内耳免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖
作者：黄孝文 肖红俊 汪吉宝 黄翔
单位：黄孝文 汪吉宝 黄翔(华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉科 武汉 430030)；肖红俊(华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：内淋巴囊；细胞分化；溴脱氧尿嘧啶核苷
中华耳鼻咽喉科杂志000611 【摘要】 目的 研究和评价内耳二次免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖情况。方法 选用SD大鼠15只，以钥孔虫 戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)全身免疫后，经耳蜗底回钻孔以相同抗原进行内耳免疫，然后分别在内耳免疫后3、7和14 d腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdUrd)后处死动物，取颞骨经组织学处理制作冰冻切片，用免疫组织化学技术观察内淋巴囊的细胞浸润、增殖和IgG细胞的分布状况。结果 内耳受抗原刺激后3 d内淋巴囊囊腔和囊周区域出现单核吞噬细胞浸润，7 d内淋巴囊的浆细胞和淋巴细胞大量增加；3～7 d内淋巴囊囊腔KLH被吞噬，同时S期细胞和IgG阳性细胞逐渐增多，二者的出现部位相似。结论 在内耳针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，内淋巴囊的细胞增殖活性增强，且局部增殖的细胞可能在原位分化为免疫活性细胞，提示内淋巴囊具有增殖免疫活性细胞的功能，在内耳免疫应答过程中发挥重要作用。
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Cell proliferation in endolymphatic sac during the immune response of inner ear
HUANG Xiaowen, XIAO Hongjun, WANG Jibao, et al.
(Department of Otorhinolaryngology, Tongji Hospital ,Tongji Medical College,Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030，China)
【Abstract】 Objective To study the cell proliferation in endolymphatic sac(ES) during the secondary immune response in inner ear. Methods Fifteen healthy, female SD rats were employed in the experiment. Sensitized systematically with keyhole limpet hemocyanin (KLH), the animals were inoculated with the same antigen through cochlea basal turn into the labyrinth. Adminstrated 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdUrd) intraperitoneally, the rats were sacrificed and the temporal bones were harvested at 3, 7,14 day after labyrinth vaccination respectively. The frozen sections of the decalcified samples were dealt with H-E staining and immunohistohemical methods to investigate the cellular infiltration, BrdUrd and IgG positive cells in the ES. Results While the ES lumen and perisaccular region were infiltrated with mononeuclear-phagocyte at the 3rd day post-vaccination, plasmocyte and lymphatic cells become the predominant infiltrating cells in the ES at the 7th day. The KLH in the ES lumen were phagocytized at the 3-7th day post-vaccination. S-phase cells and IgG positive cells in ES increased markedly in the 3rd day and 7-14 days post-vaccination respectively with similar localization. Conclusion The activety of cell proliferation in the ES enhance and local proliferated cells may differentiate in situ into immunocomptent cells during the secondary immune response against TD antigen in the inner ear. This indicates that ES plays an important role in immume reponse of inner ear.
, 百拇医药
【Key words】 Endolymphatic sac； Cell differentiation； Bromodeoxyuridine
研究表明，内耳受到抗原激发时，内淋巴囊局部可聚集包括免疫活性细胞在内的大量炎症细胞参与免疫反应，说明内淋巴囊在内耳免疫中具有重要作用。本研究采用细胞增殖标记技术和免疫组织化学技术，观察内耳免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖状况，报道如下。
材料与方法
选健康成年雌性SD大鼠20只(购于同济医科大学实验中心动物学部)，体重180～200 g，分为健康对照组(n=5)和实验组(n=15)。实验组动物在全身免疫和内耳免疫术后，随机均分为3个时间组，分别在内耳术后3、7和14 d进行组织学处理和观察。
1.全身免疫：实验组动物用钥孔虫 戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH，Sigma公司，美国)0.5 mg加入Freund完全佐剂，在前、后腿内侧行多点皮下注射。1周后再以等量抗原加入Freund不完全佐剂在相同部位作加强免疫注射。2周后行内耳免疫。
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2.内耳免疫：以右耳为免疫耳，左耳为对照耳。动物用水合氯醛(300 mg/ kg体重)腹腔注射全身麻醉后，在无菌条件下，经耳后下切口打开听泡，在手术显微镜下直视耳蜗，用微型手捻钻在耳蜗底回钻微孔，见清亮外淋巴溢出时，将微量毛细进样管插入，右耳缓慢注入KLH 5 μL [100 μg以磷酸盐缓冲液(phoshate-buffered saline，PBS)稀释]，左耳注射Hank溶液5 μL。立即用骨蜡封闭耳蜗微孔，缝合术创。
3.细胞增殖标记物的活体引入和组织学准备：全部动物腹腔注射5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdUrd，Sigma，美国)溶液(50 mg/kg体重)。1 h后同上法全身麻醉动物，打开听泡，在蜗尖刺小孔后，经圆窗和卵圆窗缓慢灌注4%多聚甲醛PBS，作活体迷路内固定，随后断头处死动物，立即连同枕骨取出双侧颞骨，置相同固定液中固定24 h，再将标本置10%乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA-Na2)溶液中2～3周充分脱钙(固定和脱钙之初各真空抽气10 min)，然后以OCT包埋，用恒冷箱冰冻切片机垂直于颞骨内面并平行于蜗轴作冰冻切片，片厚10 μm，取耳蜗和内淋巴囊切片干燥冻存备用。
, 百拇医药
4.免疫组织化学染色和HE染色：采用SABC(strept avidin-biotin complex)法行IgG和KLH免疫组化染色，主要步骤为：先将切片置0.3%双氧水甲醛溶液15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，再以10%健康羊血清封闭30 min，随后以小鼠抗大鼠IgG(Sigma，美国)或小鼠抗KLH单克隆抗体(Sigma，美国；均为1∶1 000)孵育1～2 h，然后用生物素化羊抗鼠IgG和SABC (博士德公司，武汉)各孵育30 min，最后以3,3′二氨基联苯胺(diamino-benzidine，DAB)溶液显色3～5 min，蒸馏水终止反应，部分切片用苏木精复染1 min，脱水后以中性树胶封片。光镜观察，IgG染色以细胞膜呈棕褐色者为阳性，KLH染色以组织或细胞呈棕褐色为阳性。
BrdUrd免疫组织化学染色过程与上述方法稍有不同，主要为：封闭内源性过氧化物酶活性后，将切片置4 mol/L盐酸25 min，使DNA双链结构变性，暴露出BrdUrd；用冷硼酸缓冲液中和盐酸后，再加0.01%蛋白酶作用5 min，以破坏细胞膜和核膜，提高抗体的通透性；一抗用小鼠抗BrdUrd单克隆抗体(Sigma，美国，1∶1 000)，此后步骤同IgG染色。观察时以细胞核呈棕褐色者为阳性细胞。
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以PBS代替一抗同法处理，作为免疫组织化学染色的空白对照。
另作常规HE染色观察耳蜗和内淋巴囊的细胞浸润情况。
结果
1.HE染色：实验动物免疫耳受抗原刺激后3 d(5耳)内淋巴囊囊腔、上皮下和囊周区域出现不同程度的单核吞噬细胞浸润，7、14 d(各5耳)内淋巴囊的浸润细胞均大量增加，此时淋巴细胞和浆细胞为主要细胞类型(图1)；耳蜗鼓阶和前庭阶亦出现类似的细胞浸润过程；Hank溶液对照耳无细胞浸润。
2.KLH染色：实验动物内耳术后3 d和7 d，全部免疫耳均显示内淋巴囊囊腔和囊周区域的KLH被吞噬细胞吞噬(图2)，此后抗原逐渐被清除而消失；Hank溶液对照耳无上述改变。
3.BrdUrd和IgG染色：对照组动物内淋巴囊上皮、上皮下及囊周可见散在的BrdUrd阳性细胞和少量IgG阳性细胞(图3，4)。 实验动物免疫耳在内耳抗原接种后3 d(5耳)内淋巴囊囊腔、上皮层和囊周的BrdUrd阳性细胞明显增多(图5)；7 d(5耳)和14 d(5耳)内淋巴囊的IgG阳性细胞增多，且多聚集于上皮层和囊周组织(图6)，其出现部位与BrdUrd阳性细胞大致相似。Hank液对照耳未见上述改变。
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免疫组化空白对照片未显示任何棕褐色染色。
讨论
研究表明，正常状态下内淋巴囊存在少量免疫活性细胞，包括各类T淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞等，即所谓局部居住(local resident)的免疫细胞[1]。内耳发生炎症或免疫应答时内淋巴囊可聚集大量淋巴细胞参与反应[2]。这些细胞可能来自全身血液循环，也可能源于局部居住淋巴细胞的大量增殖分化。全身抗原免疫后，IgG阳性细胞的前体在脾、淋巴结等免疫器官中被致敏，一旦内耳再次受到相同抗原的激发，这些前体细胞就可能通过由粘附分子介导的淋巴细胞“归巢”机制，从免疫器官进入内淋巴囊[3]，然后在抗原提呈细胞和IL-2等细胞因子的作用下，进一步增殖分化为成熟细胞[4]；同样，局部居住的淋巴细胞也可能在这一过程中原位增殖和分化而大量增加，从而产生大量的抗原特异性淋巴细胞，使内耳免疫反应得以维持和发展[5]。
, 百拇医药
细胞增殖周期分为G1、S、G2和M期4个阶段，其中S期(即DNA合成期)为重要标志。溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)为胸腺嘧啶的同功异构体(analogue)，引入体内后可被S期细胞特异性地摄入其细胞核，通过免疫组织化学技术可以显示这类细胞在组织中的存在，因而可了解组织的细胞增殖活性[6]。本实验中内耳受抗原激发后，内淋巴囊的BrdUrd阳性(即S期细胞)细胞增多，3 d达高峰，提示内耳发生免疫应答时内淋巴囊的细胞增殖活性明显增强。
KLH为T细胞依赖性抗原。一般认为，在针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，IgG是主要的免疫球蛋白类型。二次应答中IgG的产生，需要抗原提呈细胞的参与和T、B细胞的相互作用[7]。本实验中内耳免疫后7 d起，内淋巴囊的IgG阳性细胞逐渐增多，且其出现部位与BrdUrd阳性细胞相似，提示内淋巴囊局部增殖的细胞可在原位分化为IgG阳性细胞，二者在内淋巴囊出现的时间差可能正好是S期细胞分化为IgG阳性细胞所需要的时间[5]。
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本实验显示，内耳抗原免疫后3 d，内淋巴囊出现以单核吞噬细胞为主的细胞浸润，吞噬细胞对抗原的吞噬也主要发生于此时，7 d时内淋巴囊的淋巴细胞和浆细胞大量增加，提示吞噬细胞对抗原进行识别和处理后，再将其提呈给内淋巴囊的淋巴细胞，使后者发生增殖和分化，产生大量的免疫活性细胞，参与免疫应答。
本研究结果表明，内耳针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，内淋巴囊的细胞增殖活性增强，且局部增殖的细胞可能在原位分化为免疫活性细胞，提示内淋巴囊具有增殖免疫活性细胞的功能，说明其在内耳免疫应答的过程中发挥关键作用。
图1 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊的淋巴细胞和浆细胞浸润.EH×400
图2 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊囊腔的KLH被吞噬细胞吞噬(↑)SABC×400
, 百拇医药
图3 对照组大鼠内淋巴囊的BrdUrd阳性细胞.ES:内淋巴囊囊腔;箭头;阳性细胞,以下同.SABC×400
图4 对照组大鼠内淋巴囊lgG阳性细胞.SABC×400
图5 内耳抗原刺激后3d,大鼠内淋巴囊上皮层的BrdUrd阳性细胞增多.SABC×200
图6 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊的lgG阳性细胞增多其定位与BrdUrd细胞大致相似.SABC×400
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J079)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Takahashi M, Harris JP. Anatomic distribution and localization of immunocompetent cell in normal mouse endolymphatic sac. Acta Otolaryngol ,1988,106: 409-416.
2，Tomiyama S，Harris JP.The endolymphatic sac:its importance in inner ear immune response. Laryngoscope,1986,96: 685-691.
3，龚树生,曾新力,汪吉宝,等.细胞间粘附分子-1在内耳免疫反应中的表达.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:158-160.
4，Gloddek B, Harris JP.Role of lymphokines in immnue response of the inner ear. Acta Otolaryngol,1989,108: 68-75.
, 百拇医药
5，Takahashi M, Tomiyama S. Cell proliferation in the endolymphatic sac in situ after inner ear immunostimulation. Acta Otolaryngol, 1995, 115: 396-399.
6，肖红俊,汪吉宝.鸡内耳感觉上皮细胞的自然增殖状态.中华耳鼻咽喉科杂志,1997,32:24-26.
7，毕爱华，龚非力. 医学免疫学. 北京：人民军医出版社，1995.111-116.
(收稿日期：2000-06-27), 百拇医药
单位：黄孝文 汪吉宝 黄翔(华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉科 武汉 430030)；肖红俊(华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：内淋巴囊；细胞分化；溴脱氧尿嘧啶核苷
中华耳鼻咽喉科杂志000611 【摘要】 目的 研究和评价内耳二次免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖情况。方法 选用SD大鼠15只，以钥孔虫 戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)全身免疫后，经耳蜗底回钻孔以相同抗原进行内耳免疫，然后分别在内耳免疫后3、7和14 d腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdUrd)后处死动物，取颞骨经组织学处理制作冰冻切片，用免疫组织化学技术观察内淋巴囊的细胞浸润、增殖和IgG细胞的分布状况。结果 内耳受抗原刺激后3 d内淋巴囊囊腔和囊周区域出现单核吞噬细胞浸润，7 d内淋巴囊的浆细胞和淋巴细胞大量增加；3～7 d内淋巴囊囊腔KLH被吞噬，同时S期细胞和IgG阳性细胞逐渐增多，二者的出现部位相似。结论 在内耳针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，内淋巴囊的细胞增殖活性增强，且局部增殖的细胞可能在原位分化为免疫活性细胞，提示内淋巴囊具有增殖免疫活性细胞的功能，在内耳免疫应答过程中发挥重要作用。
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Cell proliferation in endolymphatic sac during the immune response of inner ear
HUANG Xiaowen, XIAO Hongjun, WANG Jibao, et al.
(Department of Otorhinolaryngology, Tongji Hospital ,Tongji Medical College,Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030，China)
【Abstract】 Objective To study the cell proliferation in endolymphatic sac(ES) during the secondary immune response in inner ear. Methods Fifteen healthy, female SD rats were employed in the experiment. Sensitized systematically with keyhole limpet hemocyanin (KLH), the animals were inoculated with the same antigen through cochlea basal turn into the labyrinth. Adminstrated 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdUrd) intraperitoneally, the rats were sacrificed and the temporal bones were harvested at 3, 7,14 day after labyrinth vaccination respectively. The frozen sections of the decalcified samples were dealt with H-E staining and immunohistohemical methods to investigate the cellular infiltration, BrdUrd and IgG positive cells in the ES. Results While the ES lumen and perisaccular region were infiltrated with mononeuclear-phagocyte at the 3rd day post-vaccination, plasmocyte and lymphatic cells become the predominant infiltrating cells in the ES at the 7th day. The KLH in the ES lumen were phagocytized at the 3-7th day post-vaccination. S-phase cells and IgG positive cells in ES increased markedly in the 3rd day and 7-14 days post-vaccination respectively with similar localization. Conclusion The activety of cell proliferation in the ES enhance and local proliferated cells may differentiate in situ into immunocomptent cells during the secondary immune response against TD antigen in the inner ear. This indicates that ES plays an important role in immume reponse of inner ear.
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【Key words】 Endolymphatic sac； Cell differentiation； Bromodeoxyuridine
研究表明，内耳受到抗原激发时，内淋巴囊局部可聚集包括免疫活性细胞在内的大量炎症细胞参与免疫反应，说明内淋巴囊在内耳免疫中具有重要作用。本研究采用细胞增殖标记技术和免疫组织化学技术，观察内耳免疫应答过程中内淋巴囊的细胞增殖状况，报道如下。
材料与方法
选健康成年雌性SD大鼠20只(购于同济医科大学实验中心动物学部)，体重180～200 g，分为健康对照组(n=5)和实验组(n=15)。实验组动物在全身免疫和内耳免疫术后，随机均分为3个时间组，分别在内耳术后3、7和14 d进行组织学处理和观察。
1.全身免疫：实验组动物用钥孔虫 戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH，Sigma公司，美国)0.5 mg加入Freund完全佐剂，在前、后腿内侧行多点皮下注射。1周后再以等量抗原加入Freund不完全佐剂在相同部位作加强免疫注射。2周后行内耳免疫。
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2.内耳免疫：以右耳为免疫耳，左耳为对照耳。动物用水合氯醛(300 mg/ kg体重)腹腔注射全身麻醉后，在无菌条件下，经耳后下切口打开听泡，在手术显微镜下直视耳蜗，用微型手捻钻在耳蜗底回钻微孔，见清亮外淋巴溢出时，将微量毛细进样管插入，右耳缓慢注入KLH 5 μL [100 μg以磷酸盐缓冲液(phoshate-buffered saline，PBS)稀释]，左耳注射Hank溶液5 μL。立即用骨蜡封闭耳蜗微孔，缝合术创。
3.细胞增殖标记物的活体引入和组织学准备：全部动物腹腔注射5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdUrd，Sigma，美国)溶液(50 mg/kg体重)。1 h后同上法全身麻醉动物，打开听泡，在蜗尖刺小孔后，经圆窗和卵圆窗缓慢灌注4%多聚甲醛PBS，作活体迷路内固定，随后断头处死动物，立即连同枕骨取出双侧颞骨，置相同固定液中固定24 h，再将标本置10%乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA-Na2)溶液中2～3周充分脱钙(固定和脱钙之初各真空抽气10 min)，然后以OCT包埋，用恒冷箱冰冻切片机垂直于颞骨内面并平行于蜗轴作冰冻切片，片厚10 μm，取耳蜗和内淋巴囊切片干燥冻存备用。
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4.免疫组织化学染色和HE染色：采用SABC(strept avidin-biotin complex)法行IgG和KLH免疫组化染色，主要步骤为：先将切片置0.3%双氧水甲醛溶液15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，再以10%健康羊血清封闭30 min，随后以小鼠抗大鼠IgG(Sigma，美国)或小鼠抗KLH单克隆抗体(Sigma，美国；均为1∶1 000)孵育1～2 h，然后用生物素化羊抗鼠IgG和SABC (博士德公司，武汉)各孵育30 min，最后以3,3′二氨基联苯胺(diamino-benzidine，DAB)溶液显色3～5 min，蒸馏水终止反应，部分切片用苏木精复染1 min，脱水后以中性树胶封片。光镜观察，IgG染色以细胞膜呈棕褐色者为阳性，KLH染色以组织或细胞呈棕褐色为阳性。
BrdUrd免疫组织化学染色过程与上述方法稍有不同，主要为：封闭内源性过氧化物酶活性后，将切片置4 mol/L盐酸25 min，使DNA双链结构变性，暴露出BrdUrd；用冷硼酸缓冲液中和盐酸后，再加0.01%蛋白酶作用5 min，以破坏细胞膜和核膜，提高抗体的通透性；一抗用小鼠抗BrdUrd单克隆抗体(Sigma，美国，1∶1 000)，此后步骤同IgG染色。观察时以细胞核呈棕褐色者为阳性细胞。
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以PBS代替一抗同法处理，作为免疫组织化学染色的空白对照。
另作常规HE染色观察耳蜗和内淋巴囊的细胞浸润情况。
结果
1.HE染色：实验动物免疫耳受抗原刺激后3 d(5耳)内淋巴囊囊腔、上皮下和囊周区域出现不同程度的单核吞噬细胞浸润，7、14 d(各5耳)内淋巴囊的浸润细胞均大量增加，此时淋巴细胞和浆细胞为主要细胞类型(图1)；耳蜗鼓阶和前庭阶亦出现类似的细胞浸润过程；Hank溶液对照耳无细胞浸润。
2.KLH染色：实验动物内耳术后3 d和7 d，全部免疫耳均显示内淋巴囊囊腔和囊周区域的KLH被吞噬细胞吞噬(图2)，此后抗原逐渐被清除而消失；Hank溶液对照耳无上述改变。
3.BrdUrd和IgG染色：对照组动物内淋巴囊上皮、上皮下及囊周可见散在的BrdUrd阳性细胞和少量IgG阳性细胞(图3，4)。 实验动物免疫耳在内耳抗原接种后3 d(5耳)内淋巴囊囊腔、上皮层和囊周的BrdUrd阳性细胞明显增多(图5)；7 d(5耳)和14 d(5耳)内淋巴囊的IgG阳性细胞增多，且多聚集于上皮层和囊周组织(图6)，其出现部位与BrdUrd阳性细胞大致相似。Hank液对照耳未见上述改变。
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免疫组化空白对照片未显示任何棕褐色染色。
讨论
研究表明，正常状态下内淋巴囊存在少量免疫活性细胞，包括各类T淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞等，即所谓局部居住(local resident)的免疫细胞[1]。内耳发生炎症或免疫应答时内淋巴囊可聚集大量淋巴细胞参与反应[2]。这些细胞可能来自全身血液循环，也可能源于局部居住淋巴细胞的大量增殖分化。全身抗原免疫后，IgG阳性细胞的前体在脾、淋巴结等免疫器官中被致敏，一旦内耳再次受到相同抗原的激发，这些前体细胞就可能通过由粘附分子介导的淋巴细胞“归巢”机制，从免疫器官进入内淋巴囊[3]，然后在抗原提呈细胞和IL-2等细胞因子的作用下，进一步增殖分化为成熟细胞[4]；同样，局部居住的淋巴细胞也可能在这一过程中原位增殖和分化而大量增加，从而产生大量的抗原特异性淋巴细胞，使内耳免疫反应得以维持和发展[5]。
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细胞增殖周期分为G1、S、G2和M期4个阶段，其中S期(即DNA合成期)为重要标志。溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdUrd)为胸腺嘧啶的同功异构体(analogue)，引入体内后可被S期细胞特异性地摄入其细胞核，通过免疫组织化学技术可以显示这类细胞在组织中的存在，因而可了解组织的细胞增殖活性[6]。本实验中内耳受抗原激发后，内淋巴囊的BrdUrd阳性(即S期细胞)细胞增多，3 d达高峰，提示内耳发生免疫应答时内淋巴囊的细胞增殖活性明显增强。
KLH为T细胞依赖性抗原。一般认为，在针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，IgG是主要的免疫球蛋白类型。二次应答中IgG的产生，需要抗原提呈细胞的参与和T、B细胞的相互作用[7]。本实验中内耳免疫后7 d起，内淋巴囊的IgG阳性细胞逐渐增多，且其出现部位与BrdUrd阳性细胞相似，提示内淋巴囊局部增殖的细胞可在原位分化为IgG阳性细胞，二者在内淋巴囊出现的时间差可能正好是S期细胞分化为IgG阳性细胞所需要的时间[5]。
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本实验显示，内耳抗原免疫后3 d，内淋巴囊出现以单核吞噬细胞为主的细胞浸润，吞噬细胞对抗原的吞噬也主要发生于此时，7 d时内淋巴囊的淋巴细胞和浆细胞大量增加，提示吞噬细胞对抗原进行识别和处理后，再将其提呈给内淋巴囊的淋巴细胞，使后者发生增殖和分化，产生大量的免疫活性细胞，参与免疫应答。
本研究结果表明，内耳针对T细胞依赖性抗原的二次应答中，内淋巴囊的细胞增殖活性增强，且局部增殖的细胞可能在原位分化为免疫活性细胞，提示内淋巴囊具有增殖免疫活性细胞的功能，说明其在内耳免疫应答的过程中发挥关键作用。
图1 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊的淋巴细胞和浆细胞浸润.EH×400
图2 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊囊腔的KLH被吞噬细胞吞噬(↑)SABC×400
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图3 对照组大鼠内淋巴囊的BrdUrd阳性细胞.ES:内淋巴囊囊腔;箭头;阳性细胞,以下同.SABC×400
图4 对照组大鼠内淋巴囊lgG阳性细胞.SABC×400
图5 内耳抗原刺激后3d,大鼠内淋巴囊上皮层的BrdUrd阳性细胞增多.SABC×200
图6 内耳抗原刺激后7d,大鼠内淋巴囊的lgG阳性细胞增多其定位与BrdUrd细胞大致相似.SABC×400
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J079)
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参考文献
1，Takahashi M, Harris JP. Anatomic distribution and localization of immunocompetent cell in normal mouse endolymphatic sac. Acta Otolaryngol ,1988,106: 409-416.
2，Tomiyama S，Harris JP.The endolymphatic sac:its importance in inner ear immune response. Laryngoscope,1986,96: 685-691.
3，龚树生,曾新力,汪吉宝,等.细胞间粘附分子-1在内耳免疫反应中的表达.中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:158-160.
4，Gloddek B, Harris JP.Role of lymphokines in immnue response of the inner ear. Acta Otolaryngol,1989,108: 68-75.
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5，Takahashi M, Tomiyama S. Cell proliferation in the endolymphatic sac in situ after inner ear immunostimulation. Acta Otolaryngol, 1995, 115: 396-399.
6，肖红俊,汪吉宝.鸡内耳感觉上皮细胞的自然增殖状态.中华耳鼻咽喉科杂志,1997,32:24-26.
7，毕爱华，龚非力. 医学免疫学. 北京：人民军医出版社，1995.111-116.
(收稿日期：2000-06-27), 百拇医药