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编号:10273013
利用卵巢癌抗独特型抗体制备的Ab3及其功能特性研究
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 1993年第10期
     作者:吕文英 钱和年 李文锦

    单位:

    关键词:卵巢肿瘤;抗-抗体

    中华医学杂志931002 摘要 利用卵巢抗原内摄像型单克隆抗独特型抗体6B11和1H12代替肿瘤抗原,诱导动物产生特异性体液免疫反应。经ELISA检测证明,由抗独特抗体(Ab2)刺激产生的抗-抗独特型抗体(Ab3)能与卵巢癌组织抗原OC166-9特异性结合。用Western blot方法分析证明Ab3血清和卵巢癌单克隆抗体COC166-9(Ab1)识别同一分子量的蛋白抗原,近而证明Ab3与Ab1的抗原结合特性相同。Ab3血清还可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用特异性杀伤卵巢癌XKOV3细胞,表明其与Ab1的功能特点相似,从而证明6B11和1H12能够代替抗原诱导未致敏动物产生特殊性免疫反应,具有抗原模拟作用。这一研究对6B11和1H12作为卵巢癌抗独特型疫苗的实际应用有重要意义。
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    由于肿瘤抗原的性质不明,纯化困难,不易与正常组织区别,难以用于临床治疗。用抗独特型抗体(简称抗Id抗体或Ab2)代替肿瘤抗原诱导肿瘤特异性保护免疫是一条值得探索的肿瘤防治途径。我们利用卵巢癌抗原内影像型Ab2代替抗原诱导动物产生特异性抗体反应,即产生抗-抗Id抗体(简称Ab3),并对其特性进行了有关鉴定。

    材料与方法

    一、单克隆抗体及其偶联物

    将卵巢抗原内影像型单克隆抗Id抗体6B11和1H[1]12,用戊醛交联法与钥孔 虫血蓝素(KLH,Sigma公司产品)偶联,用于动物免疫。

    二、Ab3血清的制备
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    将6B11—KLH50μg、100μg及200μg和1H11—KLH100μg及200μg,辅以完全福氏佐剂腹腔免疫同系BALB/C小鼠(来自中国医学科学院动物研究所),每组5只。二周后用不全佐剂加强免疫1次,再用水剂强化攻击2次,于末次加强免疫后5天放血,分离血清,—20℃保存备用。以单纯KLH(100μg)免疫作为对照。

    三、Ab3血清特异性的鉴定

    1.ELISA间接法:参见文献[2],在包被卵巢癌组织抗原OC166-9(本室提供)的反应板内加入不同稀释度Ab3血清,孵育后再与酶标(HRP)羊抗鼠IgG反应,用邻苯二胺底物系统显色,测492mm处光密度值。抗KLH血清和正常鼠血清为对照。

    2.免疫印迹分析(Western blot):参见文献[3],免疫染色的基本步骤是将转印有OC166-9抗原的纤维膜用10%正常羊血清封闭,然后加入1:20稀释的Ab3血清,4℃反应过夜,充分洗涤后与HRP—羊抗鼠IgG反应,最后用含0.03%H2的3′,3′-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)溶液显色。以卵巢癌单抗COC166-9作对照染色[4]
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    四、Ab3介导的卵巢癌细胞体外杀伤实验(ADCC)

    1.效应细胞和靶细胞:用淋巴细胞分层液分离正常人新鲜静脉血中的淋巴细胞作为效应细胞。卵巢癌细胞系SKOV3(美国Sloan Kettering Cancer Center)作为靶细胞。

    2.无菌试管内加入0.1ml SKOV3细胞(2×104)和Ab3血清,混匀后加入0.1ml淋巴细胞。使效/靶=10:1,Ab3血清终浓度1:10,混匀置37℃孵育4小时。

    3.孵育后的细胞用0.4%台盼蓝染色,显微镜下用白细胞计数板计数四大格癌细胞中染色细胞数目,每份标本取样3次,按均值计算杀伤率。资料用卡方检验进行统计学处理。
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    结 果

    一、不同剂量免疫血清效价的比较

    经过Ab2反复免疫获得的抗血清,用ELISA检测证明能与卵巢癌组织抗原OC166-9结合,且结合力(吸光度492值)随血清稀释度增加而降低(图1,100μg免疫血清),表明用Ab2免疫的血清中存在同卵巢癌抗原结合的特异性抗体(Ab3)。抗KLH血清和正常鼠血清仅在高浓度(1:5)时与OC166-9发生一定的吸附作用,随浓度下降迅速降到一个趋于平稳的低值。不同剂量6B11免疫血清,其抗体效价基本相似;1H12免疫血清效价与免疫剂量有关,200μg免疫血清效价明显高于100μg免疫血清,相同稀释度下的吸光度值相差3倍。
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    Ab3血清稀释度

    A:Ab3(6b11) B:Ab3(1H12) C:抗KLH血清 D:正常鼠血清

    图1 血清与卵巢癌抗原OC166-9结合的ELISA检测

    二、免疫印迹分析

    图2可见Ab3血清和卵巢癌单抗COC166-9(Ab1)所识别的抗原性蛋白处在同一电泳位置上,即它们沉淀相同分子量的蛋白,进一步证明了Ab3与Ab1具有相同抗原结合特性。
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    第一条:标准分子量蛋白,第二条:Ab1(COC166-9,10μg/ml),第三条:Ab3(6B11)1:10,第四条:Ab3(1H12)1:10,第五条:氨基黑染色

    图2 Ab3血清与卵巢癌抗原OC166-9结合的Western blot分析

    三、Ab3介导对卵巢癌细胞的杀伤作用

    用6B11和1H12免疫产生的Ab3血清(1:10)均能通过细胞毒(ADCC)机制特异性杀伤靶细胞SKOV3(附表)。这种杀伤能力与卵巢癌单抗COC166-9(Ab1)介导的杀伤作用相近,两者之间差异无显著意义(P>0.05),两种Ab3血清介导的杀伤率之间差异无显著意义,均明显高于抗KLH血清和正常鼠血清(P〈0.01)。Ab3介导对无关靶细胞(胃癌细胞)的杀伤率明显低于对靶细胞的杀伤率(P〈0.01),表明6B11和1H12诱导的Ab3血清只特异性杀伤卵巢癌细胞,具有同Ab1相似的功能特性。
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    附表 Ab3血清通过ADCC机制对癌细胞的体外杀伤作用 抗体

    SKOV3

    GAC*

    染色细胞均数

    杀伤率(%)

    染色细胞均数

    杀伤率(%)

    COC166-9

    48.0(8.5)

    84.1

    5.9(44.1)
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    6.2

    Ab3(6B11)

    31.6(12.7)

    69.2

    4.1(35.1)

    3.1

    Ab3(1B12)

    26.5(10.1)

    69.9

    4.5(34.5)

    4.2
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    抗KLH血清

    5.6(30.5)

    7.8……

    正常鼠血清

    4.8(33.5)

    4.9……

    注:括号内数字为未染细胞均数,*胃癌细胞系,…未测

    讨 论

    肿瘤抗原的抗原性较弱,且带瘤宿主经常处于免疫抑制状态,难以激发有效的抗肿瘤反应。80年代以来,许多学者通过动物实验证明用抗原内影像型Ab2(又称抗独特型疫苗)能够克服免疫抑制,诱导机体产生特异性免疫应答[5]。本文从免疫网络学说的基本理论出发,用Ab2代替卵巢癌抗原OC166-9,诱导与卵巢癌单抗COC166-9(Ab1)功能特性相似的Ab3。免疫网络理论认为,抗体(Ab1)分子上存在的独特型(Id)抗原决定族可以刺激机体产生抗Id抗体(Ab3)及Ab4等一系列抗体的产生,从而构成一个复杂的免疫网络。用Ab2代替抗原的免疫效果受诸多因素影响,如Ab2的呈递方式,免疫剂量等。单独用Ab2诱导的抗体反应较弱,当把Ab2与载体(LSP、KLH等)交联后就能诱导很强的抗体反应[6]。本实验中我们将6B11和1H12与KLH交联形成大分子交联物,以提高免疫效果,交联前用ELISA检测证明KLH与卵巢癌单抗COC166-9及抗原OC166-9均无交叉反应。Ab2的免疫剂量是比较公认的关键因素,小鼠免疫剂量以大于50μg为佳[6]。别分用50μg、100μg及200μg6B11免疫同系小鼠的结果提示,6B11免疫效果与剂量无明显相关性;1H12免疫效果随剂量增加而提高,200μg免疫血清效价明显高于100μg组,这种差别可能由Ab2本身的性质所决定。
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    用Ab2诱导产生的Ab3是一个非均一性“家族”。一类是真性Ab3,它能诱导产生Ab4,但缺乏抗原结合能力;另一类是Ab1样Ab3(Ab1),这类Ab3具备Ab1的免疫化学特性和功能特征,有重要实用意义[7]。我们用Western blot方法分析证明,6B11和1H12诱导的Ab3血清同卵巢癌单抗COC166-9识别同一分子量的蛋白抗原,即抗原结合特性相同。通过对Ab3介导杀伤癌细胞作用的观察,证明Ab3与Ab1的功能特性相似,可通过ADCC作用特异性杀伤卵巢癌细胞,从而为卵巢癌抗Id抗体6B11和1H12作为抗独特型疫苗应用提供了有力依据,为卵巢癌防治探索一条全新途径。
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    参考文献

    1 吕文英,钱和年:卵巢癌抗独特型抗体的制备.第三届全国妇科肿瘤学术会议资料汇编,1992,51.

    2 佘 主编,临床免疫技术.上海科学技术出版社,1982,224-225.

    3 Towbin H,Staehelin T, Gordon J.Electrophoretic transter of proteins form polyacerylamide gels nitrocellulose sheets:procedure and some applications Proc Natl Acad Sci USA,1979,76:4350.

    4 钱和年,冯 婕,崔 恒,等.抗卵巢上皮癌相关抗原单克隆抗体COC166-9的制备.北京医科大学学报,1987,19:211.
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    5 Bhattacharya CM, Mukerjee S,biddle W,et al. Murine monoclonal anti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonic antigen. J Immumol, 1990,145:2758.

    6 王大坤.抗独特型抗体制备和应用要点.国外医学*免疫学分册,1989,67:281.

    7 Bona CA.Functional immune network.In:Atassi MZeds: Molecular Immunology. New York:Marcel Dekker, 1984,255.

    (收稿:1992-12-11 修回:1993-07-07), 百拇医药