Fas抗原与可溶性Fas在急性淋巴细胞白血病中的表达*
作者：胡中波 游泳 王良利 李惠玉 向建平 邹萍
单位：胡中波(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；游泳(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；王良利(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；李惠玉(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；向建平(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))
关键词：细胞凋亡；Fas Fas，可溶性；聚合酶链式反应；白血病，急性/淋巴细胞
临床血液学杂志000110 摘要：目的：研究Fas和可溶性Fas在急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达，探讨Fas在白血病细胞凋亡障碍中的作用。方法：分别用免疫组化SABC法和双抗夹心ELISA法，检测36例ALL患者和10例正常对照组骨髓细胞Fas抗原(mFas)表达以及血浆可溶性Fas(sFas)的水平。用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测12例ALL患者和7例正常对照骨髓细胞Fas mRNA的表达。结果：36例ALL初诊组患者Fas抗原的表达较正常对照组低〔(6.23±6.58)% vs (28.63±5.02)%，P<0.001〕，血浆中sFas水平也较正常对照组低〔(11.8 176±4.7 620) ng/ml vs (27.2 874±9.2 778) ng/ml，P<0.001〕。ALL组未见Fas mRNA经转移剪接后缺乏跨膜区的1 104 bp(对应于sFas)条带，而正常对照组可见；ALL组Fas mRNA的表达较正常对照组也显著降低(0.3 407 vs 0.8 303，P<0.001)。结论：Fas可能参与了白血病细胞的凋亡障碍，ALL白血病细胞可能不是通过提高血浆sFas水平来逃避凋亡。白血病细胞的Fas是在基因水平发生了调节。
, http://www.100md.com
Study of Fas antigen and soluble Fas expressing in acute lymphocytic leukemia
HU Zhong-bo YOU Yong WANG Liang-li LI Hui-yu XIANG Jian-ping ZOU Ping
(Institute of Hematology,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
Abstract：Objective：To study the expression of Fas and soluble Fas in acute lymphocytic leukemia (ALL) in order to elucidate its role in the failure of apoptosis in leukemias.Method：Strept avidin-biotin complex method (SABC) and ELISA were respectly used to detect the expression of Fas antigen (mFas) in bone marrow cells and that of soluble Fas (sFas) in plasma in 36 ALL patients and 10 normal volunteers.Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expres-sion of Fas mRNA in 12 ALL patients and 7 normal volunteers.Result：The level of mFas in 36 newly diagnosed patients was significantly lower than that in the normal group 〔(6.23±6.58)% vs (28.63±5.02)%，P<0.001)〕.The level of sFas in the plasma of ALL patients was also lower than that in the normal group (11.8 176±4.7 620 ng/ml vs 27.2 874±9.2 778 ng/ml,P<0.001).The 1 104bp Fas △ TM cDNA band was not seen in ALL patients,but it was seen in the normal group.The expression of Fas mRNA in ALL patients was also lower than that in the normal group (0.3 407 vs 0.8 303,P<0.001).Conclusion：The down-regulation of Fas expression was related to the failure of apoptosis in leukemia.Leukemic cells were not certain to evade apoptosis by enhancing the level of sFas in plasma to block the Fas-Fas ligand system.Fas in leukemic cells was regulated in the level of gene.
, 百拇医药
Key words：Apoptosis Fas Fas,soluble Polymerase chain reaction Leukemia,acute lymphocytic▲
细胞凋亡障碍是白血病乃至肿瘤发病的重要机制。Fas(又Apo-1，CD95)是细胞表面诱导凋亡的分子。许多疾病的发生与Fas表达异常相联系。Fas的变异体可溶性Fas蛋白(sFas)也与自身免疫病的发病有关〔1〕。Fas和sFas在白血病的凋亡障碍的调控中是否发挥作用引起关注。我们选择ALL患者来检测Fas两个变异体的表达，并从mRNA水平确定其表达程度，以了解Fas表达变化在白血病基因调控中可能的作用。
1 材料和方法
1.1 病例和标本
36例ALL患者，均为本院门诊及血液科病房1997年12月～1998年10月的初诊或复发病人。初诊组32例，复发组4例。男27例，女9例，中位年龄25.7(6～62)岁。诊断按FAB法经临床、细胞形态学、细胞化学染色确诊。标本取自患者骨髓。对照组10例，为骨髓正常的受检者。
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1.2 Fas及sFas蛋白检测
按常规方法分离单个核细胞、制片。免疫组化-链酶亲合素-生物素-酶复合物(SABC)法检测Fas抗原，参照文献〔2〕操作。SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。双抗夹心ELISA法检测sFas，参考文献〔3〕进行。ELISA试剂盒产自美国Genzyme公司。
1.3 半定量RT-PCR检测Fas mRNA
1.3.1 总RNA的提取：取106个细胞，用TRIZoL试剂盒(GIBCOBRL，USA)一步法，提取细胞总RNA。紫外分光光度计定量，要求吸光度A260/A280≥1.7。
1.3.2 引物设计：引物由上海生工生物有限公司合成。Fas引物设计参考文献〔1〕，预定扩增片段长度1 167个bp。
, 百拇医药
Fas上游引物：5′CACTTCGGAGGATTGCT-
CAACA-3′
Fas下游引物：5′TATGTTGGCTCTTCAG-
CGCTA-3′
β2M引物设计参考文献〔4〕，预计扩增片段长度114 bp。
β2M上游引物：5′ACCCCCACTGAAAAAGA-
TGA3′
β2M下游引物：5′ATCTTCAAACCTCCAT-
GATG3′
, 百拇医药 1.3.3 半定量RT-PCR：cDNA合成：逆转录反应体系25 μl，加细胞总RNA 1 μg、随机引物100 ng，70℃ 5 min后依次加入RNA酶抑制剂(RNasin，上海华美生物制品公司)25 U，5×Buffer(250 mM Tris-HCl,375 mM KCl,15 mM MgCl2，50 mM DTT)5 μl，0.8 mmol/L dNTP，M-MLV逆转录酶(Promega公司)200 U，37℃ 60 min，95℃ 5 min终止反应。PCR反应及产物分析参照文献〔1，5〕进行，并在HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统下扫描照片，计算Fas/β2 M比值，作为Fas的相对表达水平。
2 结果
2.1 ALL患者及正常人mFas抗原的表达
初诊组32例表达较低(6.23±6.58)%，正常人骨髓细胞10例，表达高(28.63±5.02)%，二者相比，差异有显著性(P<0.001)。
, 百拇医药
2.2 ALL患者与正常人血浆中sFas水平的比较
ALL患者36例中，sFas为(11.8 176±4.7 620)ng/ml，仅3例>20 ng/ml(1例达56.0 480 ng/ml)，而10例正常对照sFas为(27.2874±9.2 778)ng/ml，均>20 ng/ml，二者相比，统计学差异显著(P<0.001)。
2.3 PCR产物电泳结果
PCR产物电泳结果见图1。正常人可见两个条带，分别为1 167 bp Fas全长cDNA(对应于mFas)和1 104 bp的转移拼接后的Fas△TM(对应于sFas)；而ALL患者仅可见1条对应于Fas全长的cDNA条带。
图1 PCR产物电泳结果
, 百拇医药
1，7核酸分子量标准(1 857 bp,1 058 bp,929 bp,383 bp,121 bp)；2 正常骨髓细胞(两对引物)；3 正常骨髓细胞(单一β2M引物)；4，5 ALL患者；6 HL-60细胞
2.4 ALL患者Fas扩增产物与正常人相对水平的比较
ALL患者扩增产物的相对水平与正常人比较见图2。
图2 ALL患者扩增产物的相对水平与正常人比较
ALL患者Fas cDNA Fas/β2M值比正常人低(0.3 407 vs 0.8 303)，统计分析差异有显著性(P<0.01)。
3 讨论
, http://www.100md.com
凋亡障碍是白血病和肿瘤发病的重要机制。Fas是诱导凋亡的分子。Fas的表达与机体细胞的多种生理功能有关，许多疾病的发生与Fas表达异常相联系。白血病中，近来发现Fas的表达在成人T细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病和急性白血病等的肿瘤细胞与正常细胞中有不同〔6，7〕。本实验蛋白水平检测发现，ALL细胞mFas呈低表达，与正常对照差异有显著性，这与Munker等〔7〕的结果基本一致。我们还用扩增的mFas cDNA作半定量分析，结果显示ALL患者表达水平比正常对照也显著降低，与蛋白水平的结果一致，说明ALL白血病细胞可能确实发生了Fas基因表达的下调，这可能是白血病细胞凋亡障碍的一个因素。mFas的低表达可能与白血病细胞生物学行为有关系，即外界因素或体内的某些基因突变，使Fas表达发生了调节，造成表达下调，致使白血病细胞凋亡启动障碍，打破体内细胞的稳态，使“原始的”白血病细胞在体内堆积。在人体液中，以可溶性形式存在的TNF受体家族通过与其配体结合，阻断膜表面受体与配体的作用，发挥对TNF受体效应的抑制作用，从而调节免疫系统的功能状态〔8〕。Fas属TNF受体家族。为了解sFas是否在白血病中存在上述作用，我们观察了36例ALL患者血浆中sFas的分泌水平：1例水平较高，2例呈正常水平，其余均较正常人为低，统计学显示差异有显著性。为证实ALL患者血浆中sFas是否确实低于正常对照组，我们作了Fas的mRNA水平的检测。结果在正常对照组出现了1 104 bp和1 167 bp的两条带，ALL组仅见一条1 167 bp的条带，与预期结果一致。这说明ALL患者sFas的表达很弱，与本研究蛋白水平检测的结果相符合。说明白血病细胞sFas、mFas均发生下调，这可能是其基因水平下调的结果。证明sFas在ALL细胞的凋亡障碍中可能不发挥作用。凋亡的基因调控涉及多个环节，Fas只是其初始环节之一。细胞最终是否发生凋亡是多个环节共同作用的结果。本实验结果为白血病的凋亡研究提供了重要信息，其精确机制有待于更深一步的研究。■
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助课题(基金号 39770767)
参考文献：
[1]Cheng Jianhua,Zhou Tong,Liu Changdan,et al.Protein from Fas medicated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.Science,1994,263：1759～1762
[2]Bussolati G,Gugliota G.Non-specific staining of mast cells by avidin-biotin peroxidase complexes (ABC).J Histochem Cytochem,1983,31：1419～1422
[3]Knipping E,Debatin K M,Stricker K,et al.Soluble and membrane isoforms of Fas/CD95 in fresh adult T-cell leukemia (ATL) cells and ATL-cell lines.Int J Cancer 1997,72：128～132
, 百拇医药
[4]王福旭，黄作仁，罗建民，等.急性白血病患者多药耐药相关蛋白基因表达及临床意义.中华血液学杂志，1998，19：63～66
[5]Dirks W,Schone S,Uphoff C, et al.Expression and function of CD95 (Fas/Apo-1) in leukemia-lymphoma tumour lines.Br J Haematol,1997,96：584～593
[6]Kotani T,Aratake Y,Kondo S,et al.Expression of functional Fas antigen in adult T-cell leukemia.Leukemia Res,1994,18：305～310
[7]Munker R,Lubbert M,Yonehara S,et al.Expression of the Fas antigen on primary human leukemia cells.Ann Hematol,1995,70：15～17
[8]Aderka D,Engelmann H,Hornik V,et al.Increased serum levels of soluble receptors for tumor necrosis factor in cancer patients.Cancer Res,1991,51：5602～5607
收稿 1999-06-24
修回 1999-09-16, http://www.100md.com
单位：胡中波(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；游泳(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；王良利(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；李惠玉(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；向建平(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))；邹萍(同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022))
关键词：细胞凋亡；Fas Fas，可溶性；聚合酶链式反应；白血病，急性/淋巴细胞
临床血液学杂志000110 摘要：目的：研究Fas和可溶性Fas在急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达，探讨Fas在白血病细胞凋亡障碍中的作用。方法：分别用免疫组化SABC法和双抗夹心ELISA法，检测36例ALL患者和10例正常对照组骨髓细胞Fas抗原(mFas)表达以及血浆可溶性Fas(sFas)的水平。用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测12例ALL患者和7例正常对照骨髓细胞Fas mRNA的表达。结果：36例ALL初诊组患者Fas抗原的表达较正常对照组低〔(6.23±6.58)% vs (28.63±5.02)%，P<0.001〕，血浆中sFas水平也较正常对照组低〔(11.8 176±4.7 620) ng/ml vs (27.2 874±9.2 778) ng/ml，P<0.001〕。ALL组未见Fas mRNA经转移剪接后缺乏跨膜区的1 104 bp(对应于sFas)条带，而正常对照组可见；ALL组Fas mRNA的表达较正常对照组也显著降低(0.3 407 vs 0.8 303，P<0.001)。结论：Fas可能参与了白血病细胞的凋亡障碍，ALL白血病细胞可能不是通过提高血浆sFas水平来逃避凋亡。白血病细胞的Fas是在基因水平发生了调节。
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Study of Fas antigen and soluble Fas expressing in acute lymphocytic leukemia
HU Zhong-bo YOU Yong WANG Liang-li LI Hui-yu XIANG Jian-ping ZOU Ping
(Institute of Hematology,Tongji Medical University,Wuhan,430022)
Abstract：Objective：To study the expression of Fas and soluble Fas in acute lymphocytic leukemia (ALL) in order to elucidate its role in the failure of apoptosis in leukemias.Method：Strept avidin-biotin complex method (SABC) and ELISA were respectly used to detect the expression of Fas antigen (mFas) in bone marrow cells and that of soluble Fas (sFas) in plasma in 36 ALL patients and 10 normal volunteers.Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expres-sion of Fas mRNA in 12 ALL patients and 7 normal volunteers.Result：The level of mFas in 36 newly diagnosed patients was significantly lower than that in the normal group 〔(6.23±6.58)% vs (28.63±5.02)%，P<0.001)〕.The level of sFas in the plasma of ALL patients was also lower than that in the normal group (11.8 176±4.7 620 ng/ml vs 27.2 874±9.2 778 ng/ml,P<0.001).The 1 104bp Fas △ TM cDNA band was not seen in ALL patients,but it was seen in the normal group.The expression of Fas mRNA in ALL patients was also lower than that in the normal group (0.3 407 vs 0.8 303,P<0.001).Conclusion：The down-regulation of Fas expression was related to the failure of apoptosis in leukemia.Leukemic cells were not certain to evade apoptosis by enhancing the level of sFas in plasma to block the Fas-Fas ligand system.Fas in leukemic cells was regulated in the level of gene.
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Key words：Apoptosis Fas Fas,soluble Polymerase chain reaction Leukemia,acute lymphocytic▲
细胞凋亡障碍是白血病乃至肿瘤发病的重要机制。Fas(又Apo-1，CD95)是细胞表面诱导凋亡的分子。许多疾病的发生与Fas表达异常相联系。Fas的变异体可溶性Fas蛋白(sFas)也与自身免疫病的发病有关〔1〕。Fas和sFas在白血病的凋亡障碍的调控中是否发挥作用引起关注。我们选择ALL患者来检测Fas两个变异体的表达，并从mRNA水平确定其表达程度，以了解Fas表达变化在白血病基因调控中可能的作用。
1 材料和方法
1.1 病例和标本
36例ALL患者，均为本院门诊及血液科病房1997年12月～1998年10月的初诊或复发病人。初诊组32例，复发组4例。男27例，女9例，中位年龄25.7(6～62)岁。诊断按FAB法经临床、细胞形态学、细胞化学染色确诊。标本取自患者骨髓。对照组10例，为骨髓正常的受检者。
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1.2 Fas及sFas蛋白检测
按常规方法分离单个核细胞、制片。免疫组化-链酶亲合素-生物素-酶复合物(SABC)法检测Fas抗原，参照文献〔2〕操作。SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。双抗夹心ELISA法检测sFas，参考文献〔3〕进行。ELISA试剂盒产自美国Genzyme公司。
1.3 半定量RT-PCR检测Fas mRNA
1.3.1 总RNA的提取：取106个细胞，用TRIZoL试剂盒(GIBCOBRL，USA)一步法，提取细胞总RNA。紫外分光光度计定量，要求吸光度A260/A280≥1.7。
1.3.2 引物设计：引物由上海生工生物有限公司合成。Fas引物设计参考文献〔1〕，预定扩增片段长度1 167个bp。
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Fas上游引物：5′CACTTCGGAGGATTGCT-
CAACA-3′
Fas下游引物：5′TATGTTGGCTCTTCAG-
CGCTA-3′
β2M引物设计参考文献〔4〕，预计扩增片段长度114 bp。
β2M上游引物：5′ACCCCCACTGAAAAAGA-
TGA3′
β2M下游引物：5′ATCTTCAAACCTCCAT-
GATG3′
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2 结果
2.1 ALL患者及正常人mFas抗原的表达
初诊组32例表达较低(6.23±6.58)%，正常人骨髓细胞10例，表达高(28.63±5.02)%，二者相比，差异有显著性(P<0.001)。
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2.2 ALL患者与正常人血浆中sFas水平的比较
ALL患者36例中，sFas为(11.8 176±4.7 620)ng/ml，仅3例>20 ng/ml(1例达56.0 480 ng/ml)，而10例正常对照sFas为(27.2874±9.2 778)ng/ml，均>20 ng/ml，二者相比，统计学差异显著(P<0.001)。
2.3 PCR产物电泳结果
PCR产物电泳结果见图1。正常人可见两个条带，分别为1 167 bp Fas全长cDNA(对应于mFas)和1 104 bp的转移拼接后的Fas△TM(对应于sFas)；而ALL患者仅可见1条对应于Fas全长的cDNA条带。
图1 PCR产物电泳结果
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1，7核酸分子量标准(1 857 bp,1 058 bp,929 bp,383 bp,121 bp)；2 正常骨髓细胞(两对引物)；3 正常骨髓细胞(单一β2M引物)；4，5 ALL患者；6 HL-60细胞
2.4 ALL患者Fas扩增产物与正常人相对水平的比较
ALL患者扩增产物的相对水平与正常人比较见图2。
图2 ALL患者扩增产物的相对水平与正常人比较
ALL患者Fas cDNA Fas/β2M值比正常人低(0.3 407 vs 0.8 303)，统计分析差异有显著性(P<0.01)。
3 讨论
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凋亡障碍是白血病和肿瘤发病的重要机制。Fas是诱导凋亡的分子。Fas的表达与机体细胞的多种生理功能有关，许多疾病的发生与Fas表达异常相联系。白血病中，近来发现Fas的表达在成人T细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病和急性白血病等的肿瘤细胞与正常细胞中有不同〔6，7〕。本实验蛋白水平检测发现，ALL细胞mFas呈低表达，与正常对照差异有显著性，这与Munker等〔7〕的结果基本一致。我们还用扩增的mFas cDNA作半定量分析，结果显示ALL患者表达水平比正常对照也显著降低，与蛋白水平的结果一致，说明ALL白血病细胞可能确实发生了Fas基因表达的下调，这可能是白血病细胞凋亡障碍的一个因素。mFas的低表达可能与白血病细胞生物学行为有关系，即外界因素或体内的某些基因突变，使Fas表达发生了调节，造成表达下调，致使白血病细胞凋亡启动障碍，打破体内细胞的稳态，使“原始的”白血病细胞在体内堆积。在人体液中，以可溶性形式存在的TNF受体家族通过与其配体结合，阻断膜表面受体与配体的作用，发挥对TNF受体效应的抑制作用，从而调节免疫系统的功能状态〔8〕。Fas属TNF受体家族。为了解sFas是否在白血病中存在上述作用，我们观察了36例ALL患者血浆中sFas的分泌水平：1例水平较高，2例呈正常水平，其余均较正常人为低，统计学显示差异有显著性。为证实ALL患者血浆中sFas是否确实低于正常对照组，我们作了Fas的mRNA水平的检测。结果在正常对照组出现了1 104 bp和1 167 bp的两条带，ALL组仅见一条1 167 bp的条带，与预期结果一致。这说明ALL患者sFas的表达很弱，与本研究蛋白水平检测的结果相符合。说明白血病细胞sFas、mFas均发生下调，这可能是其基因水平下调的结果。证明sFas在ALL细胞的凋亡障碍中可能不发挥作用。凋亡的基因调控涉及多个环节，Fas只是其初始环节之一。细胞最终是否发生凋亡是多个环节共同作用的结果。本实验结果为白血病的凋亡研究提供了重要信息，其精确机制有待于更深一步的研究。■
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参考文献：
[1]Cheng Jianhua,Zhou Tong,Liu Changdan,et al.Protein from Fas medicated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.Science,1994,263：1759～1762
[2]Bussolati G,Gugliota G.Non-specific staining of mast cells by avidin-biotin peroxidase complexes (ABC).J Histochem Cytochem,1983,31：1419～1422
[3]Knipping E,Debatin K M,Stricker K,et al.Soluble and membrane isoforms of Fas/CD95 in fresh adult T-cell leukemia (ATL) cells and ATL-cell lines.Int J Cancer 1997,72：128～132
, 百拇医药
[4]王福旭，黄作仁，罗建民，等.急性白血病患者多药耐药相关蛋白基因表达及临床意义.中华血液学杂志，1998，19：63～66
[5]Dirks W,Schone S,Uphoff C, et al.Expression and function of CD95 (Fas/Apo-1) in leukemia-lymphoma tumour lines.Br J Haematol,1997,96：584～593
[6]Kotani T,Aratake Y,Kondo S,et al.Expression of functional Fas antigen in adult T-cell leukemia.Leukemia Res,1994,18：305～310
[7]Munker R,Lubbert M,Yonehara S,et al.Expression of the Fas antigen on primary human leukemia cells.Ann Hematol,1995,70：15～17
[8]Aderka D,Engelmann H,Hornik V,et al.Increased serum levels of soluble receptors for tumor necrosis factor in cancer patients.Cancer Res,1991,51：5602～5607
收稿 1999-06-24
修回 1999-09-16, http://www.100md.com