抗原致敏人支气管平滑肌β2受体-腺苷酸环化酶偶联失常
作者：宋平方 杨肇享 黄勇 段绪伟 段洁
单位：第三军医大学附属大坪医院呼吸内科 重庆，400042
关键词：肾上腺素能β2受体；腺苷酸环化酶；哮喘
第三军医大学学报990311
提要 目的：观察抗原刺激是否引起被动致敏的离体人支气管β2受体-腺苷酸环化酶偶联失常。方法：内径2～4 mm的支气管来源于12例接受肺叶切除手术的病人，用高效价的抗屋尘螨-IgE血浆致敏支气管。正常被动致敏及抗原刺激后的支气管分别用于建立腺苷酸环化酶兴奋剂Forskolin和β2受体兴奋剂舒喘灵累加浓度反应曲线。结果：与正常及被动致敏的支气管比较，抗原刺激后的支气管舒喘灵的反应减弱，而对Forskolin的反应无明显变化。结论：抗原刺激引起的被动致敏离体人支气管β2受体功能低下与β2受体-腺苷酸环化酶失偶联有关。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R562.250.2
Abnormality of coupling between β2 receptor and adenylyl cyclase in isolated human bronchi passively sensitized by allergen
Song Pingfang, Yang Zhaoheng, Huang Yong, Duan Xuwei, Duan Jie
(Department of Respiratory Diseases, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042)
Abstract Objective: To determine if allergen challenge can result in the abnormality of coupling between β2 receptor and adenylyl cyclase (AC) in isolated passively sensitized human bronchi. Methods: Bronchus rings of 2-4 mm in diameter were obtained from 12 patients undergoing lobectomy. Passive sensitization of human bronchi was induced with the serum containing high level of IgE to house dust mite. The control, sensitized and allergen-challenged rings were used to establish the cumulative concentration-response curves to β2 receptor simulant, salbutamol and forskolin that is an AC activator. Results: The relaxant response to salbutamol was reduced but the relaxant effect to forskolin remained unchanged in the challenged rings as compared with those in the control and passively sensitized rings. Conclusion: Dysfunction of β2 receptor due to allergen in passively sensitized human bronchus rings is related to abnormality of coupling between β2 receptor and AC.
, 百拇医药
Key words adrenergic beta-2 receptor; adenylyl cyclase; asthma
支气管哮喘发作后或体外抗原刺激后被动致敏的支气管呈现β受体功能低下[1，2]，β受体活化是通过细胞膜上刺激性G蛋白兴奋腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase,AC)使细胞内cAMP产生增加，从而舒张支气管平滑肌，抑制肥大细胞过敏介质释放等。因此，如果支气管平滑肌存在β受体-AC之间的信息传导失常，就会表现为β受体功能低下。本实验通过观察抗原致敏的人离体支气管对β2受体兴奋剂舒喘灵与腺苷酸环化酶兴奋剂Forskolin[3]的反应性来阐明哮喘发作后β2受体功能低下是否由于β2受体-AC偶联失常所致。
1 材料和方法
1.1 组织来源及准备
, 百拇医药
人支气管来源于12例接受肺叶切除手术的肺癌患者(45～65岁，男性9例，女性3例)。近期均未服用β受体兴奋剂、茶碱类或抗胆碱类药物。组织离体后置于预冷的PBS缓冲液中。在远离病变区分离出内径2～4 mm的支气管，清除周围的结缔组织、血管，制成宽4～5 mm的支气管环。
1.2 药物
舒喘灵、卡巴胆碱(Sigma,USA)，Forskolin(RBI,USA)，屋尘螨抗原(Milan,Italy)。
1.3 被动致敏
将支气管置入通有95%O2、5%CO2气体的稀释10倍的高效价抗屋尘螨-IgE血浆中(特异性IgE>20 u/ml)，并在室温过夜。正常对照支气管用正常人血浆代替。
1.4 抗原刺激
, 百拇医药
将被动致敏的支气管置于5ml PBS缓冲液中，给予95%O2，5%CO2，加屋尘螨抗原5 mg，在37℃下刺激60 min。正常对照被动致敏的支气管则加5 mg牛血清白蛋白处理。
1.5 实验程序
用L型钢丝钩将支气管环悬挂于有95%O2，5%CO2混合气体，温度37℃的25 ml PBS缓冲液中，下端固定于组织浴杯底部，上端与张力传感器连接。Model FT03D(USA)多道生理仪连续记录张力变化。给予支气管环1.0 g的初始张力，在缓冲液中平衡2 h，每20 min更换缓冲液一次。
舒喘灵累加浓度反应曲线：6例患者的18个支气管环(对照、被动致敏、抗原刺激各6个)，10-6mol/L卡巴胆碱引起支气管收缩后以累加浓度方法加入舒喘灵10-9～10-4mol/L以建立舒喘灵舒张反应曲线。
, http://www.100md.com
Forskolin累加浓度反应曲线：另6例患者的18个支气管环同样分3组，先用10-6mol/L卡巴胆碱收缩支气管后，以累加浓度方法加入Forskolin 10-9～10-5mol/L,以建立Forskolin舒张反应曲线。
建立累加浓度反应曲线后，用PBS缓冲液每5 min冲洗一次，连续1 h，然后加入25 mg屋尘螨抗原至有正常对照和被动致敏的组织浴杯中观察有无收缩反应出现。实验结束后，用纸吸干水分称重。
1.6 数据处理
用舒喘灵与Forskolin的累加浓度反应曲线计算IC50(药物产生最大舒张反应50%时的克分子浓度)。作配对资料t检验。
2 结果
, http://www.100md.com 36个支气管环的平均重量为(109±30)mg，各组间差异不显著(P>0.05)。
12个被动致敏的支气管环在加入屋尘螨抗原后产生明显的收缩反应，而正常对照的支气管环均无收缩反应出现。
由卡巴胆碱所致的支气管环收缩力各组间差异不显著(P>0.05)，见表1。舒喘灵产生的浓度依赖性的支气管舒张反应(P<0.001)，抗原刺激后的支气管环与正常对照、被动致敏的比较：舒喘灵累加反应曲线右移，IC50值增大，见表2与图1。
图1 舒喘灵累加浓度反应曲线
○-○：正常对照；■-■：被动致敏；+-+：抗原刺激；抗原刺激组支气管环与正常对照和被动致敏组比较：P<0.01
, 百拇医药
Fig 1 The cumulative concentration-response curves to salbutamol of human bronchi rings
○-○：Control;■-■：The sensitized;+-+：The allergen challenged; The rings challenged by the allergen vs control, the sensitized: P<0.001
表1 1 μmol/L卡巴胆碱所致的支气管环收缩力(g/g组织)
Tab 1 Constriction of bronchi rings inducedby 1 μmol/L carbachol (g/g) Group
n
, http://www.100md.com
Forskolin
Sallutamol
Control
12
17.6±3.6
15.6±2.6
Passively sensitized
12
17.9±3.5
17.6±4.0
Allergen challenged
12
, http://www.100md.com
17.6±3.6
16.6±4.0*
*:P>0.05 vs the control,passive sensitized表2 舒喘灵与Forskolin的IC50值(-logM)
Tab 2 The IC50 of salbutamol and forskolin (-logM) Group
n
Forskolin
Sallutamol
Control
12
, 百拇医药
6.73±0.35
6.74±0.34
Passively sensitized
12
6.86±0.34
6.76±0.35
Allergen challenged
12
6.79±0.39
6.17±0.39***
***:P<0.001 vs the control,passive sensitized
, 百拇医药
2.4 Forskolin累加浓度反应曲线
卡巴胆碱引起的收缩力各组间差异不显著(P>0.05)，见表1，Forskolin引起剂量依赖性支气管环舒张反应(P<0.001)，但累加浓度反应曲线、IC50值三组间差异不明显，见表2。
3 讨论
本研究表明：抗原刺激被动致敏的离体人支气管引起支气管平滑肌对舒灵的反应性减弱；而对Forskolin的反应性保持不变。本研究中，所有被动致敏的支气管在抗原刺激后出现明显收缩反应，而作正常对照的支气管均无收缩反应出现，因此正常对照、被动致敏、抗原刺激三组支气管的区分是可信的。以前的实验证实1 μmol/L卡巴胆碱所致的收缩反应相当于最大反应的50%[2]。本实验中，由1 μmol/L卡巴胆碱所致的引起的支气管收缩力三组间差异不显著，所以，三组间舒喘灵反应性的差异并非由于卡巴胆碱引的收缩力各异所致。
, 百拇医药
舒喘灵是特异性的β2受体兴奋剂，抗原刺激被动致敏的支气管对舒喘灵反应减弱，提示为β2受体功能低下，而被动致敏的支气管对舒喘灵反应正常，表示β2受体功能无显著变化，Bai[1]和Villanove[4]的报道支持本实验结果。Forskolin是腺苷酸环化酶兴奋剂，抗原刺激被动致敏的支气管对Forskolin的反应性正常表明腺苷酸环化酶反应性正常；抗原刺激后出现的支气管β2受体功能低下可能是β2受体-AC信息传导障碍所致。
炎症细胞产生的过敏介质被认为是与β2受体功能异常有关，在离体的人支气管中，肥大细胞是主要的产生介质的炎症细胞[5]，但是与β2受体功能低下的关系有待进一步证实。
作者简介：宋平方，男，35岁，主治医师，讲师，博士研究生，现在意大利热那亚大学
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bai T R. Abnormalities in airway smooth muscle in fatal asthma. Am Rev Respir Dis,1990,141(3):552
2 Song P, Milanese M, Crimi E,et al. Allergen chanllenge of passively sensitized huamn bronchi alters M2 and β2 receptor function. Am J Res Crit Care Med,1997,155(4):1230
3 Seaman K B, Daly J W. Forskolin:its biological and chemical properties. Adv Cyclic Nucleotide Protein Phossphorylation Res,1986,20:1～150
, 百拇医药
4 Villanove X, Marthan R, Tunon J M, et al. Sensitization decreases relaxation in human isolated airway. Am Rev Respir Dis,1993,148(1):107
5 Milanese M, Song P, Crimi E, et al. Cellular involvement in allergen-induced contraction of passively sensitized human bronchi. Eur Respir J,1995,8:s263
(收稿：1998-05-25；修回：1998-10-27), 百拇医药
单位：第三军医大学附属大坪医院呼吸内科 重庆，400042
关键词：肾上腺素能β2受体；腺苷酸环化酶；哮喘
第三军医大学学报990311
提要 目的：观察抗原刺激是否引起被动致敏的离体人支气管β2受体-腺苷酸环化酶偶联失常。方法：内径2～4 mm的支气管来源于12例接受肺叶切除手术的病人，用高效价的抗屋尘螨-IgE血浆致敏支气管。正常被动致敏及抗原刺激后的支气管分别用于建立腺苷酸环化酶兴奋剂Forskolin和β2受体兴奋剂舒喘灵累加浓度反应曲线。结果：与正常及被动致敏的支气管比较，抗原刺激后的支气管舒喘灵的反应减弱，而对Forskolin的反应无明显变化。结论：抗原刺激引起的被动致敏离体人支气管β2受体功能低下与β2受体-腺苷酸环化酶失偶联有关。
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中图法分类号 R562.250.2
Abnormality of coupling between β2 receptor and adenylyl cyclase in isolated human bronchi passively sensitized by allergen
Song Pingfang, Yang Zhaoheng, Huang Yong, Duan Xuwei, Duan Jie
(Department of Respiratory Diseases, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042)
Abstract Objective: To determine if allergen challenge can result in the abnormality of coupling between β2 receptor and adenylyl cyclase (AC) in isolated passively sensitized human bronchi. Methods: Bronchus rings of 2-4 mm in diameter were obtained from 12 patients undergoing lobectomy. Passive sensitization of human bronchi was induced with the serum containing high level of IgE to house dust mite. The control, sensitized and allergen-challenged rings were used to establish the cumulative concentration-response curves to β2 receptor simulant, salbutamol and forskolin that is an AC activator. Results: The relaxant response to salbutamol was reduced but the relaxant effect to forskolin remained unchanged in the challenged rings as compared with those in the control and passively sensitized rings. Conclusion: Dysfunction of β2 receptor due to allergen in passively sensitized human bronchus rings is related to abnormality of coupling between β2 receptor and AC.
, 百拇医药
Key words adrenergic beta-2 receptor; adenylyl cyclase; asthma
支气管哮喘发作后或体外抗原刺激后被动致敏的支气管呈现β受体功能低下[1，2]，β受体活化是通过细胞膜上刺激性G蛋白兴奋腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase,AC)使细胞内cAMP产生增加，从而舒张支气管平滑肌，抑制肥大细胞过敏介质释放等。因此，如果支气管平滑肌存在β受体-AC之间的信息传导失常，就会表现为β受体功能低下。本实验通过观察抗原致敏的人离体支气管对β2受体兴奋剂舒喘灵与腺苷酸环化酶兴奋剂Forskolin[3]的反应性来阐明哮喘发作后β2受体功能低下是否由于β2受体-AC偶联失常所致。
1 材料和方法
1.1 组织来源及准备
, 百拇医药
人支气管来源于12例接受肺叶切除手术的肺癌患者(45～65岁，男性9例，女性3例)。近期均未服用β受体兴奋剂、茶碱类或抗胆碱类药物。组织离体后置于预冷的PBS缓冲液中。在远离病变区分离出内径2～4 mm的支气管，清除周围的结缔组织、血管，制成宽4～5 mm的支气管环。
1.2 药物
舒喘灵、卡巴胆碱(Sigma,USA)，Forskolin(RBI,USA)，屋尘螨抗原(Milan,Italy)。
1.3 被动致敏
将支气管置入通有95%O2、5%CO2气体的稀释10倍的高效价抗屋尘螨-IgE血浆中(特异性IgE>20 u/ml)，并在室温过夜。正常对照支气管用正常人血浆代替。
1.4 抗原刺激
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将被动致敏的支气管置于5ml PBS缓冲液中，给予95%O2，5%CO2，加屋尘螨抗原5 mg，在37℃下刺激60 min。正常对照被动致敏的支气管则加5 mg牛血清白蛋白处理。
1.5 实验程序
用L型钢丝钩将支气管环悬挂于有95%O2，5%CO2混合气体，温度37℃的25 ml PBS缓冲液中，下端固定于组织浴杯底部，上端与张力传感器连接。Model FT03D(USA)多道生理仪连续记录张力变化。给予支气管环1.0 g的初始张力，在缓冲液中平衡2 h，每20 min更换缓冲液一次。
舒喘灵累加浓度反应曲线：6例患者的18个支气管环(对照、被动致敏、抗原刺激各6个)，10-6mol/L卡巴胆碱引起支气管收缩后以累加浓度方法加入舒喘灵10-9～10-4mol/L以建立舒喘灵舒张反应曲线。
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Forskolin累加浓度反应曲线：另6例患者的18个支气管环同样分3组，先用10-6mol/L卡巴胆碱收缩支气管后，以累加浓度方法加入Forskolin 10-9～10-5mol/L,以建立Forskolin舒张反应曲线。
建立累加浓度反应曲线后，用PBS缓冲液每5 min冲洗一次，连续1 h，然后加入25 mg屋尘螨抗原至有正常对照和被动致敏的组织浴杯中观察有无收缩反应出现。实验结束后，用纸吸干水分称重。
1.6 数据处理
用舒喘灵与Forskolin的累加浓度反应曲线计算IC50(药物产生最大舒张反应50%时的克分子浓度)。作配对资料t检验。
2 结果
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12个被动致敏的支气管环在加入屋尘螨抗原后产生明显的收缩反应，而正常对照的支气管环均无收缩反应出现。
由卡巴胆碱所致的支气管环收缩力各组间差异不显著(P>0.05)，见表1。舒喘灵产生的浓度依赖性的支气管舒张反应(P<0.001)，抗原刺激后的支气管环与正常对照、被动致敏的比较：舒喘灵累加反应曲线右移，IC50值增大，见表2与图1。
图1 舒喘灵累加浓度反应曲线
○-○：正常对照；■-■：被动致敏；+-+：抗原刺激；抗原刺激组支气管环与正常对照和被动致敏组比较：P<0.01
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Fig 1 The cumulative concentration-response curves to salbutamol of human bronchi rings
○-○：Control;■-■：The sensitized;+-+：The allergen challenged; The rings challenged by the allergen vs control, the sensitized: P<0.001
表1 1 μmol/L卡巴胆碱所致的支气管环收缩力(g/g组织)
Tab 1 Constriction of bronchi rings inducedby 1 μmol/L carbachol (g/g) Group
n
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Forskolin
Sallutamol
Control
12
17.6±3.6
15.6±2.6
Passively sensitized
12
17.9±3.5
17.6±4.0
Allergen challenged
12
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17.6±3.6
16.6±4.0*
*:P>0.05 vs the control,passive sensitized表2 舒喘灵与Forskolin的IC50值(-logM)
Tab 2 The IC50 of salbutamol and forskolin (-logM) Group
n
Forskolin
Sallutamol
Control
12
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6.73±0.35
6.74±0.34
Passively sensitized
12
6.86±0.34
6.76±0.35
Allergen challenged
12
6.79±0.39
6.17±0.39***
***:P<0.001 vs the control,passive sensitized
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2.4 Forskolin累加浓度反应曲线
卡巴胆碱引起的收缩力各组间差异不显著(P>0.05)，见表1，Forskolin引起剂量依赖性支气管环舒张反应(P<0.001)，但累加浓度反应曲线、IC50值三组间差异不明显，见表2。
3 讨论
本研究表明：抗原刺激被动致敏的离体人支气管引起支气管平滑肌对舒灵的反应性减弱；而对Forskolin的反应性保持不变。本研究中，所有被动致敏的支气管在抗原刺激后出现明显收缩反应，而作正常对照的支气管均无收缩反应出现，因此正常对照、被动致敏、抗原刺激三组支气管的区分是可信的。以前的实验证实1 μmol/L卡巴胆碱所致的收缩反应相当于最大反应的50%[2]。本实验中，由1 μmol/L卡巴胆碱所致的引起的支气管收缩力三组间差异不显著，所以，三组间舒喘灵反应性的差异并非由于卡巴胆碱引的收缩力各异所致。
, 百拇医药
舒喘灵是特异性的β2受体兴奋剂，抗原刺激被动致敏的支气管对舒喘灵反应减弱，提示为β2受体功能低下，而被动致敏的支气管对舒喘灵反应正常，表示β2受体功能无显著变化，Bai[1]和Villanove[4]的报道支持本实验结果。Forskolin是腺苷酸环化酶兴奋剂，抗原刺激被动致敏的支气管对Forskolin的反应性正常表明腺苷酸环化酶反应性正常；抗原刺激后出现的支气管β2受体功能低下可能是β2受体-AC信息传导障碍所致。
炎症细胞产生的过敏介质被认为是与β2受体功能异常有关，在离体的人支气管中，肥大细胞是主要的产生介质的炎症细胞[5]，但是与β2受体功能低下的关系有待进一步证实。
作者简介：宋平方，男，35岁，主治医师，讲师，博士研究生，现在意大利热那亚大学
, http://www.100md.com
参考文献
1 Bai T R. Abnormalities in airway smooth muscle in fatal asthma. Am Rev Respir Dis,1990,141(3):552
2 Song P, Milanese M, Crimi E,et al. Allergen chanllenge of passively sensitized huamn bronchi alters M2 and β2 receptor function. Am J Res Crit Care Med,1997,155(4):1230
3 Seaman K B, Daly J W. Forskolin:its biological and chemical properties. Adv Cyclic Nucleotide Protein Phossphorylation Res,1986,20:1～150
, 百拇医药
4 Villanove X, Marthan R, Tunon J M, et al. Sensitization decreases relaxation in human isolated airway. Am Rev Respir Dis,1993,148(1):107
5 Milanese M, Song P, Crimi E, et al. Cellular involvement in allergen-induced contraction of passively sensitized human bronchi. Eur Respir J,1995,8:s263
(收稿：1998-05-25；修回：1998-10-27), 百拇医药