, QI Yong-Fen, CHEN YA-Hong, ZHANG Ying, WANG Xiao-Hong， and TANG Chao-Shu
(Institute of Cardiovascular Disease Research, the First Hospital, Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
, 百拇医药 ABSTRACT Aim To observe the effect of cyclosporin A( a inhibitor of calcineurin). On cardioprotection induced by ischemia preconditioning (IPC) and explore the role of calcineurin (CaN) signal pathway in IPC. Methods The model of ischemia /reperfusion (I/R) was produced in isolated rat heart. The cardic functions and the activity of myocardium calcineurin were mersured. Results It was found that IPC apparently attenuated the inhibition of cardic function induced by I/R. Compared with I/R group, in IPC group coronary perfusion flow(CPF),+LVdp/dt max and -LVdp/dt max decreased by 39%(P<0.01),33%(P<0.01) and 52%(P<0.01) respectively. Myocardial calcium content decreased by 21%(P<0.01). However CsA, the inhibitor of CaN, can conteract the cardioprotection effect of IPC. In addition, the activity of cardiac calcineurin was activated by cardiac I/R, compared with control group, the activity of CaN increased by 1.9 folds; ischemia preconditoning alone activated the activity of cardiac calcineurin and increased by 2.3 folds (P<0.01) compared with control group. Before ischemia preconditioning administration of CsA completely blocked the activation of calcineurin stimulated by IPC. Compared with IPC group, its activity decreased by 75%(P<0.01). Conclusion The results suggest that IPC-induced cardioprotective efffects are mediated by calcineurin pathway.
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MeSH Ischemia; Calcineurin; Cyclosporin A; Reperfusion Injury; Rat
预先反复短暂缺血可使心肌在后续的长期缺血中得到保护的现象称为缺血预处理(ischemia preconditioning, IPC)。缺血预处理现象在多种动物及人的心脏都获得证实,但其作用机理尚未完全阐明[1，2]。大量实验资料提示细胞蛋白激酶C激活及蛋白激酶C介导的蛋白磷酸化增强是预处理细胞保护的共同环节，但蛋白激酶C共同途径学说不能解释预处理细胞保护的全部现象[2]。现已发现丝裂素活化蛋白激酶系统也介导了IPC的细胞保护作用，并提出IPC现象的细胞内信号转导多途径的观点[1～3]。Calcineurin(CaN,钙调神经磷酸酶)是一种分布广泛、参与多种细胞功能调节的多功能Ca2+依赖蛋白磷酸酶，是Ca2+介导的细胞内信号转导途径中的重要因子[4,5]。本工作在离体大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)模型上观察CaN阻断剂环孢霉素A(cyclosporin A , CsA)对IPC心脏保护作用的影响，并观察IPC过程中CaN活性的变化，以探讨Ca2+-CaN去磷酸化细胞内信号转导途径在心脏缺血预处理中的作用。
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1 材料和方法
1.1 材 料
Wistar 大鼠由北京医科大学实验动物部提供；主要生物化学试剂和三磷酸腺苷测定药盒均购于Sigma 公司。32 P-三磷酸腺苷为NEN DoPont 产品。
1.2 离体大鼠心脏灌注模型制备
雄性Wistar 大鼠，体重200±50 g，戊巴比妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉，股静脉注射1%肝素(0.2 mL)抗凝。快速摘取心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，以37℃、95%O2-5%CO2平衡的Krebs-Henseleit(KH)液经主动脉逆插管以80 mmHg 恒压灌流。
1.3 分 组
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平衡预灌流15 min后随机分5组(每组6例)。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min；②单纯I/R组：大鼠心脏停灌45 min、再灌注15 min；③IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理之后，停灌45 min/再灌15 min；④IPC+CsA组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L,然后停灌45 min/再灌流15 min；⑤I/R+CsA组：操作同单纯I/R组，但再灌注的KH液中含CsA 1 μmol/L。
另取一批雄性Wistar 大鼠分4组(n=5)。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min;②I/R组：大鼠心脏停灌45 min/再灌注15 min；③单纯IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理；④CsA+IPC组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L。
1.4 观察指标
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1.4.1 心功能 从左心耳插入球囊导管至左心室，经换能器在生理多导仪上检测收缩期左室内压最大变化速率(+dp/dt max)和舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dt max)。
1.4.2 心肌损伤指标 收集再灌15 min内的全部冠状动脉流出液并记录总量；以自动生物化学分析仪测乳酸脱氢酶活性；考马氏亮蓝法测心肌蛋白漏出量和比色法测肌红蛋白(Mb)漏出量。灌流结束后，留取100 mg心尖组织用试剂药盒测定心肌三磷酸腺苷含量。余下部分心肌组织制备匀浆，离心取上清用硫代巴比妥酸法测定心肌组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，部分心肌经硝酸消化后在原子吸收分光光度计上测定组织钙含量。
1.5 心肌组织Calcineurin活性测定[6]
灌流结束后取心尖部肌肉200 mg,加2 mL匀浆液(mmol/L: 50 Hepes， pH7.4, 28 mercaptoethanol, 0.5 PMSF, 0.1 Leupeptide, 0.1 Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, 2 benzamidine)，离心后上清液置于反应缓冲液中(mmol/L: 50 Hepes, pH7.4, 0.6 CaCl2, 28 mercaptoethanol，50 nmol/L Calmodulin, 3 g/L BSA, 30 nmol/L Calyculin A), 取50 μL含匀浆上清液的反应液加到25 μL 32 Pi标记的反应底物液中，30℃反应30 min，以冷Trichloroacetic acid(TCA) 15 μL终止反应。将反应体系置冰上15 min后离心，取上清45 μL点样于Whatman P81 paper, 干燥15 min后液闪计数，计算CaN 活性,以每分钟mmol 32 Pi/g Pr表示。
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1.6 32 P标记的底物液制备[7]
32 P标记的磷酸化组蛋白由 PKA 催化亚基催化组蛋白II-S磷酸化而成。90 mg组蛋白溶于15 mL 50 mmol /L Hepes 缓冲液(10 mmol/L Mg acetate,1 mmol/L DTT)中 。然后，加入0.6 mL 40 mmol/L DTT, 30 μg PKA，5 μmol/L 三磷酸腺苷和30 μCi γ-32 P-三磷酸腺苷到上述组蛋白溶液中，25℃孵育1 h，加TCA终止反应。离心，弃上清，沉淀用 15%的冷TCA洗2次后溶于7.5 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，然后置于 PBS 溶液中透析4 h，换含2.8 mmol/L mercaptoethanol的50 mmol/L Hepes pH7.4缓冲液透析过夜。32P标记的底物液4℃保存备用。
, http://www.100md.com 1.7 统计学处理
实验结果以均数±标准差表示,以单因素方差分析和组间q检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 离体灌流心脏冠状动脉灌流量和心功能的变化
与对照组相比较，缺血再灌注(I/R组)使大鼠冠状动脉灌流量降低36%(P<0.05),大鼠心脏+dp/dt max及-dp/dt max分别降低58%和72%(P<0.01)。缺血预处理(IPC组)明显减轻I/R的心功能抑制，其冠状动脉灌流量、+dp/dt max及-dp/dt max分别较单纯I/R组增加67%(P<0.05)、93%和126%(P<0.01)。但IPC前给予CaN的抑制剂CsA(CsA+IPC组)可部分抵消IPC的上述作用，与IPC组比较，冠状动脉灌流量、+dp/dt max和- dp/dt max分别下降38%、40%和41%(P<0.05)，其值与单纯I/R组相近(P>0.05) 。再灌流同时给予CsA(CsA+I/R组)对I/R引起的改变无明显影响，结果见表1(Table 1)所示。
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表1. 缺血预处理对大鼠冠状动脉灌流量、左室+dp/dt max和-dp/dt max的影响.
Table 1. Effects of IPC on CPF, LV+dp/dt max and -dp/dt max (
±s,n=6). GroupsCPF(mL/min)
+dp/dtmax
-dp/dtmax
Control
7.83±2
1 958±277
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1 429±435
I/R
4.98±1.33a
814±318b
407±130b
IPC
8.34±1.62c
1 569±240d
919±271c
CsA+IPC
, 百拇医药 5.20±1.55e
948±194e
545±75f
CsA+I/R
5.13±1.06
910±222
426±77
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, f: P<0.01,compared with IPC group.
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2.2 心肌损伤指标的变化
缺血/再灌注引起心肌损伤，表现为细胞内酶(乳酸脱氢酶)、蛋白和肌红蛋白大量漏出；心肌脂质过氧化终产物和心肌钙含量增加而心肌能量生成(三磷酸腺苷含量)减少。IPC明显减轻上述损伤，与单纯I/R组比较，其心肌蛋白、肌红蛋白和乳酸脱氢酶漏出分别减少39%、33%和52%(P<0.01)；心肌钙含量下降21%(P<0.01)。但CaN抑制剂CsA可抵消IPC的保护作用，CsA+IPC组心脏的上述各项指标均高于IPC组(P<0.05或P<0.01)而接近单纯I/R组。在再灌注时给予CsA (CsA+I/R组)对I/R引起的损伤无明显影响，各指标与单纯I/R相近(P>0.05)。结果见表2 (Table 2)和表3 (Table 3)。
表2. 实验各组冠状动脉灌洗液中肌红蛋白、心肌蛋白含量和乳酸脱氢酶活性.
Table 2. Contents of Mb,myocardium protein and LDH activity(
±s). Groups, 百拇医药
Mb
(mg/L)
Protein
(mg/L)
LDH activity
(u/L)
Control
0.79±0.17
88.9±35.7
158±32
I/R
2.12±0.44b
, 百拇医药
255.7±75b
743±127b
IPC
1.41±0.4c
156.8±33.7d
360±116d
CsA+IPC
2.47±0.68e
302.7±72.1f
663±116f
, 百拇医药
CsA+I/R
2.14±0.34
218.9±34.2
708±115
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, f: P<0.01, compared with IPC group.表3. 实验各组心肌丙二醛、三磷酸腺苷和钙含量.
Table 3. Contents of calcium,MDA and ATP in all experimen groups (
±s). Groups, http://www.100md.com
MDA
(μmol/g)
ATP
(mmol/g)
Calcium
(mmol/g)
Control
1.23±0.16
4.24±0.55
2.04±0.15
I/R
2.16±0.46a
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2.45±0.58b
2.78±0.17b
IPC
1.9±0.32
3.35±0.56c
2.21±0.2d
CsA+IPC
2.38±0.38
2.45±0.32
2.72±0.24e
, 百拇医药 CsA+I/R
2.14±0.5
2.38±0.31
2.65±0.24
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group; c: P<0.05, d: P<0.01, compared with I/R group; e: P<0.05, compared with IPC group.
2.3 心肌组织Calcineurin活性变化
45 min停灌/15 min再灌刺激心脏CaN活性，与对照组相比较增加1.9倍(22.06±3.72比11.7±2.24,P<0.01)。单纯IPC (5 min停灌→5 min再灌重复3次)激活心脏CaN, 较对照组CaN活性增加2.3倍(26.68±2.56比11.27±2.24,P<0.01)。预先给予CsA可完全阻断IPC诱导的CaN活性，与IPC相比较其活性下降75% (6.6±2.25比26.68±2.56,P<0.01)。
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3 讨 论
不仅短暂的缺血能诱导心肌适应性保护作用，加热、内毒素、内皮素、去甲肾上腺素和血管紧张素等多种理化和药物及毒素的预先小剂量处理，均能诱导与缺血预处理相似的保护作用[2]。实验资料表明这些预处理因素均在不同程度上激活细胞蛋白激酶C，蛋白激酶C引起底物蛋白磷酸化参与了心肌适应性反应[1,2]。分析这些预处理因素刺激心肌细胞时除激活蛋白激酶C外，均可引起胞浆[Ca2+]的增加，因而推测细胞内Ca2+信号转导途径亦可能参与了IPC的心肌保护反应。近年证实磷酸酶1、2A、2B和2C可引起多种底物蛋白的去磷酸化而参与细胞内信号转导，其中只有磷酸酶2B(calcineurin)是Ca2+/Calmodulin依赖的。Ca2+/Calmodulin 激活CaN，后者通过使其多种底物蛋白如转录因子NF-ATs和收缩蛋白轻链等去磷酸化，从而参与基因表达和细胞收缩等多种功能反应[6，8]。
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本工作在大鼠离体心脏灌流模型上发现IPC明显减轻后继I/R引起的心肌损伤。其作用表现为增加心肌收缩功能，增加冠状动脉灌流量和降低心肌组织损伤(乳酸脱氢酶、肌红蛋白和心肌组织蛋白漏出)、降低心肌钙超载，减轻能量(三磷酸腺苷)的严重缺失，同时还观察到IPC诱导心肌CaN活性成倍增加。而预先应用CaN抑制剂CsA则阻断了IPC诱导的CaN的激活，并消除了IPC的心脏保护作用。所观察的各项指标(IPC+CsA组)均劣于IPC组而接近单纯I/R组。本研究提示CaN途径介导了IPC的心脏保护作用。
在T细胞Cacineurin激活参与免疫反应；在心肌细胞CaN可能通过对转录因子NF-AT3去磷酸化，而使后者转位入细胞核，NF-AT3与锌指(zinc finger)转录因子GATA4相互作用导致了基因转录活化、基因表达增加而介导心肌肥大反应[9]；在血管平滑肌细胞通过磷脂酶C偶联到细胞表面受体而使NF-AT介导的转录增加参与血管舒缩反应与增殖[10]；在血管内皮细胞调节血管内皮通透性[6]。CaN/CaM-CaN介导心脏IPC适应性反应的机制目前尚不清楚，与蛋白激酶C途径和丝裂素活化蛋白激酶途径间是否存在交联(cross-talk)关系尚需进一步研究。
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[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39730220)
[作者简介] 李淑莲，女，进修生，1989年毕业于河南医科大学，现任河南开封医学专科学校病理生理教研室讲师。唐朝枢，男，教授，博士生导师，1945年生，多年从事病理生理学教学和科研工作，在国内外发表数百篇论文。
参考文献
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1999-11-26 收到
2000-05-18 修回, 百拇医药