大肠癌患者外周血中微转移化疗疗效的相关因素
作者：骆成玉 李世拥
单位：100700 北京军区总医院普外科
关键词：结肠直肠肿瘤；肿瘤转移；肿瘤循环细胞
中华外科杂志990712 【摘要】 目的 探讨大肠癌患者外周血微转移化疗疗效的相关因素及临床意义。 方法 观察大肠癌患者术后化疗前后外周血微转移的变化。 结果 72例患者术前外周血中查出细胞角蛋白20(CK20)阳性表达42例，阳性率58.3%。术后3天内外周血CK20阳性检出较术前多出5例，术后早期短程化疗结束后22例转阴。化疗后外周血微转移未转阴者与肿瘤组织bcl-2表达、p53突变密切相关。 结论 术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用。研究大肠癌患者外周血微转移对化疗的反应及其与相关基因的关系，有助于指导辅助治疗药物的选择和治疗方案的确定，可作为临床个体化治疗的重要参考。
Chemotherapeutic failure in micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas
, http://www.100md.com
LUO Chengyu, LI Shiyong.
Department of General Surgery,Beijing General Hospital, People′s Liberation Army,Beijing 100700.
【Abstract】 Objective To study chemotherapeutic failure in the micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas and its clinical significance. Methods We investigated the changes of micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas before and after chemotherapy. Results The positive rate of CK2O mRNA in peripheral blood was 58.3%. Five more positive cases were detected 3 days after operation than before operation. After early short-term chemotherapy following operation, 22 cases turned to be negative. The maintaince of micrometastasis in peripheral blood after chemotherapy was significantly related to bcl-2 expression and p53 mutation in cancer tissues. Conclusions The early short-term chemotherapy after operation plays a role in controlling the micrometastasis of colorectal carcinoma. The study of chemotherapeutic effect on micrometastasis in peripheral blood and its relation with the related genes may contribute to the selection of drugs and plans of adjuvant treatment.
, 百拇医药
【Key words】 Colorectal neoplasms Neoplasm metastasis Neoplasm circulating cells
血液中瘤细胞的存在是肿瘤血行转移的物质基础，及时发现肿瘤患者血液中的微转移不仅对肿瘤转移和复发的判断有重要意义，而且对指导临床综合治疗亦有重要价值。如果能在肿瘤微转移时得到诊断并给以针对性治疗，这对减少术后转移灶形成和复发，争取良好的预后有重要作用。细胞角蛋白20(CK20)具有严格的上皮特异分布，非上皮来源组织或细胞如正常血液、骨髓和淋巴结不表达CK20。因此，CK20可作为肿瘤患者血中癌细胞存在的标志[1]。本研究应用靶向CK20基因mRNA的非同位素逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测了72例大肠癌患者术前和术后不同时间外周血中微转移情况，从临床化疗疗效和分子水平着重分析了术后化疗后微转移不消退的相关因素。
资料与方法
, 百拇医药
1.一般临床资料：72例大肠癌患者，平均年龄56.41岁，男44例，女28例。于术前、术后3天内和术后早期短程化疗(术后第3天开始，化疗第1天用表阿霉素50～70 mg，第2天用丝裂霉素8～10 mg,第1～10天用喃呋啶1.0 g)结束后,分别从外周静脉抽取(注射器经焦碳酸二乙酯水处理，去除RNA酶)5 ml血液。手术切除后，立即取小块肿瘤组织行液氮速冻备检。
2.癌组织DNA提取。按常规酚-氯仿-异戊醇抽提基因组DNA[2]，三羟甲基氨基早烷-乙二胺四乙酸缓冲液溶解，4 ℃存放备用。
3.外周血CK20的检测：(1)按文献报道基因序列[1]合成CK20引物。CK20正义：5′-CAGACACACGGTGAACTATGG-3′,反义：5′-GATCAGCTTCCACTGTTA-
GACG-3′，扩增片段长度370 bp。(2)根据我们以前报道的方法[3]，进行总RNA提取、cDNA合成及RT-PCR。设计β2-MG作为内参对照。
, 百拇医药
4.癌组织c-erbB-2扩增:(1)参照文献[4]的序列合成c-erbB-2引物,扩增片段长度98 bp。序列:上游引物:5′-CCTCTGACGTCCATCATCTC-3′;下游引物:5′-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3′。(2)差异PCR 按文献[4]的方法进行,其中以β-actin为内参对照。
5.癌组织p53突变基因的检测：采用PCR-SSCP银染改进方法[5]。
6.癌组织bcl-2表达的检测：参照文献[6]的方法进行，bcl-2单克隆抗体为Dako公司产品。
结果
1.外周血CK20阳性检出率：本组72例患者，外周血中查出CK20 mRNA阳性表达42例，阳性率58.3%;术后3天内外周血CK20阳性表达47例，较术前多5例；术后早期短程化疗结束后, 阳性检出仅25例，22例转阴。
, 百拇医药
2.化疗后外周血微转移未转阴者的临床病理特征：47例化疗前外周血存在微转移者，使用化疗后未转阴病例与临床病理特征见表1。
表1 化疗后外周血微转移未转阴患者的临床病理特征 病理特征
化疗前阳性
病例(例数)
化疗后未转阴病例
P值
例数
%
分化程度
高分化
13
, 百拇医药
6
46.2
中分化
24
13
54.2
>0.05
低分化
10
6
60.0
Dukes分期
A
, 百拇医药
2
0
0
B
12
5
41.7
C
21
13
61.9
>0.05
D
12
, 百拇医药
7
58.3
c-erbB-2扩增
阴性
阳性
8
39
4
21
50.0
53.8
>0.05
p53突变
, http://www.100md.com
阴性
阳性
26
21
10
15
38.5
71.4
<0.05
bcl-2表达
阴性
阳性
14
, http://www.100md.com
33
4
21
28.6
63.6
<0.05
从表1可知，化疗后未转阴者与其癌组织分化程度、Dukes分期、c-erbB-2扩增无显著相关，各组间差别无显著性意义，但与癌组织p53突变及bcl-2表达有显著相关性，各组间差异有显著性意义(P<0.05)。
讨论
RT-PCR法具有病理组织学和免疫细胞化学技术不可比的敏感性，可以从106～107个正常组织细胞中检出一个肿瘤细胞[7]，因而尤其适用于微量肿瘤细胞的检测。我们以前建立的非核素RT-PCR法，简便、快捷，避免了核素使用的多种限制，更易被推广应用，从而保证了本实验结果的可靠性。
, 百拇医药
肿瘤细胞生物学特性研究证实，原发肿瘤切除后，由于反馈的关系，G0期细胞大量进入增殖期，转移肿瘤细胞倍增时间缩短，生长迅速，而且术后早期负荷最小，对化疗也最敏感[8]。因此，如果患者一般情况允许，化疗的实施宜尽早开始。本研究发现，术后早期短程化疗结束后，46.8%(22/47)患者外周血中癌细胞被消除。表明，术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用，无疑有助于改善患者的预后。但是辅助性化疗并非对所有患者都有益，部分患者化疗无效。本实验就观察到53.2%(25/47)的患者对术后早期短程化疗无效。
本组病例对化疗的反应性与其肿瘤的c-erbB-2扩增、分化程度和Dukes分期无显著相关性，但在Dukes分期中，A期的微转移未转阴率较低(0/2)，但统计学上未见显著性差别，这不除外标本数较少的因素。早期癌肿瘤细胞群体的密度较小，增殖速度较快，处于增殖期的细胞较多，是其对化疗敏感的主要原因。说明，大肠癌分化程度、c-erbB-2扩增与患者外周血微转移对化疗的敏感性无明显相关性，临床指导意义不大。
, 百拇医药
p53与bcl-2均是细胞凋亡的重要调控基因，目前许多抗肿瘤药物(如5-FU、羟基喜树碱)亦是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其治疗作用的。表达bcl-2基因的癌细胞对放疗、化疗等常规凋亡诱导剂有明显耐受[9]，有p53基因突变的患者对5-FU不敏感，临床预后亦较差[10]。目前认为5-FU为大肠癌化疗的基础用药。本研究从大肠癌患者外周血微转移对术后早期短程辅助化疗(包括5-FU类药物在内的三药联合)的反应的观察发现，癌组织bcl-2表达阳性和p53突变的大肠癌患者外周血微转移对这种联合化疗不敏感，微转移消退较少。所以，对这类患者选择合理的辅助性治疗药物就显得十分必要。研究大肠癌患者外周血微转移对化疗的反应及其与相关基因的关系，为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供了新的靶分子，对这类病例选择相应的基因治疗手段(如bcl-2反义寡核苷酸、反义RNA、核酶-Ribozyme、野生型p53导入、p53反义RNA等)不失为一种更具针对性的治疗途径或有前途的替代化疗的补充治疗方式。
参考文献
, 百拇医药
1 Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Br J Cancer,1995,71:278-281.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:laboratory manuals.2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.463-493.
3 骆成玉，祝学光，王申五.大肠癌中p53基因mRNA表达的定量研究. 中华实验外科杂志，1996, 13:157-159.
4 Gramlich TL, Cohen C, Fritsch C, et al.Evaluation of c-erbB-2 amplification in breast carcinoma by differential polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol, 1994, 101:493-496.
, http://www.100md.com
5 薛涛，祝学光，骆成玉,等.应用PCR-SSCP银染技术检测结直肠癌p53基因突变.中华实验外科杂志，1996, 13:21-22.
6 骆成玉，詹新恩，姜军.乳腺癌组织中T细胞亚群分布的观察与分析.中华实验外科杂志，1992，9：219.
7 Datta YH, Adams PT, Drobyki WR, et al.Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse trans criptase-polymerase chain reaction.J Clin Oncol,1994,12:475-483.
8 张天泽.手术后辅助化疗.见：韩锐,主编.肿瘤化学预防及药物治疗.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.771-779.
, 百拇医药
9 Hsu B, Marin MC, Brisbay S, et al. Expression of bcl-2 gene confers multidrug resistance to chemotherapy-induced cell death. Cancer Bull, 1994, 46:125-128.
10 Benhattar J, Cerottini TP, Saraga E, et al. p53 mutations as a possible predictor of response to chemotherapy in metastatic colorectal carcinomas. Int J Cancer,1996,57:190-194.
(收稿：1998-11-12 修回：1999-03-12), 百拇医药
单位：100700 北京军区总医院普外科
关键词：结肠直肠肿瘤；肿瘤转移；肿瘤循环细胞
中华外科杂志990712 【摘要】 目的 探讨大肠癌患者外周血微转移化疗疗效的相关因素及临床意义。 方法 观察大肠癌患者术后化疗前后外周血微转移的变化。 结果 72例患者术前外周血中查出细胞角蛋白20(CK20)阳性表达42例，阳性率58.3%。术后3天内外周血CK20阳性检出较术前多出5例，术后早期短程化疗结束后22例转阴。化疗后外周血微转移未转阴者与肿瘤组织bcl-2表达、p53突变密切相关。 结论 术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用。研究大肠癌患者外周血微转移对化疗的反应及其与相关基因的关系，有助于指导辅助治疗药物的选择和治疗方案的确定，可作为临床个体化治疗的重要参考。
Chemotherapeutic failure in micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas
, http://www.100md.com
LUO Chengyu, LI Shiyong.
Department of General Surgery,Beijing General Hospital, People′s Liberation Army,Beijing 100700.
【Abstract】 Objective To study chemotherapeutic failure in the micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas and its clinical significance. Methods We investigated the changes of micrometastasis in peripheral blood of patients with colorectal carcinomas before and after chemotherapy. Results The positive rate of CK2O mRNA in peripheral blood was 58.3%. Five more positive cases were detected 3 days after operation than before operation. After early short-term chemotherapy following operation, 22 cases turned to be negative. The maintaince of micrometastasis in peripheral blood after chemotherapy was significantly related to bcl-2 expression and p53 mutation in cancer tissues. Conclusions The early short-term chemotherapy after operation plays a role in controlling the micrometastasis of colorectal carcinoma. The study of chemotherapeutic effect on micrometastasis in peripheral blood and its relation with the related genes may contribute to the selection of drugs and plans of adjuvant treatment.
, 百拇医药
【Key words】 Colorectal neoplasms Neoplasm metastasis Neoplasm circulating cells
血液中瘤细胞的存在是肿瘤血行转移的物质基础，及时发现肿瘤患者血液中的微转移不仅对肿瘤转移和复发的判断有重要意义，而且对指导临床综合治疗亦有重要价值。如果能在肿瘤微转移时得到诊断并给以针对性治疗，这对减少术后转移灶形成和复发，争取良好的预后有重要作用。细胞角蛋白20(CK20)具有严格的上皮特异分布，非上皮来源组织或细胞如正常血液、骨髓和淋巴结不表达CK20。因此，CK20可作为肿瘤患者血中癌细胞存在的标志[1]。本研究应用靶向CK20基因mRNA的非同位素逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测了72例大肠癌患者术前和术后不同时间外周血中微转移情况，从临床化疗疗效和分子水平着重分析了术后化疗后微转移不消退的相关因素。
资料与方法
, 百拇医药
1.一般临床资料：72例大肠癌患者，平均年龄56.41岁，男44例，女28例。于术前、术后3天内和术后早期短程化疗(术后第3天开始，化疗第1天用表阿霉素50～70 mg，第2天用丝裂霉素8～10 mg,第1～10天用喃呋啶1.0 g)结束后,分别从外周静脉抽取(注射器经焦碳酸二乙酯水处理，去除RNA酶)5 ml血液。手术切除后，立即取小块肿瘤组织行液氮速冻备检。
2.癌组织DNA提取。按常规酚-氯仿-异戊醇抽提基因组DNA[2]，三羟甲基氨基早烷-乙二胺四乙酸缓冲液溶解，4 ℃存放备用。
3.外周血CK20的检测：(1)按文献报道基因序列[1]合成CK20引物。CK20正义：5′-CAGACACACGGTGAACTATGG-3′,反义：5′-GATCAGCTTCCACTGTTA-
GACG-3′，扩增片段长度370 bp。(2)根据我们以前报道的方法[3]，进行总RNA提取、cDNA合成及RT-PCR。设计β2-MG作为内参对照。
, 百拇医药
4.癌组织c-erbB-2扩增:(1)参照文献[4]的序列合成c-erbB-2引物,扩增片段长度98 bp。序列:上游引物:5′-CCTCTGACGTCCATCATCTC-3′;下游引物:5′-ATCTTCTGCTGCCGTCGCTT-3′。(2)差异PCR 按文献[4]的方法进行,其中以β-actin为内参对照。
5.癌组织p53突变基因的检测：采用PCR-SSCP银染改进方法[5]。
6.癌组织bcl-2表达的检测：参照文献[6]的方法进行，bcl-2单克隆抗体为Dako公司产品。
结果
1.外周血CK20阳性检出率：本组72例患者，外周血中查出CK20 mRNA阳性表达42例，阳性率58.3%;术后3天内外周血CK20阳性表达47例，较术前多5例；术后早期短程化疗结束后, 阳性检出仅25例，22例转阴。
, 百拇医药
2.化疗后外周血微转移未转阴者的临床病理特征：47例化疗前外周血存在微转移者，使用化疗后未转阴病例与临床病理特征见表1。
表1 化疗后外周血微转移未转阴患者的临床病理特征 病理特征
化疗前阳性
病例(例数)
化疗后未转阴病例
P值
例数
%
分化程度
高分化
13
, 百拇医药
6
46.2
中分化
24
13
54.2
>0.05
低分化
10
6
60.0
Dukes分期
A
, 百拇医药
2
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41.7
C
21
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>0.05
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, 百拇医药
7
58.3
c-erbB-2扩增
阴性
阳性
8
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50.0
53.8
>0.05
p53突变
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阴性
阳性
26
21
10
15
38.5
71.4
<0.05
bcl-2表达
阴性
阳性
14
, http://www.100md.com
33
4
21
28.6
63.6
<0.05
从表1可知，化疗后未转阴者与其癌组织分化程度、Dukes分期、c-erbB-2扩增无显著相关，各组间差别无显著性意义，但与癌组织p53突变及bcl-2表达有显著相关性，各组间差异有显著性意义(P<0.05)。
讨论
RT-PCR法具有病理组织学和免疫细胞化学技术不可比的敏感性，可以从106～107个正常组织细胞中检出一个肿瘤细胞[7]，因而尤其适用于微量肿瘤细胞的检测。我们以前建立的非核素RT-PCR法，简便、快捷，避免了核素使用的多种限制，更易被推广应用，从而保证了本实验结果的可靠性。
, 百拇医药
肿瘤细胞生物学特性研究证实，原发肿瘤切除后，由于反馈的关系，G0期细胞大量进入增殖期，转移肿瘤细胞倍增时间缩短，生长迅速，而且术后早期负荷最小，对化疗也最敏感[8]。因此，如果患者一般情况允许，化疗的实施宜尽早开始。本研究发现，术后早期短程化疗结束后，46.8%(22/47)患者外周血中癌细胞被消除。表明，术后早期短程化疗对控制大肠癌微转移具有一定的作用，无疑有助于改善患者的预后。但是辅助性化疗并非对所有患者都有益，部分患者化疗无效。本实验就观察到53.2%(25/47)的患者对术后早期短程化疗无效。
本组病例对化疗的反应性与其肿瘤的c-erbB-2扩增、分化程度和Dukes分期无显著相关性，但在Dukes分期中，A期的微转移未转阴率较低(0/2)，但统计学上未见显著性差别，这不除外标本数较少的因素。早期癌肿瘤细胞群体的密度较小，增殖速度较快，处于增殖期的细胞较多，是其对化疗敏感的主要原因。说明，大肠癌分化程度、c-erbB-2扩增与患者外周血微转移对化疗的敏感性无明显相关性，临床指导意义不大。
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p53与bcl-2均是细胞凋亡的重要调控基因，目前许多抗肿瘤药物(如5-FU、羟基喜树碱)亦是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其治疗作用的。表达bcl-2基因的癌细胞对放疗、化疗等常规凋亡诱导剂有明显耐受[9]，有p53基因突变的患者对5-FU不敏感，临床预后亦较差[10]。目前认为5-FU为大肠癌化疗的基础用药。本研究从大肠癌患者外周血微转移对术后早期短程辅助化疗(包括5-FU类药物在内的三药联合)的反应的观察发现，癌组织bcl-2表达阳性和p53突变的大肠癌患者外周血微转移对这种联合化疗不敏感，微转移消退较少。所以，对这类患者选择合理的辅助性治疗药物就显得十分必要。研究大肠癌患者外周血微转移对化疗的反应及其与相关基因的关系，为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供了新的靶分子，对这类病例选择相应的基因治疗手段(如bcl-2反义寡核苷酸、反义RNA、核酶-Ribozyme、野生型p53导入、p53反义RNA等)不失为一种更具针对性的治疗途径或有前途的替代化疗的补充治疗方式。
参考文献
, 百拇医药
1 Burchill SA, Bradbury MF, Pittman K, et al.Detection of epithelial cancer cells in peripheral blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Br J Cancer,1995,71:278-281.
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:laboratory manuals.2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.463-493.
3 骆成玉，祝学光，王申五.大肠癌中p53基因mRNA表达的定量研究. 中华实验外科杂志，1996, 13:157-159.
4 Gramlich TL, Cohen C, Fritsch C, et al.Evaluation of c-erbB-2 amplification in breast carcinoma by differential polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol, 1994, 101:493-496.
, http://www.100md.com
5 薛涛，祝学光，骆成玉,等.应用PCR-SSCP银染技术检测结直肠癌p53基因突变.中华实验外科杂志，1996, 13:21-22.
6 骆成玉，詹新恩，姜军.乳腺癌组织中T细胞亚群分布的观察与分析.中华实验外科杂志，1992，9：219.
7 Datta YH, Adams PT, Drobyki WR, et al.Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse trans criptase-polymerase chain reaction.J Clin Oncol,1994,12:475-483.
8 张天泽.手术后辅助化疗.见：韩锐,主编.肿瘤化学预防及药物治疗.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.771-779.
, 百拇医药
9 Hsu B, Marin MC, Brisbay S, et al. Expression of bcl-2 gene confers multidrug resistance to chemotherapy-induced cell death. Cancer Bull, 1994, 46:125-128.
10 Benhattar J, Cerottini TP, Saraga E, et al. p53 mutations as a possible predictor of response to chemotherapy in metastatic colorectal carcinomas. Int J Cancer,1996,57:190-194.
(收稿：1998-11-12 修回：1999-03-12), 百拇医药