EB病毒与复发性阿弗它溃疡的关系
作者：朱越广 赵华婷 李玛
单位：(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔科 510120)
关键词：复发性阿弗它溃疡；聚合酶链反应；EB病毒
广东医学000512 【摘要】 目的 探讨EB病毒与复发性阿弗它溃疡(RAU)的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术检测RAU患者的溃疡期粘膜损害、间歇期愈合粘膜标本各80例的EBV-DAN，并以60例健康口腔粘膜作对照。结果 EBV-DNA的阳性检出率分别是：RAU组溃疡期粘膜损害为39%(31/80)，明显高于对照组正常粘膜的8%(5/60)(P<0.05)；间歇期愈合粘膜为11%(9/80)，低于溃疡期粘膜损害(P<0.05)，但与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 EBV存在于RAU患者溃疡期粘膜损害内，可能与RAU损害形成有关。
A study on the association between Epstein-Barr virus and recurrent aphthous ulcer
, 百拇医药
Zhu Yueguang Zhao Huating Li Ma
(Department of Stomatology,Sun Yat-sen Memoral Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510120)
【Abstract】 Objective To investigate the association between Epstein-Barr virus(EBV) and recurrent aphthous ulcer(RAU). Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect EBV-DNA in 80 specimens obtained from oral lesions of patients with RAU during ulcerative period,and in 80 specimens of healed mucosa from patients with RAU during remission period.Sixty specimens of normal mucosa from healthy control subjects were also included. Results EBV-DNA was found in 39%(31/80) of the oral lesions specimens, significantly higher than the healthy controls (P<0.05). EBV-DNA was also found in 11%(9/80) of the healed mucosa specimens, significantly lower than the oral lesions(P<0.05), but close to that of the healthy control(P>0.05).Conclusion EB viruses are present in oral lesions of RAU and may be associated with ulcerative formation.
, http://www.100md.com
【Key words】 Recurrent aphthous ulcer Epstein-Barr virus Polymerase chain reaction
复发性阿弗它溃疡(recurrent aphthous ulcer ,RAU),病因复杂，其中病毒因素一直被疑为诱因之一。有研究报道在RAU损害粘膜内检出单纯疱疹病毒DNA[1]和巨细胞病毒DNA[2]，而EB病毒( Epstein-Barr virus ,EBV)与RAU是否也存在关系？为此我们应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测RAU患者溃疡期粘膜损害、间歇期的愈合粘膜是否存在EBV-DNA，以探讨EBV与RAU发病的关系。
1 资料与方法
1.1 病例选择 RAU患者均为本院口腔科粘膜病专科门诊确诊的病例，平均至少每月复发1次，近半年未使用任何免疫制剂，除RAU损害外，未见其他粘膜损害。RAU组80例，男38例，女42例；年龄18～60岁，平均36.5岁。其中轻型50例，重型20例，口炎型10例；对照组60例为阻生牙拔除术患者，其中男18例，女12例；年龄21～32岁，平均26岁，身体健康，无RAU史，口腔粘膜未见异常。
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1.2 标本采集 对每一RAU患者采集标本2次：第1次在RAU溃疡期刮取溃疡表层组织，将所采集的组织置入离心管内；第2次在RAU间歇期(损害愈合以后)对原部位粘膜作切取活检，取材置入离心管。对照者的粘膜标本取自阻生牙术区。
1.3 PCR操作
1.3.1 主要试剂 EBV-DNA PCR检测试剂盒，由中山医科大学达安基因诊断中心提供。
1.3.2 标本处理(DAN提取) 溃疡刮取物或粘膜切取片加入生理盐水1 ml，15 000 r/min离心5 min，弃尽上清，加入40 μl裂解液，搅匀后100℃沸水浴5 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液2 μl作PCR反应。
1.3.3 扩增反应
1.3.3.1 标本DNA扩增 取出PCR反应管(EB-mx)，加入标本DNA提取液2 μl,混匀后离心数秒即在PCR仪上扩增。步骤如下：93℃变性45 s→55℃退火45 s→72℃延伸60 s，共做35个循环，最后置72℃ 300 s。
, 百拇医药
1.3.3.2 阳性对照DNA扩增 取PCR反应管加入2 μl阳性模板，操作步骤同上。
1.4 PCR扩增结果观察 在PCR扩增后的反应管内加入4 μl电泳指示剂(溴酚蓝)，充分混匀后取扩增物10 μl下层蓝色液体加样，经2%的琼脂糖凝胶上电泳20～30 min(5 V/cm)后紫外线检测仪上观察。EBV-DNA阳性对照位于154 bp处的一条亮黄色条带，标本DNA扩增后若与阳性对照处于同一位置则为EBV阳性。
2 结果
2.1 RAU组与对照组EBV-DNA阳性检出率比较 RAU组溃疡期粘膜损害标本EBV-DNA的阳性检出率与对照组经χ2检验，差异有显著性(P<0.05);间歇期原损害部位的愈合粘膜标本EBV-DNA阳性检出率与溃疡期的粘膜损害标本，差异有显著性(P<0.05),而与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 PCR检测RAU组与对照组粘膜标本EBV-DNA结果 分组
例数
阳性例数
阳性率(%)
RAU组
Msu★
80
31
39*▲
Msp★★
80
9
, 百拇医药
11△
对照组
60
5
8
★为RAU溃疡期粘膜病标本， ★★为RAU间歇期粘膜病标本；与对照组比较， * P<0.05， △P>0.05;与Msp组比较， ▲P<0.05
2.2 EBV-DNA阳性检出率与各RAU临床类型的关系 各临床类型(口炎型、轻型及重型)的EBV-DNA阳性率与对照组，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.05)，但各临床类型之间则差异无显著性(P>0.05)，见表2。
表2 3种RAU类型的EBV-DNA检测阳性情况☆ 临床类型
, 百拇医药
受检例数
EBV-DNA阳性例数
阳性率(%)
轻型
50
19
38
重型
20
8
40
口炎型
10
, 百拇医药
4
40
☆ 受检标本指Msu(见表1) 3 讨论
3.1 复发性阿弗它溃疡(RAU)粘膜损害内的EBV-DNA 本研究RAU组溃疡期粘膜损害EBV-DNA阳性检出率为39%,对照组正常粘膜为8%,两组差异有显著性。而且RAU的轻型、重型和口炎型的EBV-DNA阳性检出率，与对照组差异均有显著性，提示EBV与RAU有关。Sun 等[3]应用原位PCR检测到RAU损害粘膜上皮细胞核内有EBV-DNA，这个结果更直接支持EBV与RAU损害的密切相关的观点。
3.2 EBV与上皮细胞免疫损伤 EBV属疱疹病毒，在上皮细胞内复制，因其表达病毒蛋白而被T淋巴细胞识别，引起免疫介导的上皮细胞破坏[4]。但EBV在上皮细胞复制受其与B细胞之间的相互作用的影响。EBV在B细胞内潜伏感染。大多数被潜伏感染B细胞，因EBV病毒基因组仅表达少数基因而使B细胞处在稳定状态。若EBV病毒基因组在B细胞内完全表达，则这些B细胞被杀死。Sun等[3]报道，应用PCR检测复发性阿弗它溃疡患者，损害粘膜EBV-DNA阳性者其外周血中B细胞的EBV-DNA也阳性。表明RAU与在B细胞潜伏感染的EBV有关。
, 百拇医药
3.3 EBV感染与RAU发病特点 已有研究发现，RAU在溃疡期损害区粘膜组织有T细胞浸润 。 因此认为，RAU损害形成的病理过程是免疫介导的粘膜上皮破坏。而EBV在上皮细胞的存在可能是引发RAU损害形成的因素。EBV感染上皮细胞因其表达病毒蛋白而引发免疫介导的上皮细胞破坏[4]。因此，EBV可能参与RAU溃疡损害的形成。RAU发病的特点是间歇性、自愈性、复发性。可能，在各种因素(如各种压力，疲劳等)的刺激下，机体的免疫力下降，在B细胞内潜伏感染的EBV基因组被活化，引致上皮细胞感染EBV，上皮细胞被破坏，溃疡形成。由于机体的免疫力呈不定期波动变化，EBV感染上皮细胞可能也相应呈间歇性、反复性。
参考文献
1，Studd, McCance DJ, Lehner T.Detection of HSV DAN in patients with Behcet's syndrom and in patients with recurrent oral ulcers by the polymerase chain reaction.J Med Microbiol,1991,34:39
, 百拇医药
2，向晓阳，李辉奉，杨占秋，等. 复发性阿弗它溃疡患者脱落细胞中人巨细胞病毒的检测及意义.临床口腔医学杂志，1997,13(2):67
3，Sun A,Chang JG,Ch CT,et al. Preliminary evidence for an association of Epstein-Barr virus with pre-ulcerative oral lesions in patients with recurrent aphthous ulcers or Behcet`s disease.Journal of Oral Pathology & Medicine,1998,27(4):168
4，Rouse BT.Pathogenesis of the herpesviruses.Laboratory Animal Science, 1993, 43(1)：1
收稿日期： 2000-01-11, http://www.100md.com
单位：(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔科 510120)
关键词：复发性阿弗它溃疡；聚合酶链反应；EB病毒
广东医学000512 【摘要】 目的 探讨EB病毒与复发性阿弗它溃疡(RAU)的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)技术检测RAU患者的溃疡期粘膜损害、间歇期愈合粘膜标本各80例的EBV-DAN，并以60例健康口腔粘膜作对照。结果 EBV-DNA的阳性检出率分别是：RAU组溃疡期粘膜损害为39%(31/80)，明显高于对照组正常粘膜的8%(5/60)(P<0.05)；间歇期愈合粘膜为11%(9/80)，低于溃疡期粘膜损害(P<0.05)，但与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论 EBV存在于RAU患者溃疡期粘膜损害内，可能与RAU损害形成有关。
A study on the association between Epstein-Barr virus and recurrent aphthous ulcer
, 百拇医药
Zhu Yueguang Zhao Huating Li Ma
(Department of Stomatology,Sun Yat-sen Memoral Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou,510120)
【Abstract】 Objective To investigate the association between Epstein-Barr virus(EBV) and recurrent aphthous ulcer(RAU). Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect EBV-DNA in 80 specimens obtained from oral lesions of patients with RAU during ulcerative period,and in 80 specimens of healed mucosa from patients with RAU during remission period.Sixty specimens of normal mucosa from healthy control subjects were also included. Results EBV-DNA was found in 39%(31/80) of the oral lesions specimens, significantly higher than the healthy controls (P<0.05). EBV-DNA was also found in 11%(9/80) of the healed mucosa specimens, significantly lower than the oral lesions(P<0.05), but close to that of the healthy control(P>0.05).Conclusion EB viruses are present in oral lesions of RAU and may be associated with ulcerative formation.
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【Key words】 Recurrent aphthous ulcer Epstein-Barr virus Polymerase chain reaction
复发性阿弗它溃疡(recurrent aphthous ulcer ,RAU),病因复杂，其中病毒因素一直被疑为诱因之一。有研究报道在RAU损害粘膜内检出单纯疱疹病毒DNA[1]和巨细胞病毒DNA[2]，而EB病毒( Epstein-Barr virus ,EBV)与RAU是否也存在关系？为此我们应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测RAU患者溃疡期粘膜损害、间歇期的愈合粘膜是否存在EBV-DNA，以探讨EBV与RAU发病的关系。
1 资料与方法
1.1 病例选择 RAU患者均为本院口腔科粘膜病专科门诊确诊的病例，平均至少每月复发1次，近半年未使用任何免疫制剂，除RAU损害外，未见其他粘膜损害。RAU组80例，男38例，女42例；年龄18～60岁，平均36.5岁。其中轻型50例，重型20例，口炎型10例；对照组60例为阻生牙拔除术患者，其中男18例，女12例；年龄21～32岁，平均26岁，身体健康，无RAU史，口腔粘膜未见异常。
, http://www.100md.com
1.2 标本采集 对每一RAU患者采集标本2次：第1次在RAU溃疡期刮取溃疡表层组织，将所采集的组织置入离心管内；第2次在RAU间歇期(损害愈合以后)对原部位粘膜作切取活检，取材置入离心管。对照者的粘膜标本取自阻生牙术区。
1.3 PCR操作
1.3.1 主要试剂 EBV-DNA PCR检测试剂盒，由中山医科大学达安基因诊断中心提供。
1.3.2 标本处理(DAN提取) 溃疡刮取物或粘膜切取片加入生理盐水1 ml，15 000 r/min离心5 min，弃尽上清，加入40 μl裂解液，搅匀后100℃沸水浴5 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液2 μl作PCR反应。
1.3.3 扩增反应
1.3.3.1 标本DNA扩增 取出PCR反应管(EB-mx)，加入标本DNA提取液2 μl,混匀后离心数秒即在PCR仪上扩增。步骤如下：93℃变性45 s→55℃退火45 s→72℃延伸60 s，共做35个循环，最后置72℃ 300 s。
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1.3.3.2 阳性对照DNA扩增 取PCR反应管加入2 μl阳性模板，操作步骤同上。
1.4 PCR扩增结果观察 在PCR扩增后的反应管内加入4 μl电泳指示剂(溴酚蓝)，充分混匀后取扩增物10 μl下层蓝色液体加样，经2%的琼脂糖凝胶上电泳20～30 min(5 V/cm)后紫外线检测仪上观察。EBV-DNA阳性对照位于154 bp处的一条亮黄色条带，标本DNA扩增后若与阳性对照处于同一位置则为EBV阳性。
2 结果
2.1 RAU组与对照组EBV-DNA阳性检出率比较 RAU组溃疡期粘膜损害标本EBV-DNA的阳性检出率与对照组经χ2检验，差异有显著性(P<0.05);间歇期原损害部位的愈合粘膜标本EBV-DNA阳性检出率与溃疡期的粘膜损害标本，差异有显著性(P<0.05),而与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见表1。
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表1 PCR检测RAU组与对照组粘膜标本EBV-DNA结果 分组
例数
阳性例数
阳性率(%)
RAU组
Msu★
80
31
39*▲
Msp★★
80
9
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11△
对照组
60
5
8
★为RAU溃疡期粘膜病标本， ★★为RAU间歇期粘膜病标本；与对照组比较， * P<0.05， △P>0.05;与Msp组比较， ▲P<0.05
2.2 EBV-DNA阳性检出率与各RAU临床类型的关系 各临床类型(口炎型、轻型及重型)的EBV-DNA阳性率与对照组，经χ2检验，差异均有显著性(P<0.05)，但各临床类型之间则差异无显著性(P>0.05)，见表2。
表2 3种RAU类型的EBV-DNA检测阳性情况☆ 临床类型
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受检例数
EBV-DNA阳性例数
阳性率(%)
轻型
50
19
38
重型
20
8
40
口炎型
10
, 百拇医药
4
40
☆ 受检标本指Msu(见表1) 3 讨论
3.1 复发性阿弗它溃疡(RAU)粘膜损害内的EBV-DNA 本研究RAU组溃疡期粘膜损害EBV-DNA阳性检出率为39%,对照组正常粘膜为8%,两组差异有显著性。而且RAU的轻型、重型和口炎型的EBV-DNA阳性检出率，与对照组差异均有显著性，提示EBV与RAU有关。Sun 等[3]应用原位PCR检测到RAU损害粘膜上皮细胞核内有EBV-DNA，这个结果更直接支持EBV与RAU损害的密切相关的观点。
3.2 EBV与上皮细胞免疫损伤 EBV属疱疹病毒，在上皮细胞内复制，因其表达病毒蛋白而被T淋巴细胞识别，引起免疫介导的上皮细胞破坏[4]。但EBV在上皮细胞复制受其与B细胞之间的相互作用的影响。EBV在B细胞内潜伏感染。大多数被潜伏感染B细胞，因EBV病毒基因组仅表达少数基因而使B细胞处在稳定状态。若EBV病毒基因组在B细胞内完全表达，则这些B细胞被杀死。Sun等[3]报道，应用PCR检测复发性阿弗它溃疡患者，损害粘膜EBV-DNA阳性者其外周血中B细胞的EBV-DNA也阳性。表明RAU与在B细胞潜伏感染的EBV有关。
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3.3 EBV感染与RAU发病特点 已有研究发现，RAU在溃疡期损害区粘膜组织有T细胞浸润 。 因此认为，RAU损害形成的病理过程是免疫介导的粘膜上皮破坏。而EBV在上皮细胞的存在可能是引发RAU损害形成的因素。EBV感染上皮细胞因其表达病毒蛋白而引发免疫介导的上皮细胞破坏[4]。因此，EBV可能参与RAU溃疡损害的形成。RAU发病的特点是间歇性、自愈性、复发性。可能，在各种因素(如各种压力，疲劳等)的刺激下，机体的免疫力下降，在B细胞内潜伏感染的EBV基因组被活化，引致上皮细胞感染EBV，上皮细胞被破坏，溃疡形成。由于机体的免疫力呈不定期波动变化，EBV感染上皮细胞可能也相应呈间歇性、反复性。
参考文献
1，Studd, McCance DJ, Lehner T.Detection of HSV DAN in patients with Behcet's syndrom and in patients with recurrent oral ulcers by the polymerase chain reaction.J Med Microbiol,1991,34:39
, 百拇医药
2，向晓阳，李辉奉，杨占秋，等. 复发性阿弗它溃疡患者脱落细胞中人巨细胞病毒的检测及意义.临床口腔医学杂志，1997,13(2):67
3，Sun A,Chang JG,Ch CT,et al. Preliminary evidence for an association of Epstein-Barr virus with pre-ulcerative oral lesions in patients with recurrent aphthous ulcers or Behcet`s disease.Journal of Oral Pathology & Medicine,1998,27(4):168
4，Rouse BT.Pathogenesis of the herpesviruses.Laboratory Animal Science, 1993, 43(1)：1
收稿日期： 2000-01-11, http://www.100md.com