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编号:10273113
肝性脑病大白鼠脑内血管活性肠肽受体的研究
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 1994年第4期
     作者:张宗明 裘法祖 陈孝平

    单位:430030 武汉,同济医科大学附属同济医院外科

    关键词:肝性脑病;脑;受体,血管活性肠肽;疾病模型,动物

    中华医学杂志940414.htm

    摘要 应用放射受体分析法对肝性脑病(HE)及对照大白鼠脑粗制突触体膜(P2膜)的血管活性肠肽(VIP)受体结合特性进行了测定。结果:HE鼠最大结合容量(Bmax)为9.56±0.29 fmol/mg蛋白质,平衡解离常数(kd)为0.28±0.01nmol/L;较对照鼠Bmax值明显减少(P<0.002),而kd值差异无显著意义(P>0.20)。表明HE较对照鼠脑P2膜的VIP受体结合位点数量减少,但亲和力不变;提示其在HE发生中具有一定作用。

    肝性脑病(Hepatic Encephalopathy, HE)的发生机理迄今尚未阐明。脑肠肽作为中枢性神经递质或调质近年来受到重视[1],但在HE发生中的作用尚不清楚。本研究旨测定HE鼠脑粗制突触体膜的血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide, VIP)受体的结合特性,以期探讨其在HE发生中的作用。
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    材料与方法

    1.主要材料:125I-VIP(比放射活性66563GBq/mmol北京协和医院消化内科实验室提供),VIP(Peninsula Lab),大豆胰蛋白酶抑制剂(Type l-s, Sigma),牛血清白蛋白(BSA,上海长阳生化制药厂),二羟乙基哌嗪乙烷磺酸(HEPES, sigma),FSH-2型高速电动匀浆器,日立高速冷冻离心机及HYA恒温摇床。

    2.动物模型制作:取雄性Sprague-Dauley大白鼠12只,按照文献[2]进行。

    3.脑粗制突触体膜制备:全部鼠均在术后12小时断头处死,迅速取出脑组织,4℃预冷的匀浆用缓冲液(含:Tris 10mmol/L,MgCl21.2mmol/L,EGTA 1mmol/L,大豆胰蛋白酶抑制剂1mg/ml,pH7.4)中洗去血迹,按1:10(W/V)加入同样的缓冲液,电动匀浆20秒(100000r/min,冰浴中进行),间隔1分钟,重复3次。匀浆以1000g离心(2℃,下同)10分钟。洗涤沉淀1次,合并两次上清液,以30000g离心30分钟,弃上清液,重复洗膜2次,收集沉淀加入HEPES缓冲液(含:HEPES 30mmol/L,NaCl 120mmol/L,KCl 5mmol/L,MgCl2 1.2mmol/L,大豆胰蛋白酶抑制剂1mg/ml,1%BSA,pH7.4)摇匀,即为脑粗制突触体膜(P2膜)。采用Lowry法测蛋白质含量,以牛血清白蛋白为标准,用HEPES缓冲液稀释为2mg/ml。
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    4.放射配基结合实验:实验所用试管均以1%明胶涂层,60℃烘干。各管取350μlP2膜,加入非标记VIP50μl,使终浓度分别为10-11、10-10、3×10-10、6×10-10、10-9、3×10-9、10-8mol/L,总结合管中仅加HEPES缓冲液50μl,然后加入0.08nmol/L125I-VIP100μl,使各管终体积为500μl,置恒温摇床(37℃,100r/min)孵育20分钟。各管取出100μl×3加至盛有4℃预冷的含4%BSA的HEPES缓冲液400μl的各管中,800g离心3分钟,吸弃上清液,用含1%BSA的HEPES缓冲液重复洗涤沉淀2次,将沉淀物用r-计数仪计数。
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    5.结果分析:鼠脑P2膜与125I-VIP结合的平衡解离常数(kd)和最大结合容量(Bmax)由Scatchard作图法经直线回归方程求得。HE与对照鼠kd及Bmax值经IBN PC/AT 286、微机用两样本均数t检验法比较。

    结 果

    当非标记VIP浓度由10-11mol/L增至10-8mol/L时,125I-VIP与大鼠脑P2膜受体的结合呈进行性下降,在10-8mol/L时,HE鼠结合率为无冷抗原时的3.4%,对照鼠为2.8%。见图1。在多次受体结合实验中,非特异性结合均小于20%。125I-VIP与大鼠脑P2膜受体结合的Scatchard分析如图2。
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    VIP浓度(log mol/L)

    图1 VIP受体结合的抑制曲线

    结合的125I-VIP(foml/ml)

    图2 125I-VIP与大鼠脑P2膜受体结合的Scatchard分析

    结果表明:HE鼠脑P2膜VIP受体的kd值为0.28±0.01nmol/L,Bmax值为9.56±0.29fmol/mg蛋白质。对照鼠kd值为0.29±0.02nmol/L,Bmax值为10.92±0.44fmol/L蛋白质。经统计学处理,两组Bmax值差异有非常显著意义(P<0.002),两组kd值无显著差异(P>0.20)。
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    讨 论

    VIP是一个直链28肽,1972年首先由Said和Mutt从猪小肠分离出来。Phillis[3]报道VIP有中枢神经元兴奋作用。体内注射VIP可使已麻醉动物唤醒。离子透入VIP能刺激大脑皮层神经元,VIP并能使皮质内腺苷酸环化酶活性加强,以及与脑内膜性结构作特异结合。目前认为,VIP是脑内含量较多的一种脑肠肽,它在调节下丘脑--垂体功能及末稍神经系统的神经传递上起重要的调节作用[4]

    肝脏是VIP的主要灭活器官。Ebeid等[5]报道肝功能衰竭狗、猴的脑脊液内VIP含量增加。脑脊液内增加的VIP如何影响脑功能呢?本结果提示,肝性脑病鼠脑P2膜的VIP受体结合位点数量减少、亲和力不变。分析肝性脑病鼠脑P2膜VIP受体改变的原因可以认为:肝功能衰竭时,通过脑肠轴等调节,引起中枢神经系统VIP合成增加和/或降解减少,导致脑脊液内VIP含量增加,而机体为了减少中枢神经系统升高的VIP的有害作用,通过脑内VIP受体的“下行调节”而实现机体的保护作用,从而使机体不出现VIP升高的中枢神经系统兴奋表现。受体“下行调节”的机理可能与膜受体内移,导致膜受体结合位点数量减少有关。
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    脑P2膜VIP受体改变也可能伴有其它神经信息物质受体改变,致使机体调节中枢神经元兴奋性和抑制性受体的能力失控,引起抑制性受体占优势,通过与其相应的神经信息物质作用,发展为肝性脑病。本研究表明脑P2膜VIP受体改变在HE发生中具有一定作用,有待进一步深入研究。

    承北京协和医院消化内科实验室陆国钧教师及同济医科大学神经生物学教研室关新民教师帮助,特此致谢。

    参 考 文 献

    1.杜宝恒.脑肠肽.见:张殿明,徐隆绍主编.神经内分泌学.北京:中国医药科技出版社,1991, 314-329.

    2.Zhang ZM, Chen XP, Qiu FZ. Experimertal studies on centraltype benzodiazepine receptors in the brains of hepatic encephalopathy rats. Chin Med J, 1993, 106 : 723.
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    3.Phillis JW, Kirkpatrick JR, Said SI. Vasoactive intestinal polypoptide excitation of central neurons. Can J Physiol Pharmacol, 1978, 56 : 337.

    4.Rosselin G, Maletti M, Besson J, et al. A new neuroregulator: the vasoactive intestinal peptide or VIP. Mol Cell Endocrinol, 1982, 27 : 243.

    5.Ebeid AM, Smith A, Escourrou J, et al. Increased immunoreactive vasoactive intestinal peptide in the cerebro-spinal fluid (CSF) of dogs and monkeys in hepatic failure. J of Surg Res, 1978, 25 : 538.

    (收稿:1993-09-25 修回:1993-11-20), 百拇医药