人胰腺癌细胞株的血管活性肠肽受体研究
作者：张正 陈杰、刘彤华、郭秀英 陈元方、陆国钧、候雪、潘国宗
单位：张正(华西医科大学第一附属医院进修医师)；陈杰、刘彤华、郭秀英(北京协和医院病理科)；陈元方、陆国钧、候雪、潘国宗(北京协和医院内科 100730)
关键词：血管活性肠肽；胰腺肿瘤；细胞株；受体
中华医学杂志900306
提要 用放射受体分析法证实本院培养的一株人胰腺癌细胞有血管活性肠肽(VIP)受体，并对受体的结合特性进行了研究。将VIP与胰腺癌细胞共同培育后可使癌细胞cAMP含量明显增加，说明该株癌细胞的VIP受体具有生物活性。
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是由28个氨基酸组成、具有广泛生物活性的脑肠肽。现已发现许多正常和肿瘤组织均有VIP受体，如脑、肺、胃肠、胰、肝、胆囊、平滑肌、血管壁、淋巴母细胞、结肠癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、泌乳素瘤等[1]。
, http://www.100md.com
本组用放射受体分析和cAMP测定等方法对人胰腺癌细胞株受体的结合特性和生物活性进行了研究，现报告如下。
材料和方法
一、材料
VIP，Peninsula；牛血清白蛋白、胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、杆菌肽、乳过氧化酶、二羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、细胞培养基PRMI 1640，Sigma；葡聚糖Sephadex G 15、G 50、CM Sephadex C 25, Pharmacia；125I，Armasham；环磷腺苷(cAMP)试剂盒，北京中国原子能研究所；小牛血清，北京生物制品研究所。
人胰腺癌细胞株：肿瘤标本来自手术切除的中度分化的人胰腺导管细胞癌，由北京协和医院病理科培养建株。
125I-VIP的制备：用乳过氧化酶法进行氧化碘化，作用时间30秒，标记物先后用Sephadex G 15/G 50及CM Sephadex C25层析纯化[2]。
, 百拇医药
细胞制备：本实验使用传代后培养48～72小时、并在无血清培养液中培育了10分钟的癌细胞。实验所用的HEPES缓冲液含HEPES 30mmol/L，NaCl/L 120mmol/L，KCl5mmol/L，MgCl2 1.2mmol/L，葡萄糖10mmol/L，大豆胰蛋白酶抑制剂0.2mg/ml，杆菌肽0.5mg/ml，BSA 1%，pH7.4。
二、受体结合试验[1，3，4]
1. 时间曲线：将上述细胞(106/ml)在37°C下与125I-IVP(100000 cpm/ml)共同培育。非特异性结合管内加10-6mol/L非标记VIP。于培育后10，20，30，40，60和90分钟各取细胞悬液100μl×3份加至盛有4°C预冷的、含4%BSA的HEPES缓冲液400μl的各管中。立即离心(30秒，约8000g)，吸去上清，以4°C含1%BSA的HEPES缓冲液重复洗涤两次，将沉淀物用γ计数仪计数。计算每个时间点的总结合率和非特异结合率。
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2. 解离曲线：作法同时间曲线，在培育20分钟后加入非标记VIP(10-6mol/L)，然后于30，40，50，60，75和90分钟时各取细胞悬液100μl×3份，按上法离心，洗涤，计数，并与不加非标记VIP的对照管相比较。
3. 抑制曲线：在每个培育管中加入细胞悬液400μl(含细胞4×105)，然后加入非标记VIP，使最终浓度分别为10-11～10-6mol/L。在37°C培育20分钟后自每个管按上法取100μl×3份，离心，洗涤，计数。在此基础上，绘制Scatchard图并计算KD和结合位点数。
4. 交叉反应：作法同抑制曲线，但于一组试管中加10-11～10-6mol/L的非标记VIP，于另两组试管中分别加入与VIP同族的促胰液素或胰高糖素(浓度为10-11～10-6mol/L)，在37°C与癌细胞和125I-VIP共同培育20分钟后，按上法离心、洗涤、计数。比较几种激素对125I-VIP与受体结合的抑制效应。
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受体生物活性研究：于细胞悬液1.44ml中(含细胞1.2×107)加入2ml异丁基甲基黄嘌呤0.18ml(IBMX，为cAMP磷酸酯酶抑制剂)，在37°C水浴中培育10分钟。将此悬液分为两等份，分别加入90μl10-5(mol/L)VIP或HEPES缓冲液，在37°C下继续培育。于培育后1，2，3，5，10分钟自VIP(+)管和VIP(-)管中分别取出0.15ml悬液(含细胞106)，加入7.06%三氯醋酸0.85ml，离心，用水饱和乙醚将上清液洗涤四次后移入玻璃瓶内，在75°C水浴中蒸干，冰箱贮存备用。 cAMP测定用氚标记竞争性蛋白结合法，按原子能研究所药盒说明书进行。
结 果
用本法制备的125I-VIP放射活性为400～600μCin/mol，适用于受体研究。
1. 125I-VIP与胰腺癌细胞受体结合的时间曲线如图1所示。可以看出，在37°C时，125I-VIP和胰腺癌细胞受体的结合在20～30分钟时可达到最最高峰。在此时加入1μmol/L VIP则可引起受体结合的解离，于60分钟时解离率达35%。
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时间(min)
图1 VIP受体结合时间曲线
2. 125I-VIP与受体结合的抑制曲线(置换曲线)(图2)。当非标记VIP浓度由10-11mol/L增至10-6mol/L时，125I-VIP与受体的结合呈进行性下降，在10-6mol/L时结合率仅为无冷抗原时的5%。在多次受体结合实验中，非特异结合为5～25%。
VIP浓度(-log mol)
图2 VIP受体结合抑制曲线
3. Scatchard分析表明，VIP受体的解离常数KD为1.68×10-10mol/L，结合位点数为3.6×105/细胞。
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4. 受体交叉反应实验表明，与VIP同族的胰高糖素在1μmol/L浓度时不能抑制125I-VIP和受体的结合，即两者之间无交叉反应。另一方面，1μmol/L促胰液素则能使125I-VIP和细胞 的结合被抑制35%，说明两者之间有部分交叉反应。
5. VIP能使本株胰腺癌细胞cAMP产量增加，于5分钟时达最高峰。这一反应具有剂量依赖性，当VIP浓度为0、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L时，cAMP产量分别为11，69，91，356和465pmol/106细胞/5分钟。这说明本细胞株的VIP受体具有生物活性，能与VIP结合而诱导细胞内生化反应。
讨 论
胰腺癌的发病率近年来有上升趋势，在国外已成为恶性肿瘤死亡的第四位原因。目前已发现某些胃肠激素如胃泌素、胆囊收缩素等能影响肿瘤细胞的生长，因此，从细胞受体入手研究癌细胞和正常细胞之间以及不同肿瘤和细胞株之间的差异，进而探讨细胞受体和肿瘤生物学特性之间的关系，是一个重要的课题。
, 百拇医药
离体实验表明，正常胰腺腺泡存在着高亲和力与低亲和力两类VIP受体，其KD一般在10-9mol/L左右，细胞VIP受体浓度为104～105/细胞[5]。本株癌细胞与VIP的结合是时间和温度依赖性的，并具有竞争性和可逆性，符合受体配体结合的特点。本文VIP受体的KD为1.68×10-10mol/L，结合位点数为3.6×105/细胞，与文献报道接近。Scatchard分析和交叉反应还表明，本株癌细胞的VIP受体主要是高亲和力受体，与促胰液素有部分交叉反应，与胰高糖素无反应，这也和文献报道一致[5]。此外，从VIP能诱导癌细胞产生cAMP来看，本株癌细胞的VIP受体是有生物活性的。
肿瘤细胞由于组织来源和分化程度不同，其表面受体的种类和数量也各异。因此，我们不仅要研究不同类型肿瘤的受体特点，而且要研究同一类肿瘤中不同细胞株受的差异。这对探索和预测肿瘤患者各自不同的病程特点和治疗反应可能会有所帮助。
, 百拇医药
我们的工作为进一步研究肿瘤受体提供了以下的初步经验：
1. 标记物的质量是受体分析成功的关键之一。受体分析用的标记物必须保持激素原有的生物活性，为此必须注意掌握125I标记的反应时间，以免作用过度而损害生物活性。
2. 在细胞说壁过程中，要尽量避免或减少酶消化对受体的损伤。
3. 在细胞培养过程中，癌细胞表面受体可能已部分地被小牛血清中的激素所占据，因此，每次受体实验前用不含血清的培养液和癌细胞共同培育，使已经结合在细胞表面的激素解离，对实验的成功很有帮助。
4. 温度、pH、离子强度等对受体结合均有较大影响。温度过高可促进激素进入细胞的过程(internalization)。
总之，肿瘤细胞的受体研究是一个很有前景、很有意义的领域。
, 百拇医药
参考文献
1. Boissard C, et al. Vasoactive intestinal peptide receptor regulation and reversible desensitization in human colonic carcinoma cells in culture. Can-cer Res 1986；46：4406.
2. 陈元方，等.血管活性肠肽的放射免疫分析.中华核医学杂志 1986；6：18.
3. Estival A, et al Presence of VIP receptors in a human pancreatic adenocarcinoma cell line Modulation of the cAMP response during cell proliferation.Biochem Biophys Res Commun 1983；111：958.
, 百拇医药
4. Chastre E, et al. Vasoactive intestinal pepptide receptor activity and specificity during enterocyte-like differentiation and retrodifferentiation of the human colonic cancerous subclone HT 29-18. FEBS 1985；188：197.
5. Prieto JC, et al. Quantitative studies of vasoactive intestinal peptide(VIP)binding sites and VIP-induced adenosine 3':5'-monophosphate production in epithelial cells from duodenum, jejunum, ileum, coecum, colon, and rectum in the rat, Acta Endocrinol 1981；96：229.
(1989年3月20日收稿 同年10月10日修回), http://www.100md.com
单位：张正(华西医科大学第一附属医院进修医师)；陈杰、刘彤华、郭秀英(北京协和医院病理科)；陈元方、陆国钧、候雪、潘国宗(北京协和医院内科 100730)
关键词：血管活性肠肽；胰腺肿瘤；细胞株；受体
中华医学杂志900306
提要 用放射受体分析法证实本院培养的一株人胰腺癌细胞有血管活性肠肽(VIP)受体，并对受体的结合特性进行了研究。将VIP与胰腺癌细胞共同培育后可使癌细胞cAMP含量明显增加，说明该株癌细胞的VIP受体具有生物活性。
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是由28个氨基酸组成、具有广泛生物活性的脑肠肽。现已发现许多正常和肿瘤组织均有VIP受体，如脑、肺、胃肠、胰、肝、胆囊、平滑肌、血管壁、淋巴母细胞、结肠癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、泌乳素瘤等[1]。
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本组用放射受体分析和cAMP测定等方法对人胰腺癌细胞株受体的结合特性和生物活性进行了研究，现报告如下。
材料和方法
一、材料
VIP，Peninsula；牛血清白蛋白、胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂、杆菌肽、乳过氧化酶、二羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、细胞培养基PRMI 1640，Sigma；葡聚糖Sephadex G 15、G 50、CM Sephadex C 25, Pharmacia；125I，Armasham；环磷腺苷(cAMP)试剂盒，北京中国原子能研究所；小牛血清，北京生物制品研究所。
人胰腺癌细胞株：肿瘤标本来自手术切除的中度分化的人胰腺导管细胞癌，由北京协和医院病理科培养建株。
125I-VIP的制备：用乳过氧化酶法进行氧化碘化，作用时间30秒，标记物先后用Sephadex G 15/G 50及CM Sephadex C25层析纯化[2]。
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细胞制备：本实验使用传代后培养48～72小时、并在无血清培养液中培育了10分钟的癌细胞。实验所用的HEPES缓冲液含HEPES 30mmol/L，NaCl/L 120mmol/L，KCl5mmol/L，MgCl2 1.2mmol/L，葡萄糖10mmol/L，大豆胰蛋白酶抑制剂0.2mg/ml，杆菌肽0.5mg/ml，BSA 1%，pH7.4。
二、受体结合试验[1，3，4]
1. 时间曲线：将上述细胞(106/ml)在37°C下与125I-IVP(100000 cpm/ml)共同培育。非特异性结合管内加10-6mol/L非标记VIP。于培育后10，20，30，40，60和90分钟各取细胞悬液100μl×3份加至盛有4°C预冷的、含4%BSA的HEPES缓冲液400μl的各管中。立即离心(30秒，约8000g)，吸去上清，以4°C含1%BSA的HEPES缓冲液重复洗涤两次，将沉淀物用γ计数仪计数。计算每个时间点的总结合率和非特异结合率。
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2. 解离曲线：作法同时间曲线，在培育20分钟后加入非标记VIP(10-6mol/L)，然后于30，40，50，60，75和90分钟时各取细胞悬液100μl×3份，按上法离心，洗涤，计数，并与不加非标记VIP的对照管相比较。
3. 抑制曲线：在每个培育管中加入细胞悬液400μl(含细胞4×105)，然后加入非标记VIP，使最终浓度分别为10-11～10-6mol/L。在37°C培育20分钟后自每个管按上法取100μl×3份，离心，洗涤，计数。在此基础上，绘制Scatchard图并计算KD和结合位点数。
4. 交叉反应：作法同抑制曲线，但于一组试管中加10-11～10-6mol/L的非标记VIP，于另两组试管中分别加入与VIP同族的促胰液素或胰高糖素(浓度为10-11～10-6mol/L)，在37°C与癌细胞和125I-VIP共同培育20分钟后，按上法离心、洗涤、计数。比较几种激素对125I-VIP与受体结合的抑制效应。
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受体生物活性研究：于细胞悬液1.44ml中(含细胞1.2×107)加入2ml异丁基甲基黄嘌呤0.18ml(IBMX，为cAMP磷酸酯酶抑制剂)，在37°C水浴中培育10分钟。将此悬液分为两等份，分别加入90μl10-5(mol/L)VIP或HEPES缓冲液，在37°C下继续培育。于培育后1，2，3，5，10分钟自VIP(+)管和VIP(-)管中分别取出0.15ml悬液(含细胞106)，加入7.06%三氯醋酸0.85ml，离心，用水饱和乙醚将上清液洗涤四次后移入玻璃瓶内，在75°C水浴中蒸干，冰箱贮存备用。 cAMP测定用氚标记竞争性蛋白结合法，按原子能研究所药盒说明书进行。
结 果
用本法制备的125I-VIP放射活性为400～600μCin/mol，适用于受体研究。
1. 125I-VIP与胰腺癌细胞受体结合的时间曲线如图1所示。可以看出，在37°C时，125I-VIP和胰腺癌细胞受体的结合在20～30分钟时可达到最最高峰。在此时加入1μmol/L VIP则可引起受体结合的解离，于60分钟时解离率达35%。
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时间(min)
图1 VIP受体结合时间曲线
2. 125I-VIP与受体结合的抑制曲线(置换曲线)(图2)。当非标记VIP浓度由10-11mol/L增至10-6mol/L时，125I-VIP与受体的结合呈进行性下降，在10-6mol/L时结合率仅为无冷抗原时的5%。在多次受体结合实验中，非特异结合为5～25%。
VIP浓度(-log mol)
图2 VIP受体结合抑制曲线
3. Scatchard分析表明，VIP受体的解离常数KD为1.68×10-10mol/L，结合位点数为3.6×105/细胞。
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4. 受体交叉反应实验表明，与VIP同族的胰高糖素在1μmol/L浓度时不能抑制125I-VIP和受体的结合，即两者之间无交叉反应。另一方面，1μmol/L促胰液素则能使125I-VIP和细胞 的结合被抑制35%，说明两者之间有部分交叉反应。
5. VIP能使本株胰腺癌细胞cAMP产量增加，于5分钟时达最高峰。这一反应具有剂量依赖性，当VIP浓度为0、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L时，cAMP产量分别为11，69，91，356和465pmol/106细胞/5分钟。这说明本细胞株的VIP受体具有生物活性，能与VIP结合而诱导细胞内生化反应。
讨 论
胰腺癌的发病率近年来有上升趋势，在国外已成为恶性肿瘤死亡的第四位原因。目前已发现某些胃肠激素如胃泌素、胆囊收缩素等能影响肿瘤细胞的生长，因此，从细胞受体入手研究癌细胞和正常细胞之间以及不同肿瘤和细胞株之间的差异，进而探讨细胞受体和肿瘤生物学特性之间的关系，是一个重要的课题。
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离体实验表明，正常胰腺腺泡存在着高亲和力与低亲和力两类VIP受体，其KD一般在10-9mol/L左右，细胞VIP受体浓度为104～105/细胞[5]。本株癌细胞与VIP的结合是时间和温度依赖性的，并具有竞争性和可逆性，符合受体配体结合的特点。本文VIP受体的KD为1.68×10-10mol/L，结合位点数为3.6×105/细胞，与文献报道接近。Scatchard分析和交叉反应还表明，本株癌细胞的VIP受体主要是高亲和力受体，与促胰液素有部分交叉反应，与胰高糖素无反应，这也和文献报道一致[5]。此外，从VIP能诱导癌细胞产生cAMP来看，本株癌细胞的VIP受体是有生物活性的。
肿瘤细胞由于组织来源和分化程度不同，其表面受体的种类和数量也各异。因此，我们不仅要研究不同类型肿瘤的受体特点，而且要研究同一类肿瘤中不同细胞株受的差异。这对探索和预测肿瘤患者各自不同的病程特点和治疗反应可能会有所帮助。
, 百拇医药
我们的工作为进一步研究肿瘤受体提供了以下的初步经验：
1. 标记物的质量是受体分析成功的关键之一。受体分析用的标记物必须保持激素原有的生物活性，为此必须注意掌握125I标记的反应时间，以免作用过度而损害生物活性。
2. 在细胞说壁过程中，要尽量避免或减少酶消化对受体的损伤。
3. 在细胞培养过程中，癌细胞表面受体可能已部分地被小牛血清中的激素所占据，因此，每次受体实验前用不含血清的培养液和癌细胞共同培育，使已经结合在细胞表面的激素解离，对实验的成功很有帮助。
4. 温度、pH、离子强度等对受体结合均有较大影响。温度过高可促进激素进入细胞的过程(internalization)。
总之，肿瘤细胞的受体研究是一个很有前景、很有意义的领域。
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参考文献
1. Boissard C, et al. Vasoactive intestinal peptide receptor regulation and reversible desensitization in human colonic carcinoma cells in culture. Can-cer Res 1986；46：4406.
2. 陈元方，等.血管活性肠肽的放射免疫分析.中华核医学杂志 1986；6：18.
3. Estival A, et al Presence of VIP receptors in a human pancreatic adenocarcinoma cell line Modulation of the cAMP response during cell proliferation.Biochem Biophys Res Commun 1983；111：958.
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4. Chastre E, et al. Vasoactive intestinal pepptide receptor activity and specificity during enterocyte-like differentiation and retrodifferentiation of the human colonic cancerous subclone HT 29-18. FEBS 1985；188：197.
5. Prieto JC, et al. Quantitative studies of vasoactive intestinal peptide(VIP)binding sites and VIP-induced adenosine 3':5'-monophosphate production in epithelial cells from duodenum, jejunum, ileum, coecum, colon, and rectum in the rat, Acta Endocrinol 1981；96：229.
(1989年3月20日收稿 同年10月10日修回), http://www.100md.com