7-NI对脑缺血再灌流后NOS、MDA和神经元超微结构的影响
作者：高谦 余华峰
单位：高谦(北京积水潭医院神经内科 100035)；余华峰(北京同仁医院神经内科)
关键词：神经元；7-硝基吲唑；脑缺血再灌流
北京医学000414 【摘要】目的 探讨神经元型一氧化氮合酶抑制剂(nNOSI)7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对脑缺血再灌流保护作用的机理。方法 选用Wistar大鼠，制成大脑中动脉闭塞模型(MCAO)，闭塞1小时后治疗组给予7-NI(50mg/kg)，对照组和假手术组给予花生油5ml/kg，再灌流1小时后测定各项指标。结果 再灌流1小时后，7-NI组NOS(一氧化氮合酶)活性、MDA(丙二醛)含量均明显低于单纯缺血再灌流对照组(P<0.05)；神经元亚细胞器的异常变化在7-NI组有明显改善。结论 7-NI对脑缺血再灌流早期有保护作用。
The effects of 7-nitroindazole on NOS,MDA and neuronal ultrastructure after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats
, 百拇医药
Gao Qian,Yu Huafeng
(Department of Neurology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035)
【Abstract】Objective The present study was designed to investigate whether the selective inhibitor of neuronal nitric oxide synthase,7- nitroindazole (7-NI),plays a protective role in the early stage of transient focal cerebral ischemia-reperfusion (IR).Methods Wistar rats were divided randomly into 3 groups.The left middle cerebral artery was occluded for 1 hour followed by another hour of reperfusion. 7-NI (50ml/kg) or peanutoil (5ml/kg) was given intraperitoneally just at the beginning of reperfusion.At the end of the experiment,NOS,MDA were measured and the neuronal ultrastructure was evaluated with electron microscope.Results It was found that the activity of NOS and the level of MDA were decreased after ischemia-reperfusion in 7-NI group as compared with control group (P<0.05).The ultrastructural abnormalities were also alleviated in the 7-NI group.Conclusions The results indicate that postischemic application of 7-NI (50mg/kg) protects neurons from focal cerebral IR injury in rats.
, 百拇医药
【Key words】Neurons 7-nitroindazole Cerebral ischemia-reperfusion
神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在脑缺血再灌流早期的神经毒作用已有多篇报道[1～3]，nNOS合成与释放的一氧化氮(NO)不仅在脑缺血再灌流早期直接损害神经组织，还可与其它反应性活性氧族(reactive oxygen species,ROS)如超氧阴离子(
)反应生成毒性更强的物质，间接损伤神经组织[4～6]。7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)是一种神经元型一氧化氮合酶抑制剂(neuronal nitric oxide synthase inhibitor,nNOSI)，我们从动物实验观察7-NI是否对脑缺血再灌流早期有保护作用，并探讨其脑保护作用的部分机理。
, http://www.100md.com 材料与方法
一、材料
1.实验动物：健康雌性Wistar大鼠，体重180～220g，随机分组，6%水合氯醛以5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉大鼠，麻醉期间及术中用100W烤灯维持肛温在36.5～37.5℃。
2.动物模型的建立：参考Longa等[7]，采用线栓法可逆性闭塞大鼠左侧大脑中动脉，将一顶端加热后呈膨圆、直径0.165mm的渔线插入左颈外动脉(ECA)，送入渔线至颈内动脉内，制成MCAO。缺血1小时后拔出栓子至ECA内，再灌流1小时后处死，取脑备检测。
3.主要试剂及仪器：7-NI与花生油购自美国Sigma公司，用前按10mg：1ml配成混悬液；NOS及MDA测定试剂盒购自军事医学科学院放射医学研究所。瑞士UVIKON 810型双波长分光光度计；日立H-500透射电镜。
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二、实验分组及给药方法
单纯缺血再灌流组(对照组)为MCAO 1小时给予花生油5ml/kg,ip后拔栓，再灌流1小时；治疗组为MCAO 1小时即刻给予7-NI 50mg/kg,ip后再灌流1小时；假手术组除不插入线栓外，余手术步骤同对照组，术后1小时给予花生油5ml/kg,ip，于术后2小时断头检测。以上每组11只，其中8只做生化检查，3只做电镜检查。
三、观察项目及方法
1.脑组织匀浆制备：到各时间点后，取左侧大脑半球，以重量(g)/体积(ml)比1∶4加入40mmol/L,pH=7.2磷酸钾缓冲液制成匀浆，10 000转/分离心20分钟，取上清液备测。
2.NOS活性测定：采用双波长分光光度计法，测试步骤严格按试剂盒说明书进行，NOS活性单位表示法：每克组织每分钟产生NO的量定义为1个酶活力单位，即nmol。min-1/g。
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3.脂质过氧化物终产物丙二醛(MDA)的测定：采用硫代巴比妥酸(TBA)法严格按试剂盒说明书进行，MDA含量以nmol/ml脑匀浆表示。
4.电镜病理学检查：取冠状的丘脑中1/3段(左侧)，2.5%戊二醛中固定，48小时后修块，取海马CA3区到齿状回组织、顶皮质I区组织各1mm×1mm×1.5mm。常规透射电镜制样，选择顶皮质锥体神经元和海马锥体细胞层，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，电镜下观察。
四、统计学处理
各项检测所得结果以均数±标准差表示。单因素方差分析，当方差分析差异有显著性意义时，进一步用q检验作两两比较，检验水准取α=0.05，当P<0.05时认为有显著性差异。
结 果
一、缺血1小时再灌流1小时(I1R1)脑组织NOS活性的变化
, 百拇医药
对照组、治疗组NOS活性均较假手术组增高(P<0.05)，但治疗组NOS活性明显低于对照组(P<0.05)，见附表。
二、I1R1时相脑组织MDA含量的变化
对照组、治疗组结果均高于假手术组(P<0.05)，但治疗组明显低于对照组(P<0.05)，见附表。
三、电镜结果(三组每只各观察20个神经元，仅做定性分析)
附表 7-NI对脑组织NOS (nmol.min-1/g)
和MDA(nmol/ml)的影响(
±s) 组别
NOS(n=8)
, 百拇医药
MDA(n=8)
假手术组
对照组
治疗组
0.340±0.097
1.360±0.147
0.607±0.162*#
6.125±0.038
17.580±1.747
8.724±0.552*#
与假手术组比较*P<0.05,与对照组比较 #P<0.05
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假手术组：为正常神经组织，仅有极个别神经元形态异常。
对照组：海马、皮质两区许多神经元胞体固缩或肿胀；核固缩或溶解坏死，染色质凝集成块或溶解，异染色质边集，核膜连续性破坏或凹陷；许多线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊、断裂、消失，线粒体内基质电子密度降低。
治疗组：上述神经组织异常改变明显改善，变性的神经元数目较对照组少，核轻度不规则，核膜完整，异染色质边集现象少见；异形线粒体也较对照组少，多数线粒体嵴清楚、连续。
讨 论
一、7-NI对NOS活性和MDA的影响
对照组、治疗组NOS活性均较假手术组增高，反映了脑缺血再灌流早期NOS活性上调，但7-NI治疗组NOS活性明显低于对照组，7-NI为选择性nNOSI，不抑制在体动物的eNOS[8]，所以早期使用7-NI后确实可抑制NOS活性。对照组及治疗组MDA含量均显著高于假手术组，表明有大量强氧化剂产生，超过了体内抗氧化系统的消除能力，产生大量的脂质过氧化物终产物。但治疗组MDA含量低于对照组(P<0.05)，所以再灌流前给予7-NI可抑制缺血再灌流后MDA含量的升高。
, 百拇医药
二、7-NI对脑缺血再灌流后电镜结果的影响
NO可渗透细胞膜，直达线粒体，与线粒体氧化磷酸化产生的副产品O-2*迅速反应生成过氧亚硝酸离子(peroxynitrite,ONOO-)，ONOO-抑制线粒体ATP合成酶和电子传递链，导致能量衰竭[6]。而且，线粒体内重要的氧自由基清除剂MnSOD可被ONOO-抑制，致其失活，导致更多的O-2*生成[9]，随之更多的ONOO-也产生，使线粒体呼吸功能进一步受损，此又促进钙超载和nNOS激活，引发恶性循环。本实验发现，7-NI治疗组异形线粒体数量比对照组明显减少，所以7-NI能打破上述恶性循环，挽救线粒体，继而挽救整个神经元。
三、7-NI在脑缺血再灌流早期保护作用的可能机理
, 百拇医药
局灶性脑缺血早期，大量NO主要来源于nNOS，直接引起脑损害[1]；在再灌流期间，NO又与超氧阴离子反应生成ONOO-，它的毒性比NO更强[4～6]。本实验证明，特异性nNOS抑制剂7-NI(50mg/kg)能使MDA降低，减轻脑组织病理损伤，这与文献报道[8]一致。我们认为，7-NI通过抑制nNOS活性，抑制NO对神经元的直接损伤，且间接抑制ONOO-，抑制脂质过氧化，使MDA含量下降，维持线粒体功能，从而减轻脑缺血再灌流损伤后病理损害程度，由此推断选择性nNOSI 7-NI有益于脑缺血再灌流损伤的早期治疗。
综上所述，选用适量7-NI，可减轻脑缺血再灌流后神经元的损伤，可能有利于改善脑卒中的预后，为临床治疗缺血性脑血管病应用nNOSI提供了实验依据。
参考文献
1.Samdani AF,Dawson TM,Dawson VL.NOS in models of focal ischemia.Stroke,1997,28:1283.
, 百拇医药
2.Hara H,Huang PL,Panahian N,et al.Reduced brain edema and infarction volume in mice lacking the nNOS after transient MCAO.J Cereb Blood Flow Matab,1996,16:605.
3.Huang Z,Huang PL,Panahian N,et al.Effects of cerebral ischmia in mice deficient in nNOS.Science,1994,265:1883.
4.冯亦璞.缺血性脑卒中的病理生理及药物治疗现状.药学学报，1999，34：72.
5.Kumura E,Toshiki Y,Ko-Ichi I,et al.Generation of NO and
during reperfusion after focal cerebral ischemia in rat.Am J Physiol,1996,270(Cell Physiol.39):C748.
, http://www.100md.com
6.Brorson JR,Schumacker PT,Zhang H.NO acutely inhibits neuronal energy production.J Neurosci,1999,19:147.
7.Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20:84.
8.Coert BA,Anderson RE,Meyer FB.A comparative study of the effects of two NOSIs and two NO donors on temporary focal cerebral ischemia in the Wistar rat.J Neurosurg,1999,90:332.
9.Macmillan-Crow LA,Crow JP,Kerby JD,et al.Nitration and inactivation of MnSOD in chronic rejection of human renal grafts.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:11853.
收稿：1999-07-09
修回：1999-11-22, 百拇医药
单位：高谦(北京积水潭医院神经内科 100035)；余华峰(北京同仁医院神经内科)
关键词：神经元；7-硝基吲唑；脑缺血再灌流
北京医学000414 【摘要】目的 探讨神经元型一氧化氮合酶抑制剂(nNOSI)7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对脑缺血再灌流保护作用的机理。方法 选用Wistar大鼠，制成大脑中动脉闭塞模型(MCAO)，闭塞1小时后治疗组给予7-NI(50mg/kg)，对照组和假手术组给予花生油5ml/kg，再灌流1小时后测定各项指标。结果 再灌流1小时后，7-NI组NOS(一氧化氮合酶)活性、MDA(丙二醛)含量均明显低于单纯缺血再灌流对照组(P<0.05)；神经元亚细胞器的异常变化在7-NI组有明显改善。结论 7-NI对脑缺血再灌流早期有保护作用。
The effects of 7-nitroindazole on NOS,MDA and neuronal ultrastructure after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats
, 百拇医药
Gao Qian,Yu Huafeng
(Department of Neurology,Beijing Jishuitan Hospital,Beijing 100035)
【Abstract】Objective The present study was designed to investigate whether the selective inhibitor of neuronal nitric oxide synthase,7- nitroindazole (7-NI),plays a protective role in the early stage of transient focal cerebral ischemia-reperfusion (IR).Methods Wistar rats were divided randomly into 3 groups.The left middle cerebral artery was occluded for 1 hour followed by another hour of reperfusion. 7-NI (50ml/kg) or peanutoil (5ml/kg) was given intraperitoneally just at the beginning of reperfusion.At the end of the experiment,NOS,MDA were measured and the neuronal ultrastructure was evaluated with electron microscope.Results It was found that the activity of NOS and the level of MDA were decreased after ischemia-reperfusion in 7-NI group as compared with control group (P<0.05).The ultrastructural abnormalities were also alleviated in the 7-NI group.Conclusions The results indicate that postischemic application of 7-NI (50mg/kg) protects neurons from focal cerebral IR injury in rats.
, 百拇医药
【Key words】Neurons 7-nitroindazole Cerebral ischemia-reperfusion
神经元型一氧化氮合酶(nNOS)在脑缺血再灌流早期的神经毒作用已有多篇报道[1～3]，nNOS合成与释放的一氧化氮(NO)不仅在脑缺血再灌流早期直接损害神经组织，还可与其它反应性活性氧族(reactive oxygen species,ROS)如超氧阴离子(
)反应生成毒性更强的物质，间接损伤神经组织[4～6]。7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)是一种神经元型一氧化氮合酶抑制剂(neuronal nitric oxide synthase inhibitor,nNOSI)，我们从动物实验观察7-NI是否对脑缺血再灌流早期有保护作用，并探讨其脑保护作用的部分机理。, http://www.100md.com 材料与方法
一、材料
1.实验动物：健康雌性Wistar大鼠，体重180～220g，随机分组，6%水合氯醛以5ml/kg腹腔注射(ip)麻醉大鼠，麻醉期间及术中用100W烤灯维持肛温在36.5～37.5℃。
2.动物模型的建立：参考Longa等[7]，采用线栓法可逆性闭塞大鼠左侧大脑中动脉，将一顶端加热后呈膨圆、直径0.165mm的渔线插入左颈外动脉(ECA)，送入渔线至颈内动脉内，制成MCAO。缺血1小时后拔出栓子至ECA内，再灌流1小时后处死，取脑备检测。
3.主要试剂及仪器：7-NI与花生油购自美国Sigma公司，用前按10mg：1ml配成混悬液；NOS及MDA测定试剂盒购自军事医学科学院放射医学研究所。瑞士UVIKON 810型双波长分光光度计；日立H-500透射电镜。
, http://www.100md.com
二、实验分组及给药方法
单纯缺血再灌流组(对照组)为MCAO 1小时给予花生油5ml/kg,ip后拔栓，再灌流1小时；治疗组为MCAO 1小时即刻给予7-NI 50mg/kg,ip后再灌流1小时；假手术组除不插入线栓外，余手术步骤同对照组，术后1小时给予花生油5ml/kg,ip，于术后2小时断头检测。以上每组11只，其中8只做生化检查，3只做电镜检查。
三、观察项目及方法
1.脑组织匀浆制备：到各时间点后，取左侧大脑半球，以重量(g)/体积(ml)比1∶4加入40mmol/L,pH=7.2磷酸钾缓冲液制成匀浆，10 000转/分离心20分钟，取上清液备测。
2.NOS活性测定：采用双波长分光光度计法，测试步骤严格按试剂盒说明书进行，NOS活性单位表示法：每克组织每分钟产生NO的量定义为1个酶活力单位，即nmol。min-1/g。
, http://www.100md.com
3.脂质过氧化物终产物丙二醛(MDA)的测定：采用硫代巴比妥酸(TBA)法严格按试剂盒说明书进行，MDA含量以nmol/ml脑匀浆表示。
4.电镜病理学检查：取冠状的丘脑中1/3段(左侧)，2.5%戊二醛中固定，48小时后修块，取海马CA3区到齿状回组织、顶皮质I区组织各1mm×1mm×1.5mm。常规透射电镜制样，选择顶皮质锥体神经元和海马锥体细胞层，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，电镜下观察。
四、统计学处理
各项检测所得结果以均数±标准差表示。单因素方差分析，当方差分析差异有显著性意义时，进一步用q检验作两两比较，检验水准取α=0.05，当P<0.05时认为有显著性差异。
结 果
一、缺血1小时再灌流1小时(I1R1)脑组织NOS活性的变化
, 百拇医药
对照组、治疗组NOS活性均较假手术组增高(P<0.05)，但治疗组NOS活性明显低于对照组(P<0.05)，见附表。
二、I1R1时相脑组织MDA含量的变化
对照组、治疗组结果均高于假手术组(P<0.05)，但治疗组明显低于对照组(P<0.05)，见附表。
三、电镜结果(三组每只各观察20个神经元，仅做定性分析)
附表 7-NI对脑组织NOS (nmol.min-1/g)
和MDA(nmol/ml)的影响(
±s) 组别NOS(n=8)
, 百拇医药
MDA(n=8)
假手术组
对照组
治疗组
0.340±0.097
1.360±0.147
0.607±0.162*#
6.125±0.038
17.580±1.747
8.724±0.552*#
与假手术组比较*P<0.05,与对照组比较 #P<0.05
, http://www.100md.com
假手术组：为正常神经组织，仅有极个别神经元形态异常。
对照组：海马、皮质两区许多神经元胞体固缩或肿胀；核固缩或溶解坏死，染色质凝集成块或溶解，异染色质边集，核膜连续性破坏或凹陷；许多线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊、断裂、消失，线粒体内基质电子密度降低。
治疗组：上述神经组织异常改变明显改善，变性的神经元数目较对照组少，核轻度不规则，核膜完整，异染色质边集现象少见；异形线粒体也较对照组少，多数线粒体嵴清楚、连续。
讨 论
一、7-NI对NOS活性和MDA的影响
对照组、治疗组NOS活性均较假手术组增高，反映了脑缺血再灌流早期NOS活性上调，但7-NI治疗组NOS活性明显低于对照组，7-NI为选择性nNOSI，不抑制在体动物的eNOS[8]，所以早期使用7-NI后确实可抑制NOS活性。对照组及治疗组MDA含量均显著高于假手术组，表明有大量强氧化剂产生，超过了体内抗氧化系统的消除能力，产生大量的脂质过氧化物终产物。但治疗组MDA含量低于对照组(P<0.05)，所以再灌流前给予7-NI可抑制缺血再灌流后MDA含量的升高。
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二、7-NI对脑缺血再灌流后电镜结果的影响
NO可渗透细胞膜，直达线粒体，与线粒体氧化磷酸化产生的副产品O-2*迅速反应生成过氧亚硝酸离子(peroxynitrite,ONOO-)，ONOO-抑制线粒体ATP合成酶和电子传递链，导致能量衰竭[6]。而且，线粒体内重要的氧自由基清除剂MnSOD可被ONOO-抑制，致其失活，导致更多的O-2*生成[9]，随之更多的ONOO-也产生，使线粒体呼吸功能进一步受损，此又促进钙超载和nNOS激活，引发恶性循环。本实验发现，7-NI治疗组异形线粒体数量比对照组明显减少，所以7-NI能打破上述恶性循环，挽救线粒体，继而挽救整个神经元。
三、7-NI在脑缺血再灌流早期保护作用的可能机理
, 百拇医药
局灶性脑缺血早期，大量NO主要来源于nNOS，直接引起脑损害[1]；在再灌流期间，NO又与超氧阴离子反应生成ONOO-，它的毒性比NO更强[4～6]。本实验证明，特异性nNOS抑制剂7-NI(50mg/kg)能使MDA降低，减轻脑组织病理损伤，这与文献报道[8]一致。我们认为，7-NI通过抑制nNOS活性，抑制NO对神经元的直接损伤，且间接抑制ONOO-，抑制脂质过氧化，使MDA含量下降，维持线粒体功能，从而减轻脑缺血再灌流损伤后病理损害程度，由此推断选择性nNOSI 7-NI有益于脑缺血再灌流损伤的早期治疗。
综上所述，选用适量7-NI，可减轻脑缺血再灌流后神经元的损伤，可能有利于改善脑卒中的预后，为临床治疗缺血性脑血管病应用nNOSI提供了实验依据。
参考文献
1.Samdani AF,Dawson TM,Dawson VL.NOS in models of focal ischemia.Stroke,1997,28:1283.
, 百拇医药
2.Hara H,Huang PL,Panahian N,et al.Reduced brain edema and infarction volume in mice lacking the nNOS after transient MCAO.J Cereb Blood Flow Matab,1996,16:605.
3.Huang Z,Huang PL,Panahian N,et al.Effects of cerebral ischmia in mice deficient in nNOS.Science,1994,265:1883.
4.冯亦璞.缺血性脑卒中的病理生理及药物治疗现状.药学学报，1999，34：72.
5.Kumura E,Toshiki Y,Ko-Ichi I,et al.Generation of NO and
during reperfusion after focal cerebral ischemia in rat.Am J Physiol,1996,270(Cell Physiol.39):C748., http://www.100md.com
6.Brorson JR,Schumacker PT,Zhang H.NO acutely inhibits neuronal energy production.J Neurosci,1999,19:147.
7.Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20:84.
8.Coert BA,Anderson RE,Meyer FB.A comparative study of the effects of two NOSIs and two NO donors on temporary focal cerebral ischemia in the Wistar rat.J Neurosurg,1999,90:332.
9.Macmillan-Crow LA,Crow JP,Kerby JD,et al.Nitration and inactivation of MnSOD in chronic rejection of human renal grafts.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:11853.
收稿：1999-07-09
修回：1999-11-22, 百拇医药