胆囊癌47例临床诊治分析
作者：崔健 余云 陈淑珍 刘东峰
单位：崔健(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；余云(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；陈淑珍(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；刘东峰(辽宁盘锦市妇婴医院外科)
关键词：胆囊癌；诊断；治疗；预后
中国现代医学杂志000327 该文用骨基质明胶以骨胶原复合物及几丁糖为粘结剂组成复合人工骨。30只家兔在双侧尺骨干制成1.5cm的骨缺损，左侧植入一种人工骨，右侧留作自身空白对照。术后2，4，6周进行X线照片和组织学观察。结果表明，以骨胶原复合物为粘结剂的人工骨有强大的成骨诱导能力，而几丁糖可延迟成骨过程。调节骨胶原复合物与几丁糖的比例，不仅提高了粘结强度，且可获得强大的成骨诱导能力。
分类号 R-332
, http://www.100md.com
本研究以骨基质明胶(Bone matrix Gelatin,BMG),骨胶原复合物(Bone Collagen Compound,BCC)及几丁糖(Chitosan)等生物材料合成复合人工骨，并对其进行了粘结强度及骨缺损修复的实验研究。
1 材料和方法
1.1 骨基质明胶的制备
按Urist等的方法[1]，无菌操作下取家兔长骨，剔除骨髓、骨骺和附着的软组织，依次脱脂脱钙，转化为骨基质明胶。
1.2 骨胶原复合物的制备
取骨基质明胶加入0.5mol乙酸，冰箱内浸泡4d，搅拌机搅拌，4d后加胃蛋白酶搅拌24h至液体呈胶冻状，经抽滤为粗胶原，用NaoH调至中性使胃蛋白酶失活。NaCl盐析、蒸馏水冲洗、过滤后再用2%乙酸溶解，弱碱调至中性，透析后即得精制胶原。经紫外分光吸收检验证明符合胶原蛋白的特性，取胶原涂片，免疫组织化学鉴定证明胶原内含有骨形态发生蛋白。
, 百拇医药
1.3 几丁糖的制备
几丁质购自Sigma公司，以NaoH脱乙酰，水洗至中性，干燥后用2%乙酸溶解，制成3%几丁糖，NaoH调至pH6.5备用。
1.4 复合人工骨的制备
将BMG加入BCC和/或几丁糖凝胶，充分搅拌。A组：BMG∶BCC为2∶1(W)，B组：BMG∶几丁糖为2∶1(W)。C组：BMG∶BCC∶几丁糖为4∶1∶1(W)。模具成型，冷冻干燥后制成4×20mm的圆柱体。产品用双层医用塑料袋封装，环氧乙烷灭菌后备用。
1.5 动物模型
成年健康家兔30只，雌雄不限，体重2～2.5kg，随机分为三组。琉喷妥钠腹腔麻醉后，无菌操作下用牙科磨钻切除双侧尺骨中段，造成1.5cm左右的骨缺损，左侧分别植入一种复合人工骨，右侧留作自身空白对照，缝合切口，分笼饲养。
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1.6 观察方法
1.6.1 粘结强度测试 取复合人工骨4×15mm，两端用骨水泥固定在自制模具上，加法码至待测复合人工骨断裂，通过计算此时法码和模具下端的重量及断裂面积，得到试件的粘结强度，试验重复三次，测试温度为30℃。
1.6.2 X线检查 术后2，4，6周用特制夹具固定家兔双侧前肢，X线照片，观察骨愈合情况。
1.6.3 组织学检查 术后2，4，6周切取标本，甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜观察。
2 结果
2.1 粘结强度测试结果 (见表1)
表1 三组复合人工骨的粘结强度(g/cm2) 组别
, 百拇医药
粘结强度
A组
41.6±9.8
B组
81.6±12.1
C组
61.4±10.1
上述数据经方差分析，各组粘结强度的均数差别有高度显著性(P<0.01)。
2.2 X线检查
术后2周A、C组骨缺损区出现高密度阴影，而B组骨缺损区双侧对比无差异。4周骨缺损区基本愈合，但A组有3例高密度阴影松散。B组骨缺损区开始有少许高密度阴影。6周A、C组骨缺损区愈合。但A组3例畸形愈合，B组骨缺损基本愈合。所有对照组骨缺损区均未愈合。
, 百拇医药
2.3 组织学检查
术后2周植入物的组织切片，A、C组可见大量原始骨组织，原始骨小梁交织成网，骨小梁表面可见成骨细胞和破骨细胞。4周时A、C组切片中原始骨组织更多，其成骨方式为软骨内成骨，自骨组织表面开始，依次可见软骨组织增生，软骨基质钙化及成骨区原始骨髓腔表面有大量破骨细胞和成骨细胞。B组片中开始出现大量原始骨组织。6周时A、C组见成熟骨组织，并可见骨单位(哈佛氏管与福克曼氏管均清晰可见)。B组可见典型的软骨内成骨。
3 讨论
大块骨缺损，尤其是长骨的缺损，目前尚无理想的替代材料。临床实际上唯一的选择是大块异体骨。然而长期随访结果显示，植入后骨的血运重建和再生是一个缓慢的过程，术后数年仍有大量死骨与活骨共存，5年后还有疲劳骨折[2，3]。故需要长期保护，影响生活质量。理想的移植材料应具有以下特点：容易获取，生物相容性好，易被新骨替代；有较强的成骨诱导能力和骨传导作用；粘合成型方便，适于替代不同形态的骨骼。以陶瓷、磷酸三钙或羟基磷灰石为主体的复合人工骨由于降解慢或不能降解，在骨缺损区长期滞留，阻碍了新骨长入。本实验的复合人工骨以BMG为主体，BMG经制备已没有抗原性[4]，组织相容性好。据文献报道BMP植入7d后即能诱导成骨[5]，BMG植入7d后也能诱成骨的发生[6]。本实验植入A型及C型复合人工骨后2周，X线照片显示骨缺损区出现高密度阴影，4周后骨缺损区基本愈合，6周的组织切片可见到成熟的骨单位。这些与加入BMP组成的人工骨成骨过程非常相似[7]，BMG是提取BMP前最后一种骨基质形态，虽然有实验证明BMP比BMG具有更强的成骨诱导作用，但10kg新鲜骨才提取10mg BMP，工艺复杂，价格昂贵，因而限制了它的临床实际应用。另外BMP植入后被迅速吸收达不到成骨效果，所以需要载体来使BMP缓解，而载体并无成骨诱导能力。BMG在任何实验室均可制备，脱钙的骨基质血管易长入，这样BMG不仅使其含有的BMP逐渐向周围组织释放，刺激骨生长，而且它还是成骨过程中不可缺少的骨传导物[8]。经超低温粉碎的骨粒制成的BMG由于粒度小，扩散面积大，也利于BMP的释放。
, 百拇医药
参考文献：
1 Urist MR,Iwata H,Ceccotti RL,et al.Bone morhogenesis in implants of insoluble bone elatin.Proc Nat Acad.Sci USA.1973;70:3511～3515
2 Erkki VS,Koskinen MD.Wide resection of primary tumors of bone and replacement with massive bone grafts.Clin Orthop.1978;134:302～319
3 李亚非，时述山，李 青，等.大段异体骨关节移植后长期转归的观察.中华外科杂志，1998；36：169～171
4 胡晓波，杨海鹰，吴多能，等.异种(猪)骨基质明胶的抗原性研究.免疫组化(酶标)法.中华骨科杂志，1996；16：392～394
, 百拇医药
5 李亚非，胡蕴玉，李雪冰，等.骨粒粒度与强化搅拌对骨形态发生蛋白提取量和活性的影响.中华骨科杂志，1996；16：118～120
6 Okamoto Y,Horisake Y,Matsumoto N,et al.Muscle tissue reactions to implantation of bone matrix gelatin.Clin Orthop 1991;263:242～253
7 陈克明，李旭升，刘兴炎，等.骨形态发生蛋白复合纤维蛋白载体修复骨缺损的实验研究.中华骨科杂志，1998；18：68～70
8 Yamashita K,Takagi T.U1 trastructural observetion of cal cification preceding new bone formation induced by demineralized bone matrix gelatin.Acta Anat Basel.1992;143:261～267
(1999-01-27收稿), 百拇医药
单位：崔健(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；余云(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；陈淑珍(中国医科大学第二临床学院肝胆外科沈阳 110003)；刘东峰(辽宁盘锦市妇婴医院外科)
关键词：胆囊癌；诊断；治疗；预后
中国现代医学杂志000327 该文用骨基质明胶以骨胶原复合物及几丁糖为粘结剂组成复合人工骨。30只家兔在双侧尺骨干制成1.5cm的骨缺损，左侧植入一种人工骨，右侧留作自身空白对照。术后2，4，6周进行X线照片和组织学观察。结果表明，以骨胶原复合物为粘结剂的人工骨有强大的成骨诱导能力，而几丁糖可延迟成骨过程。调节骨胶原复合物与几丁糖的比例，不仅提高了粘结强度，且可获得强大的成骨诱导能力。
分类号 R-332
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本研究以骨基质明胶(Bone matrix Gelatin,BMG),骨胶原复合物(Bone Collagen Compound,BCC)及几丁糖(Chitosan)等生物材料合成复合人工骨，并对其进行了粘结强度及骨缺损修复的实验研究。
1 材料和方法
1.1 骨基质明胶的制备
按Urist等的方法[1]，无菌操作下取家兔长骨，剔除骨髓、骨骺和附着的软组织，依次脱脂脱钙，转化为骨基质明胶。
1.2 骨胶原复合物的制备
取骨基质明胶加入0.5mol乙酸，冰箱内浸泡4d，搅拌机搅拌，4d后加胃蛋白酶搅拌24h至液体呈胶冻状，经抽滤为粗胶原，用NaoH调至中性使胃蛋白酶失活。NaCl盐析、蒸馏水冲洗、过滤后再用2%乙酸溶解，弱碱调至中性，透析后即得精制胶原。经紫外分光吸收检验证明符合胶原蛋白的特性，取胶原涂片，免疫组织化学鉴定证明胶原内含有骨形态发生蛋白。
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1.3 几丁糖的制备
几丁质购自Sigma公司，以NaoH脱乙酰，水洗至中性，干燥后用2%乙酸溶解，制成3%几丁糖，NaoH调至pH6.5备用。
1.4 复合人工骨的制备
将BMG加入BCC和/或几丁糖凝胶，充分搅拌。A组：BMG∶BCC为2∶1(W)，B组：BMG∶几丁糖为2∶1(W)。C组：BMG∶BCC∶几丁糖为4∶1∶1(W)。模具成型，冷冻干燥后制成4×20mm的圆柱体。产品用双层医用塑料袋封装，环氧乙烷灭菌后备用。
1.5 动物模型
成年健康家兔30只，雌雄不限，体重2～2.5kg，随机分为三组。琉喷妥钠腹腔麻醉后，无菌操作下用牙科磨钻切除双侧尺骨中段，造成1.5cm左右的骨缺损，左侧分别植入一种复合人工骨，右侧留作自身空白对照，缝合切口，分笼饲养。
, http://www.100md.com
1.6 观察方法
1.6.1 粘结强度测试 取复合人工骨4×15mm，两端用骨水泥固定在自制模具上，加法码至待测复合人工骨断裂，通过计算此时法码和模具下端的重量及断裂面积，得到试件的粘结强度，试验重复三次，测试温度为30℃。
1.6.2 X线检查 术后2，4，6周用特制夹具固定家兔双侧前肢，X线照片，观察骨愈合情况。
1.6.3 组织学检查 术后2，4，6周切取标本，甲醛固定，石蜡包埋切片，光镜观察。
2 结果
2.1 粘结强度测试结果 (见表1)
表1 三组复合人工骨的粘结强度(g/cm2) 组别
, 百拇医药
粘结强度
A组
41.6±9.8
B组
81.6±12.1
C组
61.4±10.1
上述数据经方差分析，各组粘结强度的均数差别有高度显著性(P<0.01)。
2.2 X线检查
术后2周A、C组骨缺损区出现高密度阴影，而B组骨缺损区双侧对比无差异。4周骨缺损区基本愈合，但A组有3例高密度阴影松散。B组骨缺损区开始有少许高密度阴影。6周A、C组骨缺损区愈合。但A组3例畸形愈合，B组骨缺损基本愈合。所有对照组骨缺损区均未愈合。
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2.3 组织学检查
术后2周植入物的组织切片，A、C组可见大量原始骨组织，原始骨小梁交织成网，骨小梁表面可见成骨细胞和破骨细胞。4周时A、C组切片中原始骨组织更多，其成骨方式为软骨内成骨，自骨组织表面开始，依次可见软骨组织增生，软骨基质钙化及成骨区原始骨髓腔表面有大量破骨细胞和成骨细胞。B组片中开始出现大量原始骨组织。6周时A、C组见成熟骨组织，并可见骨单位(哈佛氏管与福克曼氏管均清晰可见)。B组可见典型的软骨内成骨。
3 讨论
大块骨缺损，尤其是长骨的缺损，目前尚无理想的替代材料。临床实际上唯一的选择是大块异体骨。然而长期随访结果显示，植入后骨的血运重建和再生是一个缓慢的过程，术后数年仍有大量死骨与活骨共存，5年后还有疲劳骨折[2，3]。故需要长期保护，影响生活质量。理想的移植材料应具有以下特点：容易获取，生物相容性好，易被新骨替代；有较强的成骨诱导能力和骨传导作用；粘合成型方便，适于替代不同形态的骨骼。以陶瓷、磷酸三钙或羟基磷灰石为主体的复合人工骨由于降解慢或不能降解，在骨缺损区长期滞留，阻碍了新骨长入。本实验的复合人工骨以BMG为主体，BMG经制备已没有抗原性[4]，组织相容性好。据文献报道BMP植入7d后即能诱导成骨[5]，BMG植入7d后也能诱成骨的发生[6]。本实验植入A型及C型复合人工骨后2周，X线照片显示骨缺损区出现高密度阴影，4周后骨缺损区基本愈合，6周的组织切片可见到成熟的骨单位。这些与加入BMP组成的人工骨成骨过程非常相似[7]，BMG是提取BMP前最后一种骨基质形态，虽然有实验证明BMP比BMG具有更强的成骨诱导作用，但10kg新鲜骨才提取10mg BMP，工艺复杂，价格昂贵，因而限制了它的临床实际应用。另外BMP植入后被迅速吸收达不到成骨效果，所以需要载体来使BMP缓解，而载体并无成骨诱导能力。BMG在任何实验室均可制备，脱钙的骨基质血管易长入，这样BMG不仅使其含有的BMP逐渐向周围组织释放，刺激骨生长，而且它还是成骨过程中不可缺少的骨传导物[8]。经超低温粉碎的骨粒制成的BMG由于粒度小，扩散面积大，也利于BMP的释放。
, 百拇医药
参考文献：
1 Urist MR,Iwata H,Ceccotti RL,et al.Bone morhogenesis in implants of insoluble bone elatin.Proc Nat Acad.Sci USA.1973;70:3511～3515
2 Erkki VS,Koskinen MD.Wide resection of primary tumors of bone and replacement with massive bone grafts.Clin Orthop.1978;134:302～319
3 李亚非，时述山，李 青，等.大段异体骨关节移植后长期转归的观察.中华外科杂志，1998；36：169～171
4 胡晓波，杨海鹰，吴多能，等.异种(猪)骨基质明胶的抗原性研究.免疫组化(酶标)法.中华骨科杂志，1996；16：392～394
, 百拇医药
5 李亚非，胡蕴玉，李雪冰，等.骨粒粒度与强化搅拌对骨形态发生蛋白提取量和活性的影响.中华骨科杂志，1996；16：118～120
6 Okamoto Y,Horisake Y,Matsumoto N,et al.Muscle tissue reactions to implantation of bone matrix gelatin.Clin Orthop 1991;263:242～253
7 陈克明，李旭升，刘兴炎，等.骨形态发生蛋白复合纤维蛋白载体修复骨缺损的实验研究.中华骨科杂志，1998；18：68～70
8 Yamashita K,Takagi T.U1 trastructural observetion of cal cification preceding new bone formation induced by demineralized bone matrix gelatin.Acta Anat Basel.1992;143:261～267
(1999-01-27收稿), 百拇医药