大鼠黄体萎缩时期黄体细胞中羟自由基的变化研究
作者：王蓬勃 周少波 王桂杰 倪江 程治平
单位：王蓬勃：汕头大学医学院；周少波 王桂杰：中国预防医学科学院；倪江 程治平：哈尔滨医科大学
关键词：黄体细胞；羟自由基；黄体萎缩
黑龙江医药科学990201
提要 本实验以PMSG和hCG处理后黄体细胞萎缩时期大鼠为实验材料，研究黄体萎缩时期黄体细胞羟自由基变化，经HPLC测定hCG注射后7-11天(黄体期)细胞羟自由基含量处于平稳的水平[(0.423±0.08)InM-(0.518±0.117)nM]，而在萎缩期间黄体细胞羟自由基含量明显升高[(0.627±0.098)nM-(0.591±0.18)nM]，从而在一定方面揭示了黄体萎缩时其体细胞生物学性状的改变，为进一步研究黄体萎缩机制提供了线索。
, 百拇医药 Study of hydroxyl group content of corpus luteal cell during corpus luteum regression
Wang Pengbo,et al
Abstract The corpus luteal(CL)cell of rats corpus luteum after the stoppage of PMSG and hCG injection was used to investigate the relationship between its regression and the Hydroxyl Group content of CL cell. Our strudies demonstrate that. Hydroxyl Group content increase from normal level[(0.424±0.081)nM～(0.518±0.117)nM] to a higher level [(0.627±0.098)nM～(0.591±0.108)nM]during CL regression. The results show that biochemical changes such as Hydroxyl Group may play an important role in CL regression process.
, 百拇医药
Key words Corpus luteal cell; hydroxyl group; corpus luteum regression
黄体组织对雌性动物的生理活动起重要的调节作用。正常生理条件下黄体经历发育、成熟及萎缩等周期性变化。萎缩是雌性哺乳动物卵巢周期变化的重要部分，黄体细胞被巨噬细胞所吞噬，伴随着孕酮分泌功能的降低，下一个生殖周期才能开始。但多年来黄体萎缩的机制一直不明了，一些研究显示，黄体萎缩时期黄体细胞的生物学性状发生一系列变化，影响到黄体细胞的生理功能[1,2]，而自由基是影响细胞结构和功能的重要因素，因此本实验通过对黄体萎缩时期黄体细胞羟自由基的测定，探讨黄体萎缩时期黄体细胞生物化学性质的变化对黄体萎缩过程的影响，从而揭示黄体萎缩的有关机制。
1 材料与方法
1.1 动物处理及黄体组织发育过程评估
, 百拇医药
取25～28日龄未成年健康雌性Wistar大鼠，体重50～60g，皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)65U/只，使卵泡开始发育，待发育成熟，再皮下注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)40U/只，促使大量成熟卵泡超排卵并转化成大量黄体。分D7、D9、D11、D13、D17共6组(D右下角阿拉伯数字表示hCG注射后天数)，每组用7只动物，取黄体组织观察萎缩情况，取每只动物左右黄体组织分别称重，取平均值为一次测定结果，以评价黄体萎缩过程。
1.2 大鼠黄体细胞悬液的制备
将注射hCG后不同时期的动物处死，取黄体组织置于无Ca2+、Mg2+的Kreb-Ringer碳酸盐缓冲液(KRBG)中经修剪，称重，切碎后，置于含胶原酶(2.00U，Sigma)和DNA酶(3.00U，Sigma)溶液中消化黄体，并充入95% O2和5% CO2混合气体，置于37℃振荡温育1小时，吹打使之分散。尼龙网过滤，将滤液离心5分钟弃掉上清液，沉积细胞用含0.1%(W/V)牛血清白蛋白和25mM Herpes的KRBG液制成黄体细胞悬液，充分混匀后分装各个培养管，使最终浓度达2.0×106/ml。
, 百拇医药
1.3 大鼠黄体组织各时期黄体细胞中羟自由基的测定
采用HPLC方法测定不同时期黄体细胞羟自由基含量，具体方法如下：取1ml 2.0×106细胞/ml置于10ml试管内，向其中加入40μl 100μM 2.4-DHBA作为内标，同时加入50μl盐酸，10μl乙醚，在振荡器上充分混匀90秒钟，然后静止分层，将乙醚层转移到另一试管中，置于40℃水浴中，使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50μl 1N盐酸和32.5μl流动相(80% 0.03M pH3.6)，将试管壁上结晶状物彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后，取20μl进行HPLC分析。
2 结果
2.1 黄体组织发育过程研究
本实验沿用本实验室多年使用的未成年大鼠PMSG-hHG处理模型，研究其黄体发育情况，汇于表1。
, 百拇医药
表1 Weight of CL during regression (
±s, n=7) Time
D7
D9
D11
D13
D15
D17
Weight(mg)
63.1±7.8
, 百拇医药
64.7±6.4
59.5±8.2
31.2**±5.7
19.3**±7.1
14.2**±5.2
VsD7，**P<0.01
实验结果表明，在hCG注射后第13天，黄体组织体积减小，重量减轻，发生明显的萎缩性变化。
2.2 黄体各时期黄体细胞内羟自由基测定结果
本实验以水杨酸作为捕捉剂，以HPLC检测法测定水杨酸与羟自由基反应后形成的羟化产物：二羟苯甲酸(dihydroxybenzoic acid, DHBA)。和其它羟自由基捕捉剂(如芳香化苯酸、DMPO等)相比，水杨酸在低浓度时细胞毒性小，产物稳定，有利于灵敏检测羟自由基的含量，是一个较为理想的实验方法。实验结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 DHBA content in CL during regression (
±s, n=7) Time
D7
D9
D11
D13
D15
D17
DHBA(nM)
0.423±0.081
, 百拇医药
0.488±0.074
0.518±0.117
0.627**±0.098
0.479*±0.121
0.591*±0.108
VsD7 *P<0.05 **P<0.01
实验结果显示，在D7～D11，黄体细胞中羟自由基含量基本稳定，在D13开始比较活跃，持续在一个较高的水平，说明在黄体萎缩期间黄体细胞中羟自由基反应比较活跃。
3 讨论
本实验以雌性未成年Wistar大鼠为实验材料，用PMSG处理可刺激卵泡发育，诱发内源性FSH和LH峰，后二者引起排卵，此时再注射hCG，可造成超排卵，形成更多的黄体，D7时发现此时卵巢组织几乎全部由黄体组成，此时黄体细胞体积大，核圆，细胞丰满，黄体组织体积大，血管丰富，通过对黄体组织重量测定发现，D13时重量减轻，体积缩小，发生了明显的萎缩，通过观察时间的延长，发现萎缩过程持续存在，本实验与以往的报道相一致[3]，黄体形成，萎缩过程及体内激素的变化都与雌性成年大鼠的性周期变化相一致，便于研究。对黄体各时期黄体细胞羟自由基的研究显示：黄体组织在D7～D11时羟自由基含量较低，稳定在(0.423±0.081)nM至(0.518±0.117)nM这样一个低水平，D13开始黄体组织羟自由基反应活跃，上升至(0.627±0.098)nM，此后一个阶段(D13～D17)持续在一个较高的水平，此时期正是黄体萎缩期，说明在黄体萎缩期间黄体细胞中羟自由基反应是比较活跃的。在正常的情况下细胞中自由基的产生与消除处于动态平衡状态，使细胞维持正常的功能，自由基反应活跃，超过细胞自身清除能力时，会形成积累，可对生物大分子的严重损伤，影响细胞的重量功能。以往研究显示，细胞凋亡参与了黄体组织萎缩过程[4]，而羟自由基可能是影响细胞凋亡与否的重要因素，在凋亡初期，由于染色质位于核小体间的组蛋白成分是自由基攻击的主要目标，DNA断裂成50～100kb的大片段的过程与羟自由基作用有关[5]。本实验结果显示，在黄体期间黄体细胞羟自由基反应活跃，这在一定程度上为这一论点提供了依据。
, http://www.100md.com
综上所述，本实验通过对黄体不同时期黄体细胞中羟自由基的测定，发现在黄体萎缩期黄体细胞的羟自由基反应活跃，从而在一定方面揭示了黄体萎缩时黄体细胞生物学性状的改变，为进一步研究黄体萎缩机制提供了线索，许多问题仍有待于进一步研究。
参考文献
1.Mc Cormack. JT. Apoptosis during spontaneous luteolysis in the cyclic golden hamster: biochemical and morphological evidence. Biol Reprod. 1998;58:255
2.Young, FM. Cell death during luteal regression in the marmoset monkey. J Peprod Fertil.1997;111:109
, http://www.100md.com
3.Sakamaki K. Involvement of Fas antigen in ovarian follicular atresia and luteolysis. Mol-Reprod-Dev. 1997;47:11
4.王蓬勃.大鼠黄体退化与细胞凋亡及酪氨酸的影响.中国医学科学院科学年会论文集,1996,P141,北京医科大学中国协和医科大学联合出版社出版
5.Robert A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death. Endocrine Reviews. 1993;14:133
(1998-09-18收稿), http://www.100md.com
单位：王蓬勃：汕头大学医学院；周少波 王桂杰：中国预防医学科学院；倪江 程治平：哈尔滨医科大学
关键词：黄体细胞；羟自由基；黄体萎缩
黑龙江医药科学990201
提要 本实验以PMSG和hCG处理后黄体细胞萎缩时期大鼠为实验材料，研究黄体萎缩时期黄体细胞羟自由基变化，经HPLC测定hCG注射后7-11天(黄体期)细胞羟自由基含量处于平稳的水平[(0.423±0.08)InM-(0.518±0.117)nM]，而在萎缩期间黄体细胞羟自由基含量明显升高[(0.627±0.098)nM-(0.591±0.18)nM]，从而在一定方面揭示了黄体萎缩时其体细胞生物学性状的改变，为进一步研究黄体萎缩机制提供了线索。
, 百拇医药 Study of hydroxyl group content of corpus luteal cell during corpus luteum regression
Wang Pengbo,et al
Abstract The corpus luteal(CL)cell of rats corpus luteum after the stoppage of PMSG and hCG injection was used to investigate the relationship between its regression and the Hydroxyl Group content of CL cell. Our strudies demonstrate that. Hydroxyl Group content increase from normal level[(0.424±0.081)nM～(0.518±0.117)nM] to a higher level [(0.627±0.098)nM～(0.591±0.108)nM]during CL regression. The results show that biochemical changes such as Hydroxyl Group may play an important role in CL regression process.
, 百拇医药
Key words Corpus luteal cell; hydroxyl group; corpus luteum regression
黄体组织对雌性动物的生理活动起重要的调节作用。正常生理条件下黄体经历发育、成熟及萎缩等周期性变化。萎缩是雌性哺乳动物卵巢周期变化的重要部分，黄体细胞被巨噬细胞所吞噬，伴随着孕酮分泌功能的降低，下一个生殖周期才能开始。但多年来黄体萎缩的机制一直不明了，一些研究显示，黄体萎缩时期黄体细胞的生物学性状发生一系列变化，影响到黄体细胞的生理功能[1,2]，而自由基是影响细胞结构和功能的重要因素，因此本实验通过对黄体萎缩时期黄体细胞羟自由基的测定，探讨黄体萎缩时期黄体细胞生物化学性质的变化对黄体萎缩过程的影响，从而揭示黄体萎缩的有关机制。
1 材料与方法
1.1 动物处理及黄体组织发育过程评估
, 百拇医药
取25～28日龄未成年健康雌性Wistar大鼠，体重50～60g，皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG)65U/只，使卵泡开始发育，待发育成熟，再皮下注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)40U/只，促使大量成熟卵泡超排卵并转化成大量黄体。分D7、D9、D11、D13、D17共6组(D右下角阿拉伯数字表示hCG注射后天数)，每组用7只动物，取黄体组织观察萎缩情况，取每只动物左右黄体组织分别称重，取平均值为一次测定结果，以评价黄体萎缩过程。
1.2 大鼠黄体细胞悬液的制备
将注射hCG后不同时期的动物处死，取黄体组织置于无Ca2+、Mg2+的Kreb-Ringer碳酸盐缓冲液(KRBG)中经修剪，称重，切碎后，置于含胶原酶(2.00U，Sigma)和DNA酶(3.00U，Sigma)溶液中消化黄体，并充入95% O2和5% CO2混合气体，置于37℃振荡温育1小时，吹打使之分散。尼龙网过滤，将滤液离心5分钟弃掉上清液，沉积细胞用含0.1%(W/V)牛血清白蛋白和25mM Herpes的KRBG液制成黄体细胞悬液，充分混匀后分装各个培养管，使最终浓度达2.0×106/ml。
, 百拇医药
1.3 大鼠黄体组织各时期黄体细胞中羟自由基的测定
采用HPLC方法测定不同时期黄体细胞羟自由基含量，具体方法如下：取1ml 2.0×106细胞/ml置于10ml试管内，向其中加入40μl 100μM 2.4-DHBA作为内标，同时加入50μl盐酸，10μl乙醚，在振荡器上充分混匀90秒钟，然后静止分层，将乙醚层转移到另一试管中，置于40℃水浴中，使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50μl 1N盐酸和32.5μl流动相(80% 0.03M pH3.6)，将试管壁上结晶状物彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后，取20μl进行HPLC分析。
2 结果
2.1 黄体组织发育过程研究
本实验沿用本实验室多年使用的未成年大鼠PMSG-hHG处理模型，研究其黄体发育情况，汇于表1。
, 百拇医药
表1 Weight of CL during regression (
±s, n=7) TimeD7
D9
D11
D13
D15
D17
Weight(mg)
63.1±7.8
, 百拇医药
64.7±6.4
59.5±8.2
31.2**±5.7
19.3**±7.1
14.2**±5.2
VsD7，**P<0.01
实验结果表明，在hCG注射后第13天，黄体组织体积减小，重量减轻，发生明显的萎缩性变化。
2.2 黄体各时期黄体细胞内羟自由基测定结果
本实验以水杨酸作为捕捉剂，以HPLC检测法测定水杨酸与羟自由基反应后形成的羟化产物：二羟苯甲酸(dihydroxybenzoic acid, DHBA)。和其它羟自由基捕捉剂(如芳香化苯酸、DMPO等)相比，水杨酸在低浓度时细胞毒性小，产物稳定，有利于灵敏检测羟自由基的含量，是一个较为理想的实验方法。实验结果见表2。
, http://www.100md.com
表2 DHBA content in CL during regression (
±s, n=7) TimeD7
D9
D11
D13
D15
D17
DHBA(nM)
0.423±0.081
, 百拇医药
0.488±0.074
0.518±0.117
0.627**±0.098
0.479*±0.121
0.591*±0.108
VsD7 *P<0.05 **P<0.01
实验结果显示，在D7～D11，黄体细胞中羟自由基含量基本稳定，在D13开始比较活跃，持续在一个较高的水平，说明在黄体萎缩期间黄体细胞中羟自由基反应比较活跃。
3 讨论
本实验以雌性未成年Wistar大鼠为实验材料，用PMSG处理可刺激卵泡发育，诱发内源性FSH和LH峰，后二者引起排卵，此时再注射hCG，可造成超排卵，形成更多的黄体，D7时发现此时卵巢组织几乎全部由黄体组成，此时黄体细胞体积大，核圆，细胞丰满，黄体组织体积大，血管丰富，通过对黄体组织重量测定发现，D13时重量减轻，体积缩小，发生了明显的萎缩，通过观察时间的延长，发现萎缩过程持续存在，本实验与以往的报道相一致[3]，黄体形成，萎缩过程及体内激素的变化都与雌性成年大鼠的性周期变化相一致，便于研究。对黄体各时期黄体细胞羟自由基的研究显示：黄体组织在D7～D11时羟自由基含量较低，稳定在(0.423±0.081)nM至(0.518±0.117)nM这样一个低水平，D13开始黄体组织羟自由基反应活跃，上升至(0.627±0.098)nM，此后一个阶段(D13～D17)持续在一个较高的水平，此时期正是黄体萎缩期，说明在黄体萎缩期间黄体细胞中羟自由基反应是比较活跃的。在正常的情况下细胞中自由基的产生与消除处于动态平衡状态，使细胞维持正常的功能，自由基反应活跃，超过细胞自身清除能力时，会形成积累，可对生物大分子的严重损伤，影响细胞的重量功能。以往研究显示，细胞凋亡参与了黄体组织萎缩过程[4]，而羟自由基可能是影响细胞凋亡与否的重要因素，在凋亡初期，由于染色质位于核小体间的组蛋白成分是自由基攻击的主要目标，DNA断裂成50～100kb的大片段的过程与羟自由基作用有关[5]。本实验结果显示，在黄体期间黄体细胞羟自由基反应活跃，这在一定程度上为这一论点提供了依据。
, http://www.100md.com
综上所述，本实验通过对黄体不同时期黄体细胞中羟自由基的测定，发现在黄体萎缩期黄体细胞的羟自由基反应活跃，从而在一定方面揭示了黄体萎缩时黄体细胞生物学性状的改变，为进一步研究黄体萎缩机制提供了线索，许多问题仍有待于进一步研究。
参考文献
1.Mc Cormack. JT. Apoptosis during spontaneous luteolysis in the cyclic golden hamster: biochemical and morphological evidence. Biol Reprod. 1998;58:255
2.Young, FM. Cell death during luteal regression in the marmoset monkey. J Peprod Fertil.1997;111:109
, http://www.100md.com
3.Sakamaki K. Involvement of Fas antigen in ovarian follicular atresia and luteolysis. Mol-Reprod-Dev. 1997;47:11
4.王蓬勃.大鼠黄体退化与细胞凋亡及酪氨酸的影响.中国医学科学院科学年会论文集,1996,P141,北京医科大学中国协和医科大学联合出版社出版
5.Robert A. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death. Endocrine Reviews. 1993;14:133
(1998-09-18收稿), http://www.100md.com