7-硝基吲唑对大鼠局灶脑缺血急性期部分微观病理的初探
作者：刘艳 王书香
单位：刘艳(北京同仁医院神经内科 100730)；王书香(河南省郑州市第二人民医院内科)
关键词：脑缺血；7-硝基吲唑；嗜银Ⅲ染色
脑与神经疾病杂志000505
摘 要 目的：研究7-硝基吲唑(7-NI)对大鼠局灶脑缺血急性期微观病理改变。方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，观察对照组和治疗组某些指标的变化。结果 7-硝基吲唑可减少缺血脑组织变性及坏死神经细胞。结论 从微观病理角度证实7-硝基吲唑对大鼠局灶脑缺血有保护作用。
Investigation of effects in micropathology of 7-nitroindazole during the early focal cerebral ischemia in rats
, 百拇医药
Liu Yan,Wang Shuxiang
(Department of Neurology,Tong ren Hospitac,Beijing 100730)
Abstract Objective To study the change during the early focal cerebral ischemia in micropathology of rats by 7-NI.Method The rat models of middle cerebral artery(MCA) focal cerebral ischemia were established with the suture method in the study in order to investigate parameter in trate group compared to control group.Results This study showed that 7-NI decreased the degenerated and necrotic neron.Conclusion The results implied that 7-NI had protective effects during the early focal cerebral ischemia in micropathology.
, 百拇医药
近年来，一氧化氮(NO)在急性脑缺血中作用日益受到人们关注。不同的一氧化氮合酶(NOS)诱导生成一氧化氮作用不同。其中，神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在急性期主要起神经毒损害。7-NI为nNOS选择性抑制剂，可逆转nNOS在脑缺血急性期的神经毒损害，从而保护脑组织。
材 料 与 方 法
一、 主要仪器与试剂
1.MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统及SE166镜头：同济医科大学清平影像医学公司。
2.7-NI溶于花生油(peanut oil)(花生油体积/大鼠体重=10ml/kg)。7-NI与花生油购自美国Sigma公司。
3.TTC(四氮唑红)：美国Sigma公司。
, 百拇医药 二、 实验方法
1.动物选择：选用纯系健康Wistar大鼠(首都医科大学动物部提供)，雌性，体重220～250g,随机分为组。
2.模型制备：大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)
参考Longa等[1]建立的方法，稍加改动。采用线栓法闭塞大鼠左侧大脑中动脉，制成永久性局部缺血模型。动物苏醒后表现为①提尾时右前肢内收屈曲，②爬行时向右侧划圈； ③站立时向右侧倾倒。
3.动物分组和处理：本实验设二组，缺血对照组(对照组)，缺血治疗组(7-NI组)。7-NI组应用7-NI花生油溶液； 对照组应用等容量的花生油。两组均为缺血后5分钟腹腔内给药。
4.关于粉红带测定：
①四氮唑红(TTC)染色：用于脑梗塞体积测定。大鼠缺血3，6小时后迅速断头取脑。自前极向后每2mm切片，共切6～7张。将脑片悬置于1%TTC生理盐水中，37℃避光孵育30分钟。线粒体过氧化氢酶可氧化TTC，使存活组织呈深红色，坏死组织呈苍白色。(梗塞体积测定具体数值我们将另行报道)
, 百拇医药
②关于粉红带测定：实验中观察到TTC染色的脑片在正常区和坏死区组织间(即深红和苍白染色之间)有一过渡的粉红带。该带是否梗死外周半暗带? 为进一步探讨，我们应用一种特殊染色方法-嗜银Ⅲ染色法。大鼠制成MCAO 3小时模型，TTC染色后，以粉红带为中心，两边分别取少量苍白和深红区，制成病理切片。
5.嗜银Ⅲ染色[2～5]：用于脑梗死外周区组织观察
①灌注固定[3]：大鼠麻醉后，通过左心室以100cmH2O压力首先灌入灌注液Ⅰ(将5.9gCaCl2*2H2O，9.0gNaCl,1.0g二甲胂酸钠溶于1000ml蒸馏水，pH=7.5)灌1分钟，然后注入500ml灌注液Ⅱ(将5.9gCaCl2*2H2O，3.6gNaCl，100ml的20%多聚甲醛溶液，100ml的25%戊二醛溶液，1.0g二甲胂酸钠溶于800ml蒸馏水，pH=7.5)，前100ml以最快速度注入，后400ml在一小时内注入。断头取脑浸于固定液Ⅱ中1周(室温)。
, 百拇医药
②石蜡切片制作：经灌注固定后的脑标本依次经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成石蜡标本。观察冠状丘脑中1/3平面。该平面可看到海马前上部分。当切片至下丘脑腹内侧核和背内侧核排成X形，丘脑与纹状体即将断开的层面时，开始留取切片。片厚5um，每100um留取一张。
③嗜银Ⅲ染色法：
(1)石蜡切片依次于二甲苯中更换3次，正丙醇中更换两次，每种试剂各5分钟。
(2)切片浸泡在100ml正丙醇溶液中(其中含4ml蒸馏水，0.8ml浓硫酸)，56℃烘干16小时。
(3)切片于50%，25%正丙醇下行加水，蒸馏水冲洗两次。
(4)置于8%醋酸中10分钟。
(5)切片置于硅钨酸显影剂中直至切片背地变黄色。(显影剂在使用2～3分钟前将显影剂B倒入A中。B包括2.0gAgNO3,2.0gNH4NO3,20g硅钨酸。A为100g NA2CO3溶于1000ml蒸馏水中。)
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(6)HE复染，以显示其他区域细胞，和半暗带区形成鲜明对比，利于观察。
(7)在1%醋酸中洗30分钟，正丙醇脱水，二甲苯冲洗，中性树脂封片。
6.尼氏染色(焦油固紫染色)：用于观察缺血区神经细胞变化。切片依次经二甲苯脱蜡，酒精下行加水，尼氏染色液染色，酒精上行脱水，特殊分色液分色，二甲苯冲洗，最后封片。
7.图象分析仪计数梗死周围区域变性神经元数量。
CA1区：以齿状回开口连线与CA1区交点为为起点，沿CA1区向内依次计数三个视野(×20倍)变性及正常神经细胞，求得各自总和。以变性细胞/CA1全部细胞及正常细胞/CA1全部细胞作为统计参数。
CA4区：计数全部CA4区变性及正常神经细胞，方法同上。
, 百拇医药
8.统计分析：采用systa软件包完成t-检验(配对t-检验)，单因素方差分析。
结 果
一、 CA1及CA4区缺血梗死外周区变性及正常神经元计数：
表1 CA1区正常及变性细胞数(%，
±s，n=6) 组别
变性细胞
正常细胞
对照组
30.77±1.92
38.46±4.8
, 百拇医药 7-NI组
20.18±2.75**
59.63±6.42**
表2 CA4区正常及变性细胞数(%，±s，n=6) 组别
变性细胞
正常细胞
对照组
31.48±4.32
37.03±3.08
7-NI组
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9.15±1.96**
81.69±7.18**
缺血3小时7-NI组梗死灶外周区变性神经元数量明显少于对照组(P<0.01)，而7-NI组正常神经元细胞数明显多于对照组(P<0.01)。
二、 病理学
1.嗜银Ⅲ染色：镜下观察梗死外周区变性细胞(“dark”)胞体及其相连树突染成黑色，轴突不着色。如果大鼠灌注固定不充分，脑标本尚残留毛细血管红细胞亦会深染。有此现象者去除不用。“dark”细胞胞体呈椭圆形，树突呈不明显的螺旋状交织成网。HE复染后，正常神经元呈淡紫色。黑色“dark”细胞夹杂在淡紫色正常细胞之间形成鲜明对比。“dark”细胞并非如想象的集中于某一区域(即半暗带区)，而是散在的，在某些区域密度较大。
, 百拇医药
值得一提的是，在非缺血侧亦有少量神经元深染，可能在正常脑组织的正常代谢过程中也存在早期变性神经元。
2.尼氏染色：
镜下观察尼氏染色最具特征的为三区分布：正常细胞区、 正常细胞和坏死细胞混杂区和坏死区。混杂区多是正常细胞靠头侧，坏死细胞靠足侧。但并非每个切片均有此三区特征。共观察60张切片，其中36张为特征性三区分布； 22张两端为正常区，中间为混杂区； 还有2张无规律。
3.TTC染色粉红带制成石蜡切片后进行嗜银Ⅲ染色，在有效显影时间内未有细胞银染。HE复染后正常细胞仍为淡紫色。又将部分切片尼氏染色，无特殊发现。讨 论
一、 有关半暗带的讨论
半暗带为围绕在缺血中心坏死区之外，电生理活动已消失，却能维持自身离子平衡的区域，其为可逆性损伤的脑组织[6]。它的血流为20～40ml/100g/min。一般认为半暗带自缺血1小时后即出现。通常持续达24小时，在人脑可达48小时。用组织病理学方法不能直接确定半暗带。本实验虽观察到早期缺血变性细胞，但并非集中于某一区域，可能即为此原因。Memezawa等[7]研究大鼠MCAO 1小时再灌注模型发现再灌注拯救的对照组织与梗死区有很大重叠，主要位于与大脑前动脉供血区的交界处。
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二、 有关嗜银Ⅲ染色法
1.该方法是针对半暗带早期缺血细胞的较特异银染方法，用于厚度5～200um的冰冻及石蜡切片。它适用于脑缺血等多种疾病[8～10]。Czurko[4]等观察了缺血1小时及再灌注几分钟至3天的大鼠，于缺血侧大脑纹状体，额顶皮层，丘脑核，杏仁核及海马均发现银染的“dark”细胞。Nagasawa[11]等观察到MCAO 3小时模型中不仅 缺血侧尾状核等有早期缺血改变，而且非缺血侧亦有象征缺血改变的“dark”细胞。这和本实验是完全相符的。而且Czurko[4]等观察到在缺血3小时内嗜银Ⅲ染色效果最好，随着缺血延长其灵敏性下降，这也是我们选择缺血3小时进行银染的原因。
2.机理：Gallyas[5]等从细胞内部构架的机械能代谢，传递等角度阐述了“dark”细胞银染的机理，但只是假说而已。综合以前的研究以及我们的实验结果，可以这样认为：嗜银Ⅲ染色与其说是对半暗带细胞的特异染色法不如说是对所有脑区域早期可逆性变性细胞的染色方法。
, 百拇医药
3.TTC染色中粉红带制成的石蜡切片，未能在有效显影时间内着色。因为如果标本中心为大部分银染缺血细胞，两边为淡紫色正常细胞及坏死细胞，很大程度上提示此粉红带即半暗带所在。原因可能为：①TTC需脑细胞尚存活时和线粒体酶反应才可显色，而嗜银Ⅲ法在染色前需做长时间的灌注固定，且固定液有严格的配方要求。故二者不能兼得。②TTC可能影响嗜银Ⅲ染色的某个步骤进行。
虽然银染未能成功，但我们做焦油固紫染色时发现镜下的三区分布给我们提出了同样的问题。我们高度怀疑中间粉红区域为半暗带，有待以后课题实验进一步证实。
三、 TTC染色法
用神经病理学方法评价脑损伤总是会应用TTC组化染色。在正常脑组织，线粒体氧化酶氧化TTC成红色产物，使脑实质红染。缺血延长使线粒体酶功能障碍，不能氧化TTC，导致脑呈苍白色。
四.有关海马CA1及CA4区：有报道[12]CA4区为急性缺血细胞改变区域，本实验观察到缺血3小时大鼠CA4区出现神经元变性及坏死即证明了此点。治疗组CA4区变性及坏死细胞均少于缺血组，而正常细胞多于缺血组，说明7-NI可逆转变性细胞，改善缺血损害。CA1区为迟发性神经元坏死区(DND)，但从所查文献来看，以缺血再灌流模型为主，本实验是永久缺血模型。据报道[12]，缺血20分钟谷氨酸升高20～100倍，激活AMPA受体通道开放，使细胞内能量和ATP耗竭，细胞外K+浓度增加导致细胞膜去极化，Na+在细胞内堆积，Cl-和H2O内流造成细胞水肿-急性神经元坏死。故我们认为CA1区如实验中观察到的结果一样，可有缺血早期神经元坏死。
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本实验提出了我们进一步探讨内容：TTC染色粉红带给我们今后研究提出一个新课题，该区可能为半暗带； 尼氏染色镜下发现特征性三区分布，其中的混杂区是否和大体标本中粉红带为同一性质，有待进一步研究证实。
参考文献
1，Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20∶84～91.
2，Gallyas F,Hsu M,Buzsaki G,et al.Delayed degeneration of the optic tract and neurons in the superior colliculus after forebrain ischemia.Neurosce Lett,1992,144∶177～179.
, 百拇医药
3，Gallyas F,et la.Golgi-like demonstration of "dark" neurons with an argyrophil method for experimental neuropathology.A cta Neuropathol,1990,79∶620～628
4，Czurlo A,et al."Collapsed"(argyrophilic,dark) neurons in rat model of transient focal cerebral ischemia.Neurosce Lett,1993,162∶71～74.
5，Gallyas F,Zoltay G,Dames W,et al.Formation of "dark" argyrophilic neurons of various origin proceeds with a common mechanism of biophysical nature(a novel hypothesis).Acta Neurophathol,1992,83∶504～509.
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6，刘士民，郭玉璞.脑缺血半暗带的研究进展.中华神经科杂志，1996，12(29)∶6.
7，Memezawa H,Minamisawa H,Smith ML,et al.Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat.Exp Brain Res,1992,89∶67.
8，Auer RN,Wieloch T,Olsson Y,et al.The distribution of hypoglycemic brain damage.Acta Neuropathos,1984,64∶177～191.
9，Kirino T,San K.selective vulnerability in the gerbil hippocampus following ischemia.Acta Neuropathos,1984,62∶20～208.
, 百拇医药
10，Atillo A,Soderfeldt B,et al.Pathogenesis of brain lesions caused by experimental Epilepsy.Light and election-microscopic changes in the rat hippocampus following bicucculline-induced status epileptics.Acta Neuropathol,1983,59∶11～24.
11，Nagasawa H.Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion.stroke,1989,20∶1037～1043.
12，Mitani A,Kubo H,Iga K,et al.A new enzymatic cycling technique for glutamate determination in brain microdialystates J Neurochem,1990,54∶709.
收稿日期：2000-04-11, http://www.100md.com
单位：刘艳(北京同仁医院神经内科 100730)；王书香(河南省郑州市第二人民医院内科)
关键词：脑缺血；7-硝基吲唑；嗜银Ⅲ染色
脑与神经疾病杂志000505
摘 要 目的：研究7-硝基吲唑(7-NI)对大鼠局灶脑缺血急性期微观病理改变。方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，观察对照组和治疗组某些指标的变化。结果 7-硝基吲唑可减少缺血脑组织变性及坏死神经细胞。结论 从微观病理角度证实7-硝基吲唑对大鼠局灶脑缺血有保护作用。
Investigation of effects in micropathology of 7-nitroindazole during the early focal cerebral ischemia in rats
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Liu Yan,Wang Shuxiang
(Department of Neurology,Tong ren Hospitac,Beijing 100730)
Abstract Objective To study the change during the early focal cerebral ischemia in micropathology of rats by 7-NI.Method The rat models of middle cerebral artery(MCA) focal cerebral ischemia were established with the suture method in the study in order to investigate parameter in trate group compared to control group.Results This study showed that 7-NI decreased the degenerated and necrotic neron.Conclusion The results implied that 7-NI had protective effects during the early focal cerebral ischemia in micropathology.
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近年来，一氧化氮(NO)在急性脑缺血中作用日益受到人们关注。不同的一氧化氮合酶(NOS)诱导生成一氧化氮作用不同。其中，神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在急性期主要起神经毒损害。7-NI为nNOS选择性抑制剂，可逆转nNOS在脑缺血急性期的神经毒损害，从而保护脑组织。
材 料 与 方 法
一、 主要仪器与试剂
1.MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统及SE166镜头：同济医科大学清平影像医学公司。
2.7-NI溶于花生油(peanut oil)(花生油体积/大鼠体重=10ml/kg)。7-NI与花生油购自美国Sigma公司。
3.TTC(四氮唑红)：美国Sigma公司。
, 百拇医药 二、 实验方法
1.动物选择：选用纯系健康Wistar大鼠(首都医科大学动物部提供)，雌性，体重220～250g,随机分为组。
2.模型制备：大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)
参考Longa等[1]建立的方法，稍加改动。采用线栓法闭塞大鼠左侧大脑中动脉，制成永久性局部缺血模型。动物苏醒后表现为①提尾时右前肢内收屈曲，②爬行时向右侧划圈； ③站立时向右侧倾倒。
3.动物分组和处理：本实验设二组，缺血对照组(对照组)，缺血治疗组(7-NI组)。7-NI组应用7-NI花生油溶液； 对照组应用等容量的花生油。两组均为缺血后5分钟腹腔内给药。
4.关于粉红带测定：
①四氮唑红(TTC)染色：用于脑梗塞体积测定。大鼠缺血3，6小时后迅速断头取脑。自前极向后每2mm切片，共切6～7张。将脑片悬置于1%TTC生理盐水中，37℃避光孵育30分钟。线粒体过氧化氢酶可氧化TTC，使存活组织呈深红色，坏死组织呈苍白色。(梗塞体积测定具体数值我们将另行报道)
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②关于粉红带测定：实验中观察到TTC染色的脑片在正常区和坏死区组织间(即深红和苍白染色之间)有一过渡的粉红带。该带是否梗死外周半暗带? 为进一步探讨，我们应用一种特殊染色方法-嗜银Ⅲ染色法。大鼠制成MCAO 3小时模型，TTC染色后，以粉红带为中心，两边分别取少量苍白和深红区，制成病理切片。
5.嗜银Ⅲ染色[2～5]：用于脑梗死外周区组织观察
①灌注固定[3]：大鼠麻醉后，通过左心室以100cmH2O压力首先灌入灌注液Ⅰ(将5.9gCaCl2*2H2O，9.0gNaCl,1.0g二甲胂酸钠溶于1000ml蒸馏水，pH=7.5)灌1分钟，然后注入500ml灌注液Ⅱ(将5.9gCaCl2*2H2O，3.6gNaCl，100ml的20%多聚甲醛溶液，100ml的25%戊二醛溶液，1.0g二甲胂酸钠溶于800ml蒸馏水，pH=7.5)，前100ml以最快速度注入，后400ml在一小时内注入。断头取脑浸于固定液Ⅱ中1周(室温)。
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②石蜡切片制作：经灌注固定后的脑标本依次经酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成石蜡标本。观察冠状丘脑中1/3平面。该平面可看到海马前上部分。当切片至下丘脑腹内侧核和背内侧核排成X形，丘脑与纹状体即将断开的层面时，开始留取切片。片厚5um，每100um留取一张。
③嗜银Ⅲ染色法：
(1)石蜡切片依次于二甲苯中更换3次，正丙醇中更换两次，每种试剂各5分钟。
(2)切片浸泡在100ml正丙醇溶液中(其中含4ml蒸馏水，0.8ml浓硫酸)，56℃烘干16小时。
(3)切片于50%，25%正丙醇下行加水，蒸馏水冲洗两次。
(4)置于8%醋酸中10分钟。
(5)切片置于硅钨酸显影剂中直至切片背地变黄色。(显影剂在使用2～3分钟前将显影剂B倒入A中。B包括2.0gAgNO3,2.0gNH4NO3,20g硅钨酸。A为100g NA2CO3溶于1000ml蒸馏水中。)
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(6)HE复染，以显示其他区域细胞，和半暗带区形成鲜明对比，利于观察。
(7)在1%醋酸中洗30分钟，正丙醇脱水，二甲苯冲洗，中性树脂封片。
6.尼氏染色(焦油固紫染色)：用于观察缺血区神经细胞变化。切片依次经二甲苯脱蜡，酒精下行加水，尼氏染色液染色，酒精上行脱水，特殊分色液分色，二甲苯冲洗，最后封片。
7.图象分析仪计数梗死周围区域变性神经元数量。
CA1区：以齿状回开口连线与CA1区交点为为起点，沿CA1区向内依次计数三个视野(×20倍)变性及正常神经细胞，求得各自总和。以变性细胞/CA1全部细胞及正常细胞/CA1全部细胞作为统计参数。
CA4区：计数全部CA4区变性及正常神经细胞，方法同上。
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8.统计分析：采用systa软件包完成t-检验(配对t-检验)，单因素方差分析。
结 果
一、 CA1及CA4区缺血梗死外周区变性及正常神经元计数：
表1 CA1区正常及变性细胞数(%，
±s，n=6) 组别变性细胞
正常细胞
对照组
30.77±1.92
38.46±4.8
, 百拇医药 7-NI组
20.18±2.75**
59.63±6.42**
表2 CA4区正常及变性细胞数(%，
±s，n=6) 组别变性细胞
正常细胞
对照组
31.48±4.32
37.03±3.08
7-NI组
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9.15±1.96**
81.69±7.18**
缺血3小时7-NI组梗死灶外周区变性神经元数量明显少于对照组(P<0.01)，而7-NI组正常神经元细胞数明显多于对照组(P<0.01)。
二、 病理学
1.嗜银Ⅲ染色：镜下观察梗死外周区变性细胞(“dark”)胞体及其相连树突染成黑色，轴突不着色。如果大鼠灌注固定不充分，脑标本尚残留毛细血管红细胞亦会深染。有此现象者去除不用。“dark”细胞胞体呈椭圆形，树突呈不明显的螺旋状交织成网。HE复染后，正常神经元呈淡紫色。黑色“dark”细胞夹杂在淡紫色正常细胞之间形成鲜明对比。“dark”细胞并非如想象的集中于某一区域(即半暗带区)，而是散在的，在某些区域密度较大。
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值得一提的是，在非缺血侧亦有少量神经元深染，可能在正常脑组织的正常代谢过程中也存在早期变性神经元。
2.尼氏染色：
镜下观察尼氏染色最具特征的为三区分布：正常细胞区、 正常细胞和坏死细胞混杂区和坏死区。混杂区多是正常细胞靠头侧，坏死细胞靠足侧。但并非每个切片均有此三区特征。共观察60张切片，其中36张为特征性三区分布； 22张两端为正常区，中间为混杂区； 还有2张无规律。
3.TTC染色粉红带制成石蜡切片后进行嗜银Ⅲ染色，在有效显影时间内未有细胞银染。HE复染后正常细胞仍为淡紫色。又将部分切片尼氏染色，无特殊发现。讨 论
一、 有关半暗带的讨论
半暗带为围绕在缺血中心坏死区之外，电生理活动已消失，却能维持自身离子平衡的区域，其为可逆性损伤的脑组织[6]。它的血流为20～40ml/100g/min。一般认为半暗带自缺血1小时后即出现。通常持续达24小时，在人脑可达48小时。用组织病理学方法不能直接确定半暗带。本实验虽观察到早期缺血变性细胞，但并非集中于某一区域，可能即为此原因。Memezawa等[7]研究大鼠MCAO 1小时再灌注模型发现再灌注拯救的对照组织与梗死区有很大重叠，主要位于与大脑前动脉供血区的交界处。
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二、 有关嗜银Ⅲ染色法
1.该方法是针对半暗带早期缺血细胞的较特异银染方法，用于厚度5～200um的冰冻及石蜡切片。它适用于脑缺血等多种疾病[8～10]。Czurko[4]等观察了缺血1小时及再灌注几分钟至3天的大鼠，于缺血侧大脑纹状体，额顶皮层，丘脑核，杏仁核及海马均发现银染的“dark”细胞。Nagasawa[11]等观察到MCAO 3小时模型中不仅 缺血侧尾状核等有早期缺血改变，而且非缺血侧亦有象征缺血改变的“dark”细胞。这和本实验是完全相符的。而且Czurko[4]等观察到在缺血3小时内嗜银Ⅲ染色效果最好，随着缺血延长其灵敏性下降，这也是我们选择缺血3小时进行银染的原因。
2.机理：Gallyas[5]等从细胞内部构架的机械能代谢，传递等角度阐述了“dark”细胞银染的机理，但只是假说而已。综合以前的研究以及我们的实验结果，可以这样认为：嗜银Ⅲ染色与其说是对半暗带细胞的特异染色法不如说是对所有脑区域早期可逆性变性细胞的染色方法。
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3.TTC染色中粉红带制成的石蜡切片，未能在有效显影时间内着色。因为如果标本中心为大部分银染缺血细胞，两边为淡紫色正常细胞及坏死细胞，很大程度上提示此粉红带即半暗带所在。原因可能为：①TTC需脑细胞尚存活时和线粒体酶反应才可显色，而嗜银Ⅲ法在染色前需做长时间的灌注固定，且固定液有严格的配方要求。故二者不能兼得。②TTC可能影响嗜银Ⅲ染色的某个步骤进行。
虽然银染未能成功，但我们做焦油固紫染色时发现镜下的三区分布给我们提出了同样的问题。我们高度怀疑中间粉红区域为半暗带，有待以后课题实验进一步证实。
三、 TTC染色法
用神经病理学方法评价脑损伤总是会应用TTC组化染色。在正常脑组织，线粒体氧化酶氧化TTC成红色产物，使脑实质红染。缺血延长使线粒体酶功能障碍，不能氧化TTC，导致脑呈苍白色。
四.有关海马CA1及CA4区：有报道[12]CA4区为急性缺血细胞改变区域，本实验观察到缺血3小时大鼠CA4区出现神经元变性及坏死即证明了此点。治疗组CA4区变性及坏死细胞均少于缺血组，而正常细胞多于缺血组，说明7-NI可逆转变性细胞，改善缺血损害。CA1区为迟发性神经元坏死区(DND)，但从所查文献来看，以缺血再灌流模型为主，本实验是永久缺血模型。据报道[12]，缺血20分钟谷氨酸升高20～100倍，激活AMPA受体通道开放，使细胞内能量和ATP耗竭，细胞外K+浓度增加导致细胞膜去极化，Na+在细胞内堆积，Cl-和H2O内流造成细胞水肿-急性神经元坏死。故我们认为CA1区如实验中观察到的结果一样，可有缺血早期神经元坏死。
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本实验提出了我们进一步探讨内容：TTC染色粉红带给我们今后研究提出一个新课题，该区可能为半暗带； 尼氏染色镜下发现特征性三区分布，其中的混杂区是否和大体标本中粉红带为同一性质，有待进一步研究证实。
参考文献
1，Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20∶84～91.
2，Gallyas F,Hsu M,Buzsaki G,et al.Delayed degeneration of the optic tract and neurons in the superior colliculus after forebrain ischemia.Neurosce Lett,1992,144∶177～179.
, 百拇医药
3，Gallyas F,et la.Golgi-like demonstration of "dark" neurons with an argyrophil method for experimental neuropathology.A cta Neuropathol,1990,79∶620～628
4，Czurlo A,et al."Collapsed"(argyrophilic,dark) neurons in rat model of transient focal cerebral ischemia.Neurosce Lett,1993,162∶71～74.
5，Gallyas F,Zoltay G,Dames W,et al.Formation of "dark" argyrophilic neurons of various origin proceeds with a common mechanism of biophysical nature(a novel hypothesis).Acta Neurophathol,1992,83∶504～509.
, http://www.100md.com
6，刘士民，郭玉璞.脑缺血半暗带的研究进展.中华神经科杂志，1996，12(29)∶6.
7，Memezawa H,Minamisawa H,Smith ML,et al.Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat.Exp Brain Res,1992,89∶67.
8，Auer RN,Wieloch T,Olsson Y,et al.The distribution of hypoglycemic brain damage.Acta Neuropathos,1984,64∶177～191.
9，Kirino T,San K.selective vulnerability in the gerbil hippocampus following ischemia.Acta Neuropathos,1984,62∶20～208.
, 百拇医药
10，Atillo A,Soderfeldt B,et al.Pathogenesis of brain lesions caused by experimental Epilepsy.Light and election-microscopic changes in the rat hippocampus following bicucculline-induced status epileptics.Acta Neuropathol,1983,59∶11～24.
11，Nagasawa H.Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion.stroke,1989,20∶1037～1043.
12，Mitani A,Kubo H,Iga K,et al.A new enzymatic cycling technique for glutamate determination in brain microdialystates J Neurochem,1990,54∶709.
收稿日期：2000-04-11, http://www.100md.com