Tb-NT-P-BSA抗原在结核病血清诊断的初步评价
作者：侯伟 吴勤学 郁华 尹跃平 张津平 蔡秀玲
单位：尹跃平 侯 伟 吴勤学 张津平 蔡秀玲 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(南京，210042)；郁 华 甘肃省地方病研究所
关键词：Tb-NT-P-BSA抗原；血清诊断；结核
中国人兽共患病杂志990115 摘 要 用人工合成的结核杆菌酚糖酯三糖抗原Tb-NT-P-BSA作抗原，用ELISA法检测了40例结核患者、52个健康对照的血清标本。结果表明：本方法的特异性、敏感性分别是：在检测抗Tb-NT-P-BSA IgG抗体时为94.2%和20%；在检测抗Tb-NT-P-BSA IgM抗体时为79.6%和45%。该抗原的特异性、敏感性似不理想，有待于进一步改进。
EVALUATION OF Tb-NT-P-BSA ANTIGEN IN THE
, 百拇医药
SERODIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS
Hou Wei Wu Qinxue Yu Hua Yin Yiaoping Zhang Zinping Cai Xiuling
(Institute of Dermatology,CAMS and PUMC,Nanjing 210042)
ABSTRACT Sera from 40 tuberculous patients and 52 healthy controls were assayed by ELISA using Tb-NT-P-BSA(containing the terminal triglycosyl unit of the M.tuberculosis phenolic glycolipid)as antigen.The sensitivity and specificity were 94.2%,20% for IgG and 79.6%,45% for IgM antibody activity resperctively.The results show that the antigen is not sensitive.That will limit its use in the serodiagnosis of tuberculosis.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Tb-NT-P-BSA Serodiagnosis Tuberculosis
继麻风杆菌酚糖酯抗原在麻风病血清诊断中广泛应用之后，1987年又发现了结核杆菌的酚糖酯抗原〔1〕。依据两种疾病同属分支杆菌病这一前提，也将其用于结核病的血清诊断。80年代末、90年代初合成了结核杆菌酚糖酯人工抗原，即将结核杆菌酚糖酯抗原中所具有的独特的三糖结构通过结合臂连接于牛血清蛋白(BSA)上，以下简称Tb-NT-P-BSA。该抗原的合成成功，为抗原的来源提供了保障，且具有水溶性、价格低廉等优点。但其在临床上的应用价值，学者们尚未达成共识。现将笔者对该抗原的初步评价结果报道如下：
1 材料和方法
1.1 抗原Tb-NT-P-BSA由日本奈良大学Fujiwara教授提供。
1.2 血清标本 痰菌阳性(涂片)结核患者血清标本(40份)和正常人血清标本(52份)均由甘肃省地方病研究所提供。血清标本小量分装，-20℃保存。
, 百拇医药
1.3 ELISA 抗原浓度、血清稀释度、酶结合物浓度均按棋盘滴定法确定。抗原包被浓度0.5μg/ml，包被缓冲液为醋酸氨-碳酸氨缓冲液(pH 8.2)，每孔加100μl，37℃蒸干过夜，用PBS泡板20min，然后洗3次，加含5%去脂奶粉(SM)的PBS(5%SM-PBS,pH 7.2)200μl/孔，37℃封闭2h，用PBS洗3次，加受检血清(用2.5% SM-PBS 稀释1∶200)100μl/孔，37℃90min(测IgG)或2h(测IgM),用BPS洗3次，加1∶2000HRP标记的羊抗人IgM和IgG(Cappel公司产品)100μl/孔，37℃ 2h，用PBS洗3次，加底物(0.003%H2O2-0.04%OPD液)100μl/孔，37℃ 30min,用1.25mol/L(2.5N)H2SO4 50μl/孔终止反应，490nm处读OD值，两孔平均值作终结果记录，每板设阳性、阴性、空白对照。用空白对照校零点。
表1结核患者、正常对照的ELISA检测结果
, 百拇医药
Table 1 ELISA results(
±s) in tuberculous patients and normal controls
n
IgG
IgM
Tb
40
0.213±0.21
0.494±0.45
N
52
, 百拇医药
0.124±0.12
0.330±0.32
Tb=tuberculous patients N=normal control
2 结果与讨论
结核杆菌酚糖酯抗原是1987年Daffe等从结核杆菌Canetti株中首先发现的，其结构为2、3、4-三-0-甲基-α-L-吡喃岩藻糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-2-0-甲基-α-L-吡喃鼠李糖→(酚结核菌醇分支菌蜡酸)，其中三糖部分为其独特的结构。早期的研究表明〔2，3〕，它在结核病的血清诊断中是有价值。为解决其来源问题、使方法更具推广潜力，合成了其人工抗原。本实验初步评价的结果：该抗原的特异性、敏感性分别是在检测抗Tb-NT-P-BSA IgG抗体时为94.2%和20%(Cutoff值0.3)；在检测抗Tb-NT-P-BSA IgM抗体时为79.6%和45%(Cutoff值0.4)。该抗原的敏感性较低可能与所感染的结核杆菌表型有关，如Daffe等〔4〕在分离的11株结核杆菌中，只发现1株含有三糖基的糖酯。结核杆菌中这种三糖基糖酯的不稳定分布可能会影响患病人群中相应抗体的水平。本实验结果表明检测IgG优于IgM，但该抗原的特异性、敏感性、特别是后者不理想，有待于进一步改进。按我们的经验，在麻风人工合成抗原中，独特的三糖以NT-O-的形式与BSA联接的特异性比以NT-P-形式联接的为高，可以借鉴这方面的经验；其次，IgM与IgG类抗体同时检测则能在保持特异性的基础上较大幅度提高敏感性。从而大大提高现有方法的实用价值。
, 百拇医药
表2 不同Cutoff值时的特异性、敏感性
Table 2 Sensitivity and specificity of ELISA over a range of cutoff points Cutoff point
△490
Specificity
Sensitivity
IgG
IgM
IgG
IgM
0.15
, 百拇医药
67.3%
55.0%
0.2
32.6%
34.7%
37.5%
67.5%
0.3
94.2%
59.2%
20.0%
52.5%
0.4
, 百拇医药
79.6%
45.0%
3 参考文献
1.Daffe M,Lacave C,Laneelle MA,et al.Structure of the major triglycosyl phenolpthiocerol of mycobacterium tuberculosis(strdin canetti).Eur J Biochem,1987,167:155
2.Torgal-Garcia J,David HL,Papa F.Preliminary evaluation of a mycobacterium tuberculosis phenolglycolipid antigen in the serologic diagnosis of tuberculosis.Ann Inst Pasteur Microbiol,1988,139:289.
, 百拇医药
3.Martin Casabona N,Gonzalez Fuente T,Arcalis Arce L,et al.Evaluation of a Phenolglycolipid antigen(PGL-Tb1) from M.tuberculosis in the serodiagnosis of tuberculosis:comparison with PPD antigen.Acta Leprol,1989,7(suppl.1):89.
4.Daffe M,Cho SN,Chatterjee D,et al.Chemical synthesis and seroreactivity of a neoantigen containing the oligosaccharide hapten of the mycobacterium tuberculosis-specific phenolic glycolipid.J Infet Dis,1991,163:161
1997年11月5日收稿, 百拇医药
单位：尹跃平 侯 伟 吴勤学 张津平 蔡秀玲 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(南京，210042)；郁 华 甘肃省地方病研究所
关键词：Tb-NT-P-BSA抗原；血清诊断；结核
中国人兽共患病杂志990115 摘 要 用人工合成的结核杆菌酚糖酯三糖抗原Tb-NT-P-BSA作抗原，用ELISA法检测了40例结核患者、52个健康对照的血清标本。结果表明：本方法的特异性、敏感性分别是：在检测抗Tb-NT-P-BSA IgG抗体时为94.2%和20%；在检测抗Tb-NT-P-BSA IgM抗体时为79.6%和45%。该抗原的特异性、敏感性似不理想，有待于进一步改进。
EVALUATION OF Tb-NT-P-BSA ANTIGEN IN THE
, 百拇医药
SERODIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS
Hou Wei Wu Qinxue Yu Hua Yin Yiaoping Zhang Zinping Cai Xiuling
(Institute of Dermatology,CAMS and PUMC,Nanjing 210042)
ABSTRACT Sera from 40 tuberculous patients and 52 healthy controls were assayed by ELISA using Tb-NT-P-BSA(containing the terminal triglycosyl unit of the M.tuberculosis phenolic glycolipid)as antigen.The sensitivity and specificity were 94.2%,20% for IgG and 79.6%,45% for IgM antibody activity resperctively.The results show that the antigen is not sensitive.That will limit its use in the serodiagnosis of tuberculosis.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Tb-NT-P-BSA Serodiagnosis Tuberculosis
继麻风杆菌酚糖酯抗原在麻风病血清诊断中广泛应用之后，1987年又发现了结核杆菌的酚糖酯抗原〔1〕。依据两种疾病同属分支杆菌病这一前提，也将其用于结核病的血清诊断。80年代末、90年代初合成了结核杆菌酚糖酯人工抗原，即将结核杆菌酚糖酯抗原中所具有的独特的三糖结构通过结合臂连接于牛血清蛋白(BSA)上，以下简称Tb-NT-P-BSA。该抗原的合成成功，为抗原的来源提供了保障，且具有水溶性、价格低廉等优点。但其在临床上的应用价值，学者们尚未达成共识。现将笔者对该抗原的初步评价结果报道如下：
1 材料和方法
1.1 抗原Tb-NT-P-BSA由日本奈良大学Fujiwara教授提供。
1.2 血清标本 痰菌阳性(涂片)结核患者血清标本(40份)和正常人血清标本(52份)均由甘肃省地方病研究所提供。血清标本小量分装，-20℃保存。
, 百拇医药
1.3 ELISA 抗原浓度、血清稀释度、酶结合物浓度均按棋盘滴定法确定。抗原包被浓度0.5μg/ml，包被缓冲液为醋酸氨-碳酸氨缓冲液(pH 8.2)，每孔加100μl，37℃蒸干过夜，用PBS泡板20min，然后洗3次，加含5%去脂奶粉(SM)的PBS(5%SM-PBS,pH 7.2)200μl/孔，37℃封闭2h，用PBS洗3次，加受检血清(用2.5% SM-PBS 稀释1∶200)100μl/孔，37℃90min(测IgG)或2h(测IgM),用BPS洗3次，加1∶2000HRP标记的羊抗人IgM和IgG(Cappel公司产品)100μl/孔，37℃ 2h，用PBS洗3次，加底物(0.003%H2O2-0.04%OPD液)100μl/孔，37℃ 30min,用1.25mol/L(2.5N)H2SO4 50μl/孔终止反应，490nm处读OD值，两孔平均值作终结果记录，每板设阳性、阴性、空白对照。用空白对照校零点。
表1结核患者、正常对照的ELISA检测结果
, 百拇医药
Table 1 ELISA results(
±s) in tuberculous patients and normal controlsn
IgG
IgM
Tb
40
0.213±0.21
0.494±0.45
N
52
, 百拇医药
0.124±0.12
0.330±0.32
Tb=tuberculous patients N=normal control
2 结果与讨论
结核杆菌酚糖酯抗原是1987年Daffe等从结核杆菌Canetti株中首先发现的，其结构为2、3、4-三-0-甲基-α-L-吡喃岩藻糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→3)-2-0-甲基-α-L-吡喃鼠李糖→(酚结核菌醇分支菌蜡酸)，其中三糖部分为其独特的结构。早期的研究表明〔2，3〕，它在结核病的血清诊断中是有价值。为解决其来源问题、使方法更具推广潜力，合成了其人工抗原。本实验初步评价的结果：该抗原的特异性、敏感性分别是在检测抗Tb-NT-P-BSA IgG抗体时为94.2%和20%(Cutoff值0.3)；在检测抗Tb-NT-P-BSA IgM抗体时为79.6%和45%(Cutoff值0.4)。该抗原的敏感性较低可能与所感染的结核杆菌表型有关，如Daffe等〔4〕在分离的11株结核杆菌中，只发现1株含有三糖基的糖酯。结核杆菌中这种三糖基糖酯的不稳定分布可能会影响患病人群中相应抗体的水平。本实验结果表明检测IgG优于IgM，但该抗原的特异性、敏感性、特别是后者不理想，有待于进一步改进。按我们的经验，在麻风人工合成抗原中，独特的三糖以NT-O-的形式与BSA联接的特异性比以NT-P-形式联接的为高，可以借鉴这方面的经验；其次，IgM与IgG类抗体同时检测则能在保持特异性的基础上较大幅度提高敏感性。从而大大提高现有方法的实用价值。
, 百拇医药
表2 不同Cutoff值时的特异性、敏感性
Table 2 Sensitivity and specificity of ELISA over a range of cutoff points Cutoff point
△490
Specificity
Sensitivity
IgG
IgM
IgG
IgM
0.15
, 百拇医药
67.3%
55.0%
0.2
32.6%
34.7%
37.5%
67.5%
0.3
94.2%
59.2%
20.0%
52.5%
0.4
, 百拇医药
79.6%
45.0%
3 参考文献
1.Daffe M,Lacave C,Laneelle MA,et al.Structure of the major triglycosyl phenolpthiocerol of mycobacterium tuberculosis(strdin canetti).Eur J Biochem,1987,167:155
2.Torgal-Garcia J,David HL,Papa F.Preliminary evaluation of a mycobacterium tuberculosis phenolglycolipid antigen in the serologic diagnosis of tuberculosis.Ann Inst Pasteur Microbiol,1988,139:289.
, 百拇医药
3.Martin Casabona N,Gonzalez Fuente T,Arcalis Arce L,et al.Evaluation of a Phenolglycolipid antigen(PGL-Tb1) from M.tuberculosis in the serodiagnosis of tuberculosis:comparison with PPD antigen.Acta Leprol,1989,7(suppl.1):89.
4.Daffe M,Cho SN,Chatterjee D,et al.Chemical synthesis and seroreactivity of a neoantigen containing the oligosaccharide hapten of the mycobacterium tuberculosis-specific phenolic glycolipid.J Infet Dis,1991,163:161
1997年11月5日收稿, 百拇医药