ARDS患者外周血mCD14阳性单核细胞的检测及其意义
作者：徐剑铖 毛宝龄
单位：徐剑铖，毛宝龄 第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所，四川 重庆 400037
关键词：急性呼吸窘迫综合征；单核细胞；mCD14
中国急救医学990903 摘要：目的 观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者外周血单核细胞mCD14的表达情况，并探讨其意义。方法 对5例ARDS患者及10例健康志愿者，分别分离其外周血单核细胞，用抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC法)检测其mCD14的表达。结果 ARDS组及对照组外周血mCD14阳性单核细胞的百分率分别为94.3%±1.5%、93.6%±1.7%，两组间无显著性差别(P>0.05)。结论 ARDS患者及健康志愿者外周血单核细胞高表达mCD14，说明它们对LPS具有较高的潜在识别能力，一旦有LPS存在或入侵，这些细胞将可能被激活并释放介质。
, 百拇医药 中图分类号：R 563.8
文献标识码：A
文章编号：1002-1949(1999)09-0520-02
Significance of mCD14 expressione in the membrane of monocytes from patient with acute respiratory distress syndrome
XU Jian-cheng,MAO Bao-ling.Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037, China
Abstract Objective To investigate mCD14 protein expression in peripheral monocytes from patient with acute respiratory distress syndrome(ARDS),and to analyze the value of mCD14 protein expression.Methods Avidin biotin-peroxidase complex technique was used to determine mCD14 protein expression in peripheral monocytes in 5 ARDS patients and 10 normal subjects.Results The percentages of mCD14-positive monocytes in 5 patients with ARDS and 10 healthy volunteers are 94.3%±1.5% and 93.6%±1.7% respectively,there was no significance difference between the two groups(P>0.05).Conclusion It is suggested that monocytes both in patients with ARDS and in normal subjects may have a strong potential recongnizing ability to lipopolysaccharide(LPS).
, 百拇医药
Key words Acute respiratory distress syndrome(ARDS)； Monocyte； mCD14
严重感染是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)最多见的病因之一，即使不是感染诱发者，病程中因继发感染，或者由于细菌易位和肠道毒素吸收等缘故，也有感染因素参与ARDS损害[1]，细菌脂多糖(LPS)是其中的重要致病因素。CD14是通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在单核/巨噬细胞等细胞膜上的一种55kD糖蛋白，位于细胞膜上者称为膜CD14(mCD14)，脱落至体液中者称为可溶性CD14(sCD14)。已证明，CD14是LPS的受体[2]，LPS与CD14结合可诱导机体的炎症级联反应和脓毒综合征(sepsis syndrome)[3]。然而，ARDS病人单核细胞表达mCD14的状况如何，目前尚不清楚。本实验采用免疫组化方法对ARDS病人外周血单核细胞mCD14的表达进行了观察，并与健康志愿者外周血单核细胞mCD14的表达进行了比较，初步探讨了mCD14表达的意义。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 实验对象及分组
实验对象包括两组：(1)ARDS组，n=5，其中男4例，女1例，平均年龄36.4±4.2岁，临床主要表现为呼吸迫促，胸片呈双肺程度不等的浸润灶，动脉血氧分压显著降低，均符合ARDS诊断标准[4]，原发病分别为创伤2例，脓毒症2例，消化道出血1例；(2)对照组，n=10，为健康志愿献血员，其中男6例，女4例，平均年龄34.1±8.5岁。
1.2 方法
每例受试者取静脉血5 ml(ARDS患者于确诊的当天或第2天取血)，先后用淋巴细胞分离液(密度1.077±0.002 g/ml，pH 6.5～7.5，上海试剂二厂)及粘附法分离、制备单核细胞悬液，取1×105单核细胞涂于洁净载玻片上，2～4张/例，冷丙酮固定后，以抗生物素-生物素-过氧化酶复合物法(ABC法)染色(ABC试剂盒购自华美生物工程公司，小鼠抗人CD14单抗MEM-15由捷克共和国科学院分子遗传所Vaclav Horejisi博士惠赠)，DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察500个单核细胞，记录mCD14阳性的单核细胞数量，计算阳性细胞的百分率。统计学处理采用单因素方差分析。
, 百拇医药
2 结果
mCD14呈阳性着色的单核细胞见图，每例样本mCD14阳性单核细胞的百分率如表所示。
图 ARDS患者单核细胞mCD14阳性染色(×400)
表 外周血mCD14阳性单核细胞的百分率(%) 样本号
对照组(n=10)
ARDS组(n=5)
1
94.0
92.2
, 百拇医药
2
93.2
94.6
3
92.0
95.8
4
90.8
93.6
5
95.6
95.4
6
, 百拇医药
94.2
7
93.8
8
95.0
9
96.0
10
91.6
±s
93.6±1.7
94.3±1.5
结果表明，ARDS组与对照组外周血mCD14阳性单核细胞的百分率分别为94.3%±1.5%、93.6%±1.7%，两组间无统计差别(P>0.05)。用小鼠血清或PBS替代一抗的对照实验，未见有呈阳性染色的细胞。
, 百拇医药
3 讨论
炎症细胞等激活并释放大量细胞因子或介质，形成“瀑布”效应，导致炎症反应不断扩大在ARDS发病中的作用，近年引起广泛重视。单核细胞是主要炎症细胞之一，进入组织后又成为巨噬细胞，而单核/巨噬细胞是炎性细胞因子的主要来源细胞[3，5]，因此，我们首先对外周血单核细胞的mCD14进行了观察。结果表明，ARDS组与对照组外周血单核细胞表达mCD14均较广泛，即绝大部分外周血单核细胞均有mCD14表达，而两组之间这种表达并无显著差别。近年的研究已证明，CD14为LPS的受体，在LPS介导的细胞活化及细胞因子或介质释放中起着至关重要的作用[2，3，6]。Ferrero等[7]报道，高度表达CD14的转基因小鼠LPS的敏感性更高，并易于发生败血症休克。ARDS患者及健康志愿者外周血单核细胞高表达mCD14，说明它们对LPS具有较高的潜在识别能力，一旦有LPS存在或入侵，这些细胞将可能被激活并释放介质。
, 百拇医药
目前已查明，表达mCD14的细胞除单核细胞外，还有肺泡巨噬细胞(AM)、中性多核白细胞(PMN)等[8]；只不过正常状态下AM、PMN表达mCD14处在相对较低的水平。Hoogsteden等[9]用抗CD14单抗MY4，分别观察健康志愿者、结节病、外源性变应性肺泡炎(EAA)病人AM mCD14的表达，结果发现，健康志愿者表达mCD14的AM只有48%；而与健康志愿者相比，结节病病人AM表达mCD14明显减低，EAA病人AM表达mCD14则显著增多。ARDS病人AM表达mCD14的状况如何，目前还不清楚，由于在ARDS病人中开展纤维支气管镜检查存在一些困难，因此，本实验中我们未能对AM的mCD14表达情况进行观察。又由于我们观察的例数较少，且mCD14的表达还可受到细胞成熟度[10]及一些局部因素[11]的影响，因此，对ARDS病人细胞中mCD14表达的全面评价还有待进一步探讨。本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39500064)
, http://www.100md.com 参考文献
[1]Sessler CN,Bloomfield,GL,FowlerⅢ AA.Current concepts of sepsis and acute lung injury〔J〕.Clin Chest Med,1996,17(2):213-235.
[2]Wright SD,Ramos PA,Tobias PS,et al.CD14,a receptor for complexs of lipoplysaccharide(LPS) and LPS binding protein〔J〕.Scienece,1990,249:1431-1433.
[3]Marsh CB,Wewer MD.The pathogenesis of sepsis:factors that modulate the response to gram-negative bacterial infection〔J〕.Clin Chest Med,1996,17(2):183-197.
, 百拇医药
[4]中华结核和呼吸杂志编委会.成人呼吸窘迫综合征诊断标准(修正草案)〔S〕.中华结核和呼吸杂志〔J〕，1989，12(6)：368-369.
[5]Kelly J.Cytokines of the lung〔J〕.Am Rev Respir Dis 1990:141:765-788.
[6]Tobias PS,Ulevitch RJ.Lipopolysaccharide-binding protein dependent activation of cells〔J〕.Chest,1994,105(3):48-50.
[7]Ferrero E,Jiao D,Tsuberi BZ,et al.Transgenic mice expression human CD14 are hypersensitive to lipopolysaccharide〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:2380-2384.
, 百拇医药
[8]Ulevitch RJ,Ziegler-Heitbrock HWL.CD14:cell surface receptor and differentiation marker〔J〕.Immunology Today,1993,14(3):121-125.
[9]Hoogsteden HC,van Dongen J JM,van Hal PTW,et al.Phenotype of blood monocytes and alveolar macrophages in intersitital lung disease〔J〕.Chest,1989,95:574-577.
[10]Hance AJ,Douches S,Winchester Rj,et al.Characterization of mononuclear phagocyte subpopulations in the human lung by using monoclonal antibodies:Changes in alveolar macrophage phenotype associated with pulmonary sarcoidosis〔J〕.J Immunol,1985,134:284-292.
[11]Firestein GS,Zvaifler NJ.Down regulation of human monocyte differentiation antigens by interferon-γ〔J〕.Cell Immunol,1987,104:343-354.
收稿：1999-07-30, 百拇医药
单位：徐剑铖，毛宝龄 第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所，四川 重庆 400037
关键词：急性呼吸窘迫综合征；单核细胞；mCD14
中国急救医学990903 摘要：目的 观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者外周血单核细胞mCD14的表达情况，并探讨其意义。方法 对5例ARDS患者及10例健康志愿者，分别分离其外周血单核细胞，用抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC法)检测其mCD14的表达。结果 ARDS组及对照组外周血mCD14阳性单核细胞的百分率分别为94.3%±1.5%、93.6%±1.7%，两组间无显著性差别(P>0.05)。结论 ARDS患者及健康志愿者外周血单核细胞高表达mCD14，说明它们对LPS具有较高的潜在识别能力，一旦有LPS存在或入侵，这些细胞将可能被激活并释放介质。
, 百拇医药 中图分类号：R 563.8
文献标识码：A
文章编号：1002-1949(1999)09-0520-02
Significance of mCD14 expressione in the membrane of monocytes from patient with acute respiratory distress syndrome
XU Jian-cheng,MAO Bao-ling.Institute of Respiratory Disease,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037, China
Abstract Objective To investigate mCD14 protein expression in peripheral monocytes from patient with acute respiratory distress syndrome(ARDS),and to analyze the value of mCD14 protein expression.Methods Avidin biotin-peroxidase complex technique was used to determine mCD14 protein expression in peripheral monocytes in 5 ARDS patients and 10 normal subjects.Results The percentages of mCD14-positive monocytes in 5 patients with ARDS and 10 healthy volunteers are 94.3%±1.5% and 93.6%±1.7% respectively,there was no significance difference between the two groups(P>0.05).Conclusion It is suggested that monocytes both in patients with ARDS and in normal subjects may have a strong potential recongnizing ability to lipopolysaccharide(LPS).
, 百拇医药
Key words Acute respiratory distress syndrome(ARDS)； Monocyte； mCD14
严重感染是急性呼吸窘迫综合征(ARDS)最多见的病因之一，即使不是感染诱发者，病程中因继发感染，或者由于细菌易位和肠道毒素吸收等缘故，也有感染因素参与ARDS损害[1]，细菌脂多糖(LPS)是其中的重要致病因素。CD14是通过糖基化磷脂酰肌醇锚定在单核/巨噬细胞等细胞膜上的一种55kD糖蛋白，位于细胞膜上者称为膜CD14(mCD14)，脱落至体液中者称为可溶性CD14(sCD14)。已证明，CD14是LPS的受体[2]，LPS与CD14结合可诱导机体的炎症级联反应和脓毒综合征(sepsis syndrome)[3]。然而，ARDS病人单核细胞表达mCD14的状况如何，目前尚不清楚。本实验采用免疫组化方法对ARDS病人外周血单核细胞mCD14的表达进行了观察，并与健康志愿者外周血单核细胞mCD14的表达进行了比较，初步探讨了mCD14表达的意义。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 实验对象及分组
实验对象包括两组：(1)ARDS组，n=5，其中男4例，女1例，平均年龄36.4±4.2岁，临床主要表现为呼吸迫促，胸片呈双肺程度不等的浸润灶，动脉血氧分压显著降低，均符合ARDS诊断标准[4]，原发病分别为创伤2例，脓毒症2例，消化道出血1例；(2)对照组，n=10，为健康志愿献血员，其中男6例，女4例，平均年龄34.1±8.5岁。
1.2 方法
每例受试者取静脉血5 ml(ARDS患者于确诊的当天或第2天取血)，先后用淋巴细胞分离液(密度1.077±0.002 g/ml，pH 6.5～7.5，上海试剂二厂)及粘附法分离、制备单核细胞悬液，取1×105单核细胞涂于洁净载玻片上，2～4张/例，冷丙酮固定后，以抗生物素-生物素-过氧化酶复合物法(ABC法)染色(ABC试剂盒购自华美生物工程公司，小鼠抗人CD14单抗MEM-15由捷克共和国科学院分子遗传所Vaclav Horejisi博士惠赠)，DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察500个单核细胞，记录mCD14阳性的单核细胞数量，计算阳性细胞的百分率。统计学处理采用单因素方差分析。
, 百拇医药
2 结果
mCD14呈阳性着色的单核细胞见图，每例样本mCD14阳性单核细胞的百分率如表所示。
图 ARDS患者单核细胞mCD14阳性染色(×400)
表 外周血mCD14阳性单核细胞的百分率(%) 样本号
对照组(n=10)
ARDS组(n=5)
1
94.0
92.2
, 百拇医药
2
93.2
94.6
3
92.0
95.8
4
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, 百拇医药
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91.6
±s
93.6±1.7
94.3±1.5
结果表明，ARDS组与对照组外周血mCD14阳性单核细胞的百分率分别为94.3%±1.5%、93.6%±1.7%，两组间无统计差别(P>0.05)。用小鼠血清或PBS替代一抗的对照实验，未见有呈阳性染色的细胞。
, 百拇医药
3 讨论
炎症细胞等激活并释放大量细胞因子或介质，形成“瀑布”效应，导致炎症反应不断扩大在ARDS发病中的作用，近年引起广泛重视。单核细胞是主要炎症细胞之一，进入组织后又成为巨噬细胞，而单核/巨噬细胞是炎性细胞因子的主要来源细胞[3，5]，因此，我们首先对外周血单核细胞的mCD14进行了观察。结果表明，ARDS组与对照组外周血单核细胞表达mCD14均较广泛，即绝大部分外周血单核细胞均有mCD14表达，而两组之间这种表达并无显著差别。近年的研究已证明，CD14为LPS的受体，在LPS介导的细胞活化及细胞因子或介质释放中起着至关重要的作用[2，3，6]。Ferrero等[7]报道，高度表达CD14的转基因小鼠LPS的敏感性更高，并易于发生败血症休克。ARDS患者及健康志愿者外周血单核细胞高表达mCD14，说明它们对LPS具有较高的潜在识别能力，一旦有LPS存在或入侵，这些细胞将可能被激活并释放介质。
, 百拇医药
目前已查明，表达mCD14的细胞除单核细胞外，还有肺泡巨噬细胞(AM)、中性多核白细胞(PMN)等[8]；只不过正常状态下AM、PMN表达mCD14处在相对较低的水平。Hoogsteden等[9]用抗CD14单抗MY4，分别观察健康志愿者、结节病、外源性变应性肺泡炎(EAA)病人AM mCD14的表达，结果发现，健康志愿者表达mCD14的AM只有48%；而与健康志愿者相比，结节病病人AM表达mCD14明显减低，EAA病人AM表达mCD14则显著增多。ARDS病人AM表达mCD14的状况如何，目前还不清楚，由于在ARDS病人中开展纤维支气管镜检查存在一些困难，因此，本实验中我们未能对AM的mCD14表达情况进行观察。又由于我们观察的例数较少，且mCD14的表达还可受到细胞成熟度[10]及一些局部因素[11]的影响，因此，对ARDS病人细胞中mCD14表达的全面评价还有待进一步探讨。本课题受国家自然科学基金资助(基金编号39500064)
, http://www.100md.com 参考文献
[1]Sessler CN,Bloomfield,GL,FowlerⅢ AA.Current concepts of sepsis and acute lung injury〔J〕.Clin Chest Med,1996,17(2):213-235.
[2]Wright SD,Ramos PA,Tobias PS,et al.CD14,a receptor for complexs of lipoplysaccharide(LPS) and LPS binding protein〔J〕.Scienece,1990,249:1431-1433.
[3]Marsh CB,Wewer MD.The pathogenesis of sepsis:factors that modulate the response to gram-negative bacterial infection〔J〕.Clin Chest Med,1996,17(2):183-197.
, 百拇医药
[4]中华结核和呼吸杂志编委会.成人呼吸窘迫综合征诊断标准(修正草案)〔S〕.中华结核和呼吸杂志〔J〕，1989，12(6)：368-369.
[5]Kelly J.Cytokines of the lung〔J〕.Am Rev Respir Dis 1990:141:765-788.
[6]Tobias PS,Ulevitch RJ.Lipopolysaccharide-binding protein dependent activation of cells〔J〕.Chest,1994,105(3):48-50.
[7]Ferrero E,Jiao D,Tsuberi BZ,et al.Transgenic mice expression human CD14 are hypersensitive to lipopolysaccharide〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:2380-2384.
, 百拇医药
[8]Ulevitch RJ,Ziegler-Heitbrock HWL.CD14:cell surface receptor and differentiation marker〔J〕.Immunology Today,1993,14(3):121-125.
[9]Hoogsteden HC,van Dongen J JM,van Hal PTW,et al.Phenotype of blood monocytes and alveolar macrophages in intersitital lung disease〔J〕.Chest,1989,95:574-577.
[10]Hance AJ,Douches S,Winchester Rj,et al.Characterization of mononuclear phagocyte subpopulations in the human lung by using monoclonal antibodies:Changes in alveolar macrophage phenotype associated with pulmonary sarcoidosis〔J〕.J Immunol,1985,134:284-292.
[11]Firestein GS,Zvaifler NJ.Down regulation of human monocyte differentiation antigens by interferon-γ〔J〕.Cell Immunol,1987,104:343-354.
收稿：1999-07-30, 百拇医药