对Cofiler体系在亲子鉴定中应用价值的研究
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法医学杂志 2000年第4期第16卷 论著
作者：李莉 程大霖 柳燕 何根兰 林源 阙庭志 严品华 赵珍敏
单位：司法部司法鉴定科学技术研究所，上海200063
关键词：ProfilerPlus；Cofiler；STR；亲子鉴定
法医学杂志000409
[摘要]将商品化ProfilerPlus和Cofiler扩增检测试剂盒用于亲子鉴定案例和无关个体血样的分析。186例亲子鉴定案中，母-子-假设父三联体149例，假设父-子二联体37例。在149例含双亲和孩子的鉴定中，有127例认定存在亲生血缘关系，其RCP值平均为99.98%；其余22例排除了被检父为孩子生父，排除机率为14.77%，排除指标平均为6.1个。在37例含单亲及孩子的鉴定中，有23例认定存在亲生血缘关系，其RCP值平均为99.92%；其余14例排除被检父为孩子生父，排除机率为37.84%，平均有5个不吻合的STR位点出现。若特意省去三人组合案例中的母亲，将其作为单亲案件进行统计，仅检测ProfilerPlus体系的9个STR位点时，则RCP值平均为99.1959%，案例中21.51%将不能得出明确的结论。同时检测ProfilerPlus和Cofiler体系共13个STR位点，则案例中97.31%能排除或认定生父，案例中2.69%通过补充母亲样本能排除或认定生父。Cofiler体系中6个STR位点的累积排除率达0.9825。上述数据表明，Cofiler试剂盒在单亲鉴定案件中有着重要的应用价值。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.2[文献标识码]A[文章编号]1004-5619(2000)04-0214-02
Usefulness of Cofiler PCR Amplification Kit in Parentage Testing
Li Li
(Institute of Forensic Sciences, Ministry of Justice, Shanghai,200063)
Parentage testing was performed by using multiple PCR and automated genescan and genotype analysis. Parentage was excluded in 36 cases,including 22 of 149 paternity trios and 14 of 37 paternity duos. In the 22 trios and 14 duos in which paternity was excluded, a mean of 6.1 and 5 incompatible STR markers were noted. The application value of six loci which included in the Cofiler amplification kit was showed here. The discrimination power ranged from 0.8023 for TPOX to 0.9203 for D16S539. The cumulative power of exclusion was provided as 0.9825. Three mutation were found (one each at D3S1358,TPOX,CSF1PO). For most nonexcluded paternity duos, only when the Cofiler amplification kit was used in conjunction with Profiler Plus kit, the RCP value was acceptable. The data showed that the Cofiler kit could play an important role in cases of paternity duos.
, 百拇医药
Key words: parentage testing,STR,Cofiler,Profiler Plus
人类基因组中约有50万个短串联重复序列位点(STR)，其核心序列一般为2～5bp，片段长度为100～500bp，由于分布广泛、扩增片段短小，且近一半STR位点具有遗传多态性，现在，通过PCR检测STR位点基因型的技术已逐渐取代传统的法医血清学技术，成为法医物证学鉴定的主要方法。
1997年以来，Profiler Plus、Cofiler扩增检测试剂盒在全世界倍受关注，其中Profiler Plus和Cofiler已被美国联邦调查局(FBI)用于生物学检材的检验和罪犯DNA数据库的建立[1-3]。在我国，目前迫切需要建立一套法医学检测标准和规程。1999年，通过“中国罪犯数据库”模式库的建立，已证明Profiler Plus和Cofiler试剂盒中的13个STR位点适合作为中国人群的遗传学标志，用于我国法医物证学鉴定[4]。从个体识别能力考虑，仅检测Profiler Plus试剂盒中的Amelogenin和9个STR位点已可进行个体识别，因为其平均偶合率为10-11[2]，但在实际检案、尤其是单亲血缘关系鉴定中，Cofiler试剂盒还是有其作用的，本文对此作如下报道。
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1 材料与方法
1.1 分析对象
为本所收检的186个亲子鉴定案例和2500名无关个体的血样。186例亲子鉴定案中，母-子-假设父三人组合案例(Paternity Trios)149例，假设父-子二人组合案例(Paternity Duos)37例。
1.2 分析方法
对所有样本，均用Chelex法[5]提取血样DNA，采用商品化Profiler Plus和Cofiler扩增试剂盒(PE)通过复合PCR反应检验STR位点。Profiler Plus体系含有9个STR位点；Cofiler体系中含有与Profiler Plus体系相同的D3S1358、D7S820位点，另有D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO等4个STR位点。PCR反应总体积约为12.5μl，其中含反应液5μl，金牌Taq酶0.25μl，引物溶液2.5μl，模板DNA溶液5μl。按下述条件进行PCR反应(9600扩增仪)：95℃11min；94℃1min，59℃1min，72℃1min，循环28次；最后于60℃延伸45min。扩增结束后，将去离子甲酰胺、GeneScan[ROX]-500和PCR产物按比例混匀(24μl：1μl：1.5μl),于95℃变性3min,随即冰浴3min；在310型遗传分析仪上进行毛细管电泳，用收集软件(Collection)记录电泳信息，然后分别用基因扫描软件(GeseScan3.1)分析DNA片段长度，用基因型分析软件(Genotyper2.1)确定各位点基因型。
, 百拇医药
引用中国人群数据[4]，计算各案例亲子关系指数(PI)和亲子关系概率(RCP)值，以RCP作为研判依据：若RCP≥99.73%，则认定存在亲生血缘关系；若RCP=0、且出现2个以上不匹配的基因座时，则排除存在亲生血缘关系的可能性。
无关个体的基因型检测结果用于位点的统计学分析：利用Fisher、Bostein、Nei所报道的计算方法[6]，计算Cofiler体系中6个STR位点的等位基因杂合度(H)、个体识别能力(DP)、非父排除率(PE)、累积排除率(CCE)和多态性信息量(PIC)。
2 结果
2.1 亲子鉴定结果
通过对Profiler Plus和Cofiler体系13个STR位点进行基因型检测，共完成186例亲子鉴定，其中149例为母-子-假设父三人组合，37例为子-假设父两人组合。
, 百拇医药
在149例含双亲和孩子的鉴定中，有127例认定存在亲生血缘关系，其RCP值为99.8719%～99.9999%，平均值为99.98%；其余22例排除了被检父为孩子生父，排除机率为14.77%，排除指标(位点数)共有3～11个，平均为6.1个。在37例含单亲及孩子的鉴定中，有23例认定存在亲生血缘关系，其RCP值介于99.7864%与99.9993%之间，平均值为99.92%；其余14例排除被检父为孩子生父，排除机率为37.84%，有3～9个(平均为5个)不吻合的STR位点出现。
2.2 Cofiler体系在亲子鉴定中的作用
对149例母-子-假设父三人组合的亲子鉴定结果进行分析，发现147例(98.66%)仅分析Profiler Plus体系的9个STR位点就可排除或认定孩子生父；但有2例(1.34%)在Profiler Plus体系的9个STR位点中仅单一位点不合，后来在Cofiler中发现另有1个以上的位点不吻合才得出了排除的结论。
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若特意省去三人组合案例中的母亲，将其作为单亲案件进行统计，仅检测Profiler Plus体系的9个STR位点时，则RCP值介于98.0574%与99.9924%之间，平均值为99.1959%，案例中21.51%(40/186)将不能得出明确的结论。同时检测Profiler Plus和Cofiler体系共13个STR位点，则案例中97.31%(181/186)能排除或认定生父，案例中2.69%(5/186)通过补充母亲样本能排除或认定生父。
2.3 Cofiler体系中6个STR位点的排除比例
对D3S1358、D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO、D7S820等6个STR位点在186例案件中排除亲子关系的次数及百分比进行统计，结果见表1。
表1 Cofiler体系排除亲子关系的百分比(n=36)
, http://www.100md.com 位点名称
排除次数(%)
D3S1358
14(38.89%)
D16S539
19(52.78%)
THO1
3(8.33%)
TPOX
6(16.67%)
CSF1PO
14(38.89%)
, http://www.100md.com
D7S820
16(44.44%)
2.4 统计学分析结果
经对2500名无关个体的基因型进行检测，统计分析Cofiler体系中6个STR位点的H、DP、PE和PIC，结果见表2。
表2 Cofiler体系STR位点的统计学分析结果
Loci
H
DP
PE
PIC
D3S1358
, http://www.100md.com
0.7247
0.8772
0.4816
0.6764
D16S539
0.7856
0.9203
0.5781
0.7520
THO1
0.6559
0.8332
, 百拇医药 0.4197
0.6091
TPOX
0.6293
0.8023
0.3702
0.5687
CSF1PO
0.7346
0.8846
0.4988
0.6899
D7S820
, http://www.100md.com
0.7717
0.9139
0.5626
0.7376
累积排除率(CCE)=0.9825
2.5 位点突变率
通过对186例亲子鉴定案件进行13个STR位点的检验，发现共有3例存在单一位点(分别为D3S1358、TPOX、CSF1PO)不合的现象，经加做D2S1338、D19S433、PM等DNA位点检测，发现父母与孩子的基因符合孟德尔遗传定律，故推测Cofiler体系的D3S1358、TPOX和CSF1PO位点有一定的基因突变率(5.38‰)。
3 讨论
, 百拇医药
近年来，社会上对亲子鉴定的要求日益增多，案例中一般包括母-子-假设父三人，若仅检测Profiler Plus中9个STR位点，在排除亲生血缘关系的案例中，平均排除指标为4个(增加Cofiler体系的检测，则可使平均排除指标增至6.1个)；不排除亲生血缘关系者其PI和RCP值会很高，PI通常高达数万倍甚至亿倍，RCP值常高达99.99%。这表明，对三人组合的亲子鉴定案例，用Profiler Plus进行9个STR位点的检测通常可得到认定或排除的结论。
随着亲子鉴定案例的增多，一些特殊的案件也日益多见，其中最常见的就是单亲鉴定。通过Profiler Plus中9个STR位点的检验，排除亲子关系的案例中，平均约有2个基因座不合，而在不排除亲子关系的案例中，引用中国人群的基因频率数据计算PI和RCP值，会发现分析时存在困扰，因为其平均RCP值为99.1959%%，低于认定标准(99.73%)。如果增加Cofiler中STR位点的检测，可发现排除了亲子关系的单亲案例中平均约有5个基因座排除出现，而不排除亲子关系的单亲案例中，平均RCP值能达到99.92%，从而能认定亲生血缘关系的存在。
, 百拇医药
统计学分析结果表明，Cofiler体系STR位点的H值为0.6293～0.7856，DP值为0.8023～0.9203，PE值为0.3702～0.5781，PIC值为0.5687～0.7520。6个STR位点中，D16S539的个体识别能力和非父排除率最高。6个STR位点的累积排除率可达0.9825。
综上所述，对母-子-假设父3人组合进行亲子鉴定时，一般可以仅分析检验Profiler Plus中9个STR位点；而在假设母-子或假设父-子2人组合的单亲鉴定中，宜同时选用Profiler Plus和Cofiler体系的13个STR位点进行检测。Cofiler试剂盒在亲子鉴定案件、尤其在单亲案件鉴定中有着重要的应用价值。
国家计委立项课题(国家计委、财政部[1998]计高技2444号)
参 考 文 献 ：
[1] Werrett DJ.The national DNA database[J]. Forensic Sci Int 1997;88(4):33- 422.
, 百拇医药
[2] Russ Hoyle. The FBI's national DNA database[J]. Nature Biotechnology.1998,16:987
[3] Hammond H,Jin L,zhong Y,et al.Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification application J.Am J Hum.Genet,1994,55:175- 189.
[4]杜志淳，李莉，林源，等.“中国罪犯DNA数据库”模式库-13个STR位点基因在中国人群中的分布[J].法医学杂志，2000，16(1)：1-5.
[5] Walsh PS,et al. Chelex- 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR- based typing from forensic material[J].Bio Techniques, 1991,10:506- 513.
[6]阙庭志，李莉，林源，等.用多重PCR及荧光检测技术分析CTT位点的多态性[J].法医学杂志，1999，15(3)：144-146.
(收 稿 日 期 ： 2000- 06- 22), http://www.100md.com
单位：司法部司法鉴定科学技术研究所，上海200063
关键词：ProfilerPlus；Cofiler；STR；亲子鉴定
法医学杂志000409
[摘要]将商品化ProfilerPlus和Cofiler扩增检测试剂盒用于亲子鉴定案例和无关个体血样的分析。186例亲子鉴定案中，母-子-假设父三联体149例，假设父-子二联体37例。在149例含双亲和孩子的鉴定中，有127例认定存在亲生血缘关系，其RCP值平均为99.98%；其余22例排除了被检父为孩子生父，排除机率为14.77%，排除指标平均为6.1个。在37例含单亲及孩子的鉴定中，有23例认定存在亲生血缘关系，其RCP值平均为99.92%；其余14例排除被检父为孩子生父，排除机率为37.84%，平均有5个不吻合的STR位点出现。若特意省去三人组合案例中的母亲，将其作为单亲案件进行统计，仅检测ProfilerPlus体系的9个STR位点时，则RCP值平均为99.1959%，案例中21.51%将不能得出明确的结论。同时检测ProfilerPlus和Cofiler体系共13个STR位点，则案例中97.31%能排除或认定生父，案例中2.69%通过补充母亲样本能排除或认定生父。Cofiler体系中6个STR位点的累积排除率达0.9825。上述数据表明，Cofiler试剂盒在单亲鉴定案件中有着重要的应用价值。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.2[文献标识码]A[文章编号]1004-5619(2000)04-0214-02
Usefulness of Cofiler PCR Amplification Kit in Parentage Testing
Li Li
(Institute of Forensic Sciences, Ministry of Justice, Shanghai,200063)
Parentage testing was performed by using multiple PCR and automated genescan and genotype analysis. Parentage was excluded in 36 cases,including 22 of 149 paternity trios and 14 of 37 paternity duos. In the 22 trios and 14 duos in which paternity was excluded, a mean of 6.1 and 5 incompatible STR markers were noted. The application value of six loci which included in the Cofiler amplification kit was showed here. The discrimination power ranged from 0.8023 for TPOX to 0.9203 for D16S539. The cumulative power of exclusion was provided as 0.9825. Three mutation were found (one each at D3S1358,TPOX,CSF1PO). For most nonexcluded paternity duos, only when the Cofiler amplification kit was used in conjunction with Profiler Plus kit, the RCP value was acceptable. The data showed that the Cofiler kit could play an important role in cases of paternity duos.
, 百拇医药
Key words: parentage testing,STR,Cofiler,Profiler Plus
人类基因组中约有50万个短串联重复序列位点(STR)，其核心序列一般为2～5bp，片段长度为100～500bp，由于分布广泛、扩增片段短小，且近一半STR位点具有遗传多态性，现在，通过PCR检测STR位点基因型的技术已逐渐取代传统的法医血清学技术，成为法医物证学鉴定的主要方法。
1997年以来，Profiler Plus、Cofiler扩增检测试剂盒在全世界倍受关注，其中Profiler Plus和Cofiler已被美国联邦调查局(FBI)用于生物学检材的检验和罪犯DNA数据库的建立[1-3]。在我国，目前迫切需要建立一套法医学检测标准和规程。1999年，通过“中国罪犯数据库”模式库的建立，已证明Profiler Plus和Cofiler试剂盒中的13个STR位点适合作为中国人群的遗传学标志，用于我国法医物证学鉴定[4]。从个体识别能力考虑，仅检测Profiler Plus试剂盒中的Amelogenin和9个STR位点已可进行个体识别，因为其平均偶合率为10-11[2]，但在实际检案、尤其是单亲血缘关系鉴定中，Cofiler试剂盒还是有其作用的，本文对此作如下报道。
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1 材料与方法
1.1 分析对象
为本所收检的186个亲子鉴定案例和2500名无关个体的血样。186例亲子鉴定案中，母-子-假设父三人组合案例(Paternity Trios)149例，假设父-子二人组合案例(Paternity Duos)37例。
1.2 分析方法
对所有样本，均用Chelex法[5]提取血样DNA，采用商品化Profiler Plus和Cofiler扩增试剂盒(PE)通过复合PCR反应检验STR位点。Profiler Plus体系含有9个STR位点；Cofiler体系中含有与Profiler Plus体系相同的D3S1358、D7S820位点，另有D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO等4个STR位点。PCR反应总体积约为12.5μl，其中含反应液5μl，金牌Taq酶0.25μl，引物溶液2.5μl，模板DNA溶液5μl。按下述条件进行PCR反应(9600扩增仪)：95℃11min；94℃1min，59℃1min，72℃1min，循环28次；最后于60℃延伸45min。扩增结束后，将去离子甲酰胺、GeneScan[ROX]-500和PCR产物按比例混匀(24μl：1μl：1.5μl),于95℃变性3min,随即冰浴3min；在310型遗传分析仪上进行毛细管电泳，用收集软件(Collection)记录电泳信息，然后分别用基因扫描软件(GeseScan3.1)分析DNA片段长度，用基因型分析软件(Genotyper2.1)确定各位点基因型。
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引用中国人群数据[4]，计算各案例亲子关系指数(PI)和亲子关系概率(RCP)值，以RCP作为研判依据：若RCP≥99.73%，则认定存在亲生血缘关系；若RCP=0、且出现2个以上不匹配的基因座时，则排除存在亲生血缘关系的可能性。
无关个体的基因型检测结果用于位点的统计学分析：利用Fisher、Bostein、Nei所报道的计算方法[6]，计算Cofiler体系中6个STR位点的等位基因杂合度(H)、个体识别能力(DP)、非父排除率(PE)、累积排除率(CCE)和多态性信息量(PIC)。
2 结果
2.1 亲子鉴定结果
通过对Profiler Plus和Cofiler体系13个STR位点进行基因型检测，共完成186例亲子鉴定，其中149例为母-子-假设父三人组合，37例为子-假设父两人组合。
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在149例含双亲和孩子的鉴定中，有127例认定存在亲生血缘关系，其RCP值为99.8719%～99.9999%，平均值为99.98%；其余22例排除了被检父为孩子生父，排除机率为14.77%，排除指标(位点数)共有3～11个，平均为6.1个。在37例含单亲及孩子的鉴定中，有23例认定存在亲生血缘关系，其RCP值介于99.7864%与99.9993%之间，平均值为99.92%；其余14例排除被检父为孩子生父，排除机率为37.84%，有3～9个(平均为5个)不吻合的STR位点出现。
2.2 Cofiler体系在亲子鉴定中的作用
对149例母-子-假设父三人组合的亲子鉴定结果进行分析，发现147例(98.66%)仅分析Profiler Plus体系的9个STR位点就可排除或认定孩子生父；但有2例(1.34%)在Profiler Plus体系的9个STR位点中仅单一位点不合，后来在Cofiler中发现另有1个以上的位点不吻合才得出了排除的结论。
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若特意省去三人组合案例中的母亲，将其作为单亲案件进行统计，仅检测Profiler Plus体系的9个STR位点时，则RCP值介于98.0574%与99.9924%之间，平均值为99.1959%，案例中21.51%(40/186)将不能得出明确的结论。同时检测Profiler Plus和Cofiler体系共13个STR位点，则案例中97.31%(181/186)能排除或认定生父，案例中2.69%(5/186)通过补充母亲样本能排除或认定生父。
2.3 Cofiler体系中6个STR位点的排除比例
对D3S1358、D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO、D7S820等6个STR位点在186例案件中排除亲子关系的次数及百分比进行统计，结果见表1。
表1 Cofiler体系排除亲子关系的百分比(n=36)
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排除次数(%)
D3S1358
14(38.89%)
D16S539
19(52.78%)
THO1
3(8.33%)
TPOX
6(16.67%)
CSF1PO
14(38.89%)
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D7S820
16(44.44%)
2.4 统计学分析结果
经对2500名无关个体的基因型进行检测，统计分析Cofiler体系中6个STR位点的H、DP、PE和PIC，结果见表2。
表2 Cofiler体系STR位点的统计学分析结果
Loci
H
DP
PE
PIC
D3S1358
, http://www.100md.com
0.7247
0.8772
0.4816
0.6764
D16S539
0.7856
0.9203
0.5781
0.7520
THO1
0.6559
0.8332
, 百拇医药 0.4197
0.6091
TPOX
0.6293
0.8023
0.3702
0.5687
CSF1PO
0.7346
0.8846
0.4988
0.6899
D7S820
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0.7717
0.9139
0.5626
0.7376
累积排除率(CCE)=0.9825
2.5 位点突变率
通过对186例亲子鉴定案件进行13个STR位点的检验，发现共有3例存在单一位点(分别为D3S1358、TPOX、CSF1PO)不合的现象，经加做D2S1338、D19S433、PM等DNA位点检测，发现父母与孩子的基因符合孟德尔遗传定律，故推测Cofiler体系的D3S1358、TPOX和CSF1PO位点有一定的基因突变率(5.38‰)。
3 讨论
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近年来，社会上对亲子鉴定的要求日益增多，案例中一般包括母-子-假设父三人，若仅检测Profiler Plus中9个STR位点，在排除亲生血缘关系的案例中，平均排除指标为4个(增加Cofiler体系的检测，则可使平均排除指标增至6.1个)；不排除亲生血缘关系者其PI和RCP值会很高，PI通常高达数万倍甚至亿倍，RCP值常高达99.99%。这表明，对三人组合的亲子鉴定案例，用Profiler Plus进行9个STR位点的检测通常可得到认定或排除的结论。
随着亲子鉴定案例的增多，一些特殊的案件也日益多见，其中最常见的就是单亲鉴定。通过Profiler Plus中9个STR位点的检验，排除亲子关系的案例中，平均约有2个基因座不合，而在不排除亲子关系的案例中，引用中国人群的基因频率数据计算PI和RCP值，会发现分析时存在困扰，因为其平均RCP值为99.1959%%，低于认定标准(99.73%)。如果增加Cofiler中STR位点的检测，可发现排除了亲子关系的单亲案例中平均约有5个基因座排除出现，而不排除亲子关系的单亲案例中，平均RCP值能达到99.92%，从而能认定亲生血缘关系的存在。
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统计学分析结果表明，Cofiler体系STR位点的H值为0.6293～0.7856，DP值为0.8023～0.9203，PE值为0.3702～0.5781，PIC值为0.5687～0.7520。6个STR位点中，D16S539的个体识别能力和非父排除率最高。6个STR位点的累积排除率可达0.9825。
综上所述，对母-子-假设父3人组合进行亲子鉴定时，一般可以仅分析检验Profiler Plus中9个STR位点；而在假设母-子或假设父-子2人组合的单亲鉴定中，宜同时选用Profiler Plus和Cofiler体系的13个STR位点进行检测。Cofiler试剂盒在亲子鉴定案件、尤其在单亲案件鉴定中有着重要的应用价值。
国家计委立项课题(国家计委、财政部[1998]计高技2444号)
参 考 文 献 ：
[1] Werrett DJ.The national DNA database[J]. Forensic Sci Int 1997;88(4):33- 422.
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[2] Russ Hoyle. The FBI's national DNA database[J]. Nature Biotechnology.1998,16:987
[3] Hammond H,Jin L,zhong Y,et al.Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification application J.Am J Hum.Genet,1994,55:175- 189.
[4]杜志淳，李莉，林源，等.“中国罪犯DNA数据库”模式库-13个STR位点基因在中国人群中的分布[J].法医学杂志，2000，16(1)：1-5.
[5] Walsh PS,et al. Chelex- 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR- based typing from forensic material[J].Bio Techniques, 1991,10:506- 513.
[6]阙庭志，李莉，林源，等.用多重PCR及荧光检测技术分析CTT位点的多态性[J].法医学杂志，1999，15(3)：144-146.
(收 稿 日 期 ： 2000- 06- 22), http://www.100md.com