迷走神经刺激术对脑干组织孤束核部位氨基酸水平的影响
作者：韩劲松 李明 陈炳桓
单位：韩劲松(北京市第四医院神经科 100062)；李明(北京市天坛医院神经外科)；陈炳桓(北京市神经外科研究所)
关键词：迷走神经刺激术；孤束核；氨基酸
摘 要 目的
摘 要 目的：探讨迷走神经刺激术(VNS)抗癫痫作用的机制是否为VNS引起孤束核部位氨基酸含量变化。方法：通过Waters高效液相色谱系统分析32只接受不同参数迷走神经刺激大鼠脑干孤束核部位主要兴奋及抑制性氨基酸含量的变化。结果：1小时持续刺激组孤束核部位GABA含量较对照组升高且差异有显著意义。结论：迷走神经刺激术可能通过升高孤束核部位的GABA含量起到抗癫痫作用。
迷走神经刺激术(VNS)在动物实验基础上通过临床应用表明其为安全， 可耐受， 有一定疗效治疗的癫痫的新方法。但VNS的抗痫机制尚不十分清楚。有学者提出VNS可能引起人广泛的γ-氨基丁酸(GABA)与甘氨酸的分泌而提高了癫痫阈值而产生抗痫作用。我们对经过迷走神经刺激的32只Waster大鼠的脑干(孤束核)部位组织内主要的兴奋性及抑制性氨基酸含量变化进行了分析， 为探讨迷走神经刺激术的机制提供依据， 现将结果报告如下：
, 百拇医药
材 料 与 方 法
一、 实验对象：32只Wiater大鼠， 雌雄各半， 体重280～320克(购自中国医学科学院试验动物研究所)， 经抽签法随机分为4组。
二、 实验材料：
1.动物实验：脉冲刺激仪， 手术板及相应手术器械， 10%水合氯醛， 记时器， 色谱纯甲醇， 离心器。
2.氨基酸分析：Wistar高效液相色谱系统(510泵两台， 470荧光检测器1台， U6K手动进样器一台， 柱温箱一台， 810色谱工作站)。试剂：ACCQ-Tag衍生试剂盒购自Wistar公司， 色谱春乙氰购自天津四友公司EDTA， 三乙胺， 无水醋酸钠， 磷酸等均为国产分析纯试剂。
三、 实验方法：
, 百拇医药 1.动物实验：手术：将大鼠仰卧固定于手术板， 10%水合氯醛麻醉(400mg/kg)， 颈正中切开皮肤， 用显微镊小心将迷走神经与颈总动脉分离， 游离一段迷走神经， 将刺激仪电极的双极导线细丝环绕迷走神经。
刺激：刺激波形为方波， 波宽3ms， 频率100HZ， 10V。在本研究中动物分为四组：①假手术组：分离迷走神经并与刺激电极连接， 但不给予刺激。②30秒刺激组， 分离迷走神经与刺激电极连接并给予30秒刺激。③1小时间断刺激组：分离迷走神经与刺激电极连接并给予30秒刺激， 间断5分钟， 再给予30秒刺激， 如此反复进行至1小时。④1小时持续刺激组：分离迷走神经并与刺激电极连接， 持续1小时刺激。
取材：实验结束后， 给予动物注射过量水合氯醛处死(1000mg/kg)， 立刻断头取脑， 在脑干延髓孤束核区域取一小块脑组织称重后， 加入1000μl色谱纯甲醇， 迅速在冰浴中匀浆， 并用500μl色谱纯甲醇冲洗匀浆管， 将匀浆管液和冲洗液均收集在1ml离心管中， 2000r/min， 4℃离心1分钟， 去上清， 在沉淀内加入500μl甲醇， 再离心， 收集上清， 重复一次， 将所有上清混合， 总量为2500μl， 在-80℃下保存。
, 百拇医药
2.氨基酸分析：
利用Waters高效液相色谱系统分析上述保存材料。
3.统计学处理：
在本色谱条件下， 能够实现对谷氨酸和甘氨酸， 天门冬氨酸， γ-氨基丁酸(GABA)的分离， 数据以平均值±标准差表示， 使用SPSS统计软件进行方差分析和t检验。
实 验 结 果
一、 色谱分离情况
在本色谱条件下， 能够实现对天门冬氨酸、 谷氨酸、 甘氨酸和γ-氨基丁酸的分离。其中， 天门冬氨酸保留时间为11.45分钟。谷氨酸保留时间为14.34分钟。甘氨酸保留时间21.04分钟。GABA保留时间为31.68分钟。上述四种待测氨基酸均可实现基线分离。
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二、 实验组指标测定结果：
表1 假手术组氨基酸含量测定结果
ASP
GLU
GLY
GABA
1
2.558402
8.46346
1.041677
1.472807
2
, 百拇医药
2.64452
9.611308
1.256307
1.951498
3
2.106037
11.02811
0.991318
1.497224
4
2.188453
10.46462
, 百拇医药
1.058668
1.88278
5
2.659299
10.35785
1.135905
1.733502
6
2.700727
8.280318
1.001333
1.568585
, 百拇医药
7
2.874029
12.20832
0.87303
1.789016
8
2.455234
11.56893
1.2288342
1.705632
平均值
2.52333
, 百拇医药
10.25912
1.073322
1.70013
标准差
0.261801
1.412288
0.127991
0.175557
表2 1小时持续刺激组氨基酸含量测定结果：
ASP
GLU
GLY
, http://www.100md.com
GABA
1
2.848907
10.15712
1.106457
3.119083
2
2.309672
9.644072
0.906492
2.879109
3
, http://www.100md.com 2.118039
10.99678
1.088159
2.97722
4
2.199849
8.780497
0.890165
3.648517
5
2.611198
10.75129
, 百拇医药
1.078535
3.17032
6
2.423798
11.52051
1.065364
2.876898
7
3.097911
8.241088
1.163022
3.027472
, http://www.100md.com
8
2.920108
12.14671
1.291325
3.49271
平均值
2.574935
10.281010
1.073715
3.148916
标准差
0.349
, http://www.100md.com
1.341324
0.130035
0.282883
结 果 分 析
数据以平均值±SD表示。经SPSS统计软件分析， 可见在经历1小时持续迷走神经刺激后， 脑干区域GABA含量明显上升(P<0.05)。30秒及1小时间断迷走神经刺激引起的GABA变化与假手术组相比未见统计学差异。同样， 实验组其它氨基酸变化与假手术组相比亦未见统计学差异。
讨 论
脑内兴奋性/抑制性神经传导系统的失衡是癫痫产生的生化基础， 大量的动物实验和临床研究证实， 癫痫灶内γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的丢失和GABA含量的下降并存， 戊四氮(pentylenetetrazo,PTZ)是一种GABA依赖的氯离子通道阻滞剂， 三硫基丙酸(3-MP)是谷的氨酸脱羧酶抑制剂， 这两种药物引起的动物癫痫是以降低GABA能神经元功能为基础的， 而VNS可控制和减轻这两种药物引起的动物癫痫发作， 因而推测VNS是通过促进GABA释放来发挥抗癫痫作用的[1]。
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孤束核(NTS)是迷走神经的一个重要终止部位， 占迷走神经大部分的感觉纤维将头颈及内脏的感觉信息投射孤束核发， 孤束核发出一部分纤维止于脑干及脊髓的运动核完成各种内脏反射， 另解剖学证实NTS与前脑边缘系统存在内在的联系， 兴奋性路线从NTS上升投射到广泛的脑干以上区域， 如中脑、 前脑， 双侧边缘系统许多核团， 其中受到直接投射的部位为岛叶， 杏仁核， 丘脑的侧室壁部分， 无名质终纹等。通过这些通路发出至皮层的信息调整皮层的活动， 另外NTS可能通过调整脑干一些对癫痫有控制作用的核团发挥抗癫痫作用。
最近Tery等应用2-脱氧葡萄糖进行代谢研究发现高频迷走神经刺激造成NTS区葡萄糖代谢减低[2]， 而Benjamin等通过显微注射GABA能递质于孤束核发现可以控制由PTZ脑局部注射而诱发的SD大鼠的肢体抽搐发作[3]。因此我们对VNS抗癫痫机制的设想为VNS通过NTS抑制控制癫痫发作。NTS发出广泛的纤维与脑干以上广泛区域及脑干运动核联系， 在抗癫痫作用中的具体机制可能是通过各种方式降低了大脑兴奋性或者说增加了癫痫的阈值。基于冯周琴等研究发现Wister大鼠VNS以脉宽1ms、 2ms、 3ms频率100HZ， 10V时反应最好， 可瞬时完全抑制士的宁引起的强直性阵挛发作和痫样放电[4]， 本实验采用100HZ， 10V， 2ms并对30秒及1小时间断和1小时持续刺激下的脑干氨基酸的变化进行了分析。发现1小时持续刺激组GABA含量增高， 而30秒及1小时间断刺激组变化较假手术组无统计学差异。这一结果表明VNS可以引起NTS部位GABA含量升高， 高度提示VNS通过抑制NTS而控制癫痫发作， 但是短时间以及间断的刺激未见GABA含量升高， 既往动物实验及临床应用表明VNS既可中止或减轻即将产生的癫痫作用也可在VNS之后一段时间内减少或减轻癫痫发作[5～6]， 我们的结果提示长期刺激迷走神经后停止刺激一段时间仍有抗癫痫作用与AGBA含量升高有关， 而VNS立即终止癫痫发作可能是改变其它部位的氨基酸含量或其它作用的机制。本实验刺激参数单一， 取材部位少， 这一结果有待进一步研究。
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另外兴奋性与抑制性神经系统失衡是癫痫形成的基础， 而兴奋性氨基酸在脑的发育过程中参与脑的可塑性与兴奋性调节， 在病理状态， 兴奋性氨基酸受体参与癫痫的形成。所以癫痫病人兴奋性氨基酸含量减少有可能是癫痫得到良好控制的原因。我们的实验未发现孤束核部位天门冬氨酸和谷氨酸含量变化， 由于本实验的刺激参数单一， 取材部位少， 待进一步实验研究VNS是否通过降低脑内兴奋性氨基酸含量起到抗癫痫作用。
总之， 通过本实验结果表明VNS可引起脑干内孤束核(NTS)部位GABA含量增高， 支持VNS通过抑制NTS而控制癫痫发作这一假设机制； 同时未发现NTS部位兴奋性氨基酸含量减少， 今后通过增多刺激参数变化和不同的取材部位， 以及应用微透析技术， 会使VNS引起脑内氨基酸含量变化的研究更加科学完善。
参考文献
1，Schachter SC,Saper CB.progress in epilepsy research:vagus stimulation.Epilepsia,1998;39(7)∶677～686.
, 百拇医药
2，Terry WJ,Takaya M,Naritoku DK.Regional changes in brain glucose metabolism in rats following anticonvulsant stimulation of the vagus nerve.Epilepsia 1996;37∶117.
3，Walker BR,Easton A,Gale K.Regulation of limbic motor seizures by GABA and glutamate transmission in tractus solitarius.Epilepsia,1999; 40(8)∶1051～1057.
4，冯周琴，徐军，党雷，等.刺激迷走神经治疗癫痫的实验与临床观察.河南医学研究.1995；4(1)∶3～5.
5，韩劲松，陈炳桓.迷走神经刺激术控制癫痫发作.中国医药导刊.2000，2(2)∶41～43.
6，Takaya M,Terry WJ,Naritoku DK.Vagus nerve stimulation induces a sustained anticonvulsant effect.Epilepsia,1996;37(11)∶1111～1116.
收稿日期：2000-06-13, http://www.100md.com
单位：韩劲松(北京市第四医院神经科 100062)；李明(北京市天坛医院神经外科)；陈炳桓(北京市神经外科研究所)
关键词：迷走神经刺激术；孤束核；氨基酸
摘 要 目的
摘 要 目的：探讨迷走神经刺激术(VNS)抗癫痫作用的机制是否为VNS引起孤束核部位氨基酸含量变化。方法：通过Waters高效液相色谱系统分析32只接受不同参数迷走神经刺激大鼠脑干孤束核部位主要兴奋及抑制性氨基酸含量的变化。结果：1小时持续刺激组孤束核部位GABA含量较对照组升高且差异有显著意义。结论：迷走神经刺激术可能通过升高孤束核部位的GABA含量起到抗癫痫作用。
迷走神经刺激术(VNS)在动物实验基础上通过临床应用表明其为安全， 可耐受， 有一定疗效治疗的癫痫的新方法。但VNS的抗痫机制尚不十分清楚。有学者提出VNS可能引起人广泛的γ-氨基丁酸(GABA)与甘氨酸的分泌而提高了癫痫阈值而产生抗痫作用。我们对经过迷走神经刺激的32只Waster大鼠的脑干(孤束核)部位组织内主要的兴奋性及抑制性氨基酸含量变化进行了分析， 为探讨迷走神经刺激术的机制提供依据， 现将结果报告如下：
, 百拇医药
材 料 与 方 法
一、 实验对象：32只Wiater大鼠， 雌雄各半， 体重280～320克(购自中国医学科学院试验动物研究所)， 经抽签法随机分为4组。
二、 实验材料：
1.动物实验：脉冲刺激仪， 手术板及相应手术器械， 10%水合氯醛， 记时器， 色谱纯甲醇， 离心器。
2.氨基酸分析：Wistar高效液相色谱系统(510泵两台， 470荧光检测器1台， U6K手动进样器一台， 柱温箱一台， 810色谱工作站)。试剂：ACCQ-Tag衍生试剂盒购自Wistar公司， 色谱春乙氰购自天津四友公司EDTA， 三乙胺， 无水醋酸钠， 磷酸等均为国产分析纯试剂。
三、 实验方法：
, 百拇医药 1.动物实验：手术：将大鼠仰卧固定于手术板， 10%水合氯醛麻醉(400mg/kg)， 颈正中切开皮肤， 用显微镊小心将迷走神经与颈总动脉分离， 游离一段迷走神经， 将刺激仪电极的双极导线细丝环绕迷走神经。
刺激：刺激波形为方波， 波宽3ms， 频率100HZ， 10V。在本研究中动物分为四组：①假手术组：分离迷走神经并与刺激电极连接， 但不给予刺激。②30秒刺激组， 分离迷走神经与刺激电极连接并给予30秒刺激。③1小时间断刺激组：分离迷走神经与刺激电极连接并给予30秒刺激， 间断5分钟， 再给予30秒刺激， 如此反复进行至1小时。④1小时持续刺激组：分离迷走神经并与刺激电极连接， 持续1小时刺激。
取材：实验结束后， 给予动物注射过量水合氯醛处死(1000mg/kg)， 立刻断头取脑， 在脑干延髓孤束核区域取一小块脑组织称重后， 加入1000μl色谱纯甲醇， 迅速在冰浴中匀浆， 并用500μl色谱纯甲醇冲洗匀浆管， 将匀浆管液和冲洗液均收集在1ml离心管中， 2000r/min， 4℃离心1分钟， 去上清， 在沉淀内加入500μl甲醇， 再离心， 收集上清， 重复一次， 将所有上清混合， 总量为2500μl， 在-80℃下保存。
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2.氨基酸分析：
利用Waters高效液相色谱系统分析上述保存材料。
3.统计学处理：
在本色谱条件下， 能够实现对谷氨酸和甘氨酸， 天门冬氨酸， γ-氨基丁酸(GABA)的分离， 数据以平均值±标准差表示， 使用SPSS统计软件进行方差分析和t检验。
实 验 结 果
一、 色谱分离情况
在本色谱条件下， 能够实现对天门冬氨酸、 谷氨酸、 甘氨酸和γ-氨基丁酸的分离。其中， 天门冬氨酸保留时间为11.45分钟。谷氨酸保留时间为14.34分钟。甘氨酸保留时间21.04分钟。GABA保留时间为31.68分钟。上述四种待测氨基酸均可实现基线分离。
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二、 实验组指标测定结果：
表1 假手术组氨基酸含量测定结果
ASP
GLU
GLY
GABA
1
2.558402
8.46346
1.041677
1.472807
2
, 百拇医药
2.64452
9.611308
1.256307
1.951498
3
2.106037
11.02811
0.991318
1.497224
4
2.188453
10.46462
, 百拇医药
1.058668
1.88278
5
2.659299
10.35785
1.135905
1.733502
6
2.700727
8.280318
1.001333
1.568585
, 百拇医药
7
2.874029
12.20832
0.87303
1.789016
8
2.455234
11.56893
1.2288342
1.705632
平均值
2.52333
, 百拇医药
10.25912
1.073322
1.70013
标准差
0.261801
1.412288
0.127991
0.175557
表2 1小时持续刺激组氨基酸含量测定结果：
ASP
GLU
GLY
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GABA
1
2.848907
10.15712
1.106457
3.119083
2
2.309672
9.644072
0.906492
2.879109
3
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10.99678
1.088159
2.97722
4
2.199849
8.780497
0.890165
3.648517
5
2.611198
10.75129
, 百拇医药
1.078535
3.17032
6
2.423798
11.52051
1.065364
2.876898
7
3.097911
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8
2.920108
12.14671
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3.49271
平均值
2.574935
10.281010
1.073715
3.148916
标准差
0.349
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1.341324
0.130035
0.282883
结 果 分 析
数据以平均值±SD表示。经SPSS统计软件分析， 可见在经历1小时持续迷走神经刺激后， 脑干区域GABA含量明显上升(P<0.05)。30秒及1小时间断迷走神经刺激引起的GABA变化与假手术组相比未见统计学差异。同样， 实验组其它氨基酸变化与假手术组相比亦未见统计学差异。
讨 论
脑内兴奋性/抑制性神经传导系统的失衡是癫痫产生的生化基础， 大量的动物实验和临床研究证实， 癫痫灶内γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的丢失和GABA含量的下降并存， 戊四氮(pentylenetetrazo,PTZ)是一种GABA依赖的氯离子通道阻滞剂， 三硫基丙酸(3-MP)是谷的氨酸脱羧酶抑制剂， 这两种药物引起的动物癫痫是以降低GABA能神经元功能为基础的， 而VNS可控制和减轻这两种药物引起的动物癫痫发作， 因而推测VNS是通过促进GABA释放来发挥抗癫痫作用的[1]。
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孤束核(NTS)是迷走神经的一个重要终止部位， 占迷走神经大部分的感觉纤维将头颈及内脏的感觉信息投射孤束核发， 孤束核发出一部分纤维止于脑干及脊髓的运动核完成各种内脏反射， 另解剖学证实NTS与前脑边缘系统存在内在的联系， 兴奋性路线从NTS上升投射到广泛的脑干以上区域， 如中脑、 前脑， 双侧边缘系统许多核团， 其中受到直接投射的部位为岛叶， 杏仁核， 丘脑的侧室壁部分， 无名质终纹等。通过这些通路发出至皮层的信息调整皮层的活动， 另外NTS可能通过调整脑干一些对癫痫有控制作用的核团发挥抗癫痫作用。
最近Tery等应用2-脱氧葡萄糖进行代谢研究发现高频迷走神经刺激造成NTS区葡萄糖代谢减低[2]， 而Benjamin等通过显微注射GABA能递质于孤束核发现可以控制由PTZ脑局部注射而诱发的SD大鼠的肢体抽搐发作[3]。因此我们对VNS抗癫痫机制的设想为VNS通过NTS抑制控制癫痫发作。NTS发出广泛的纤维与脑干以上广泛区域及脑干运动核联系， 在抗癫痫作用中的具体机制可能是通过各种方式降低了大脑兴奋性或者说增加了癫痫的阈值。基于冯周琴等研究发现Wister大鼠VNS以脉宽1ms、 2ms、 3ms频率100HZ， 10V时反应最好， 可瞬时完全抑制士的宁引起的强直性阵挛发作和痫样放电[4]， 本实验采用100HZ， 10V， 2ms并对30秒及1小时间断和1小时持续刺激下的脑干氨基酸的变化进行了分析。发现1小时持续刺激组GABA含量增高， 而30秒及1小时间断刺激组变化较假手术组无统计学差异。这一结果表明VNS可以引起NTS部位GABA含量升高， 高度提示VNS通过抑制NTS而控制癫痫发作， 但是短时间以及间断的刺激未见GABA含量升高， 既往动物实验及临床应用表明VNS既可中止或减轻即将产生的癫痫作用也可在VNS之后一段时间内减少或减轻癫痫发作[5～6]， 我们的结果提示长期刺激迷走神经后停止刺激一段时间仍有抗癫痫作用与AGBA含量升高有关， 而VNS立即终止癫痫发作可能是改变其它部位的氨基酸含量或其它作用的机制。本实验刺激参数单一， 取材部位少， 这一结果有待进一步研究。
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另外兴奋性与抑制性神经系统失衡是癫痫形成的基础， 而兴奋性氨基酸在脑的发育过程中参与脑的可塑性与兴奋性调节， 在病理状态， 兴奋性氨基酸受体参与癫痫的形成。所以癫痫病人兴奋性氨基酸含量减少有可能是癫痫得到良好控制的原因。我们的实验未发现孤束核部位天门冬氨酸和谷氨酸含量变化， 由于本实验的刺激参数单一， 取材部位少， 待进一步实验研究VNS是否通过降低脑内兴奋性氨基酸含量起到抗癫痫作用。
总之， 通过本实验结果表明VNS可引起脑干内孤束核(NTS)部位GABA含量增高， 支持VNS通过抑制NTS而控制癫痫发作这一假设机制； 同时未发现NTS部位兴奋性氨基酸含量减少， 今后通过增多刺激参数变化和不同的取材部位， 以及应用微透析技术， 会使VNS引起脑内氨基酸含量变化的研究更加科学完善。
参考文献
1，Schachter SC,Saper CB.progress in epilepsy research:vagus stimulation.Epilepsia,1998;39(7)∶677～686.
, 百拇医药
2，Terry WJ,Takaya M,Naritoku DK.Regional changes in brain glucose metabolism in rats following anticonvulsant stimulation of the vagus nerve.Epilepsia 1996;37∶117.
3，Walker BR,Easton A,Gale K.Regulation of limbic motor seizures by GABA and glutamate transmission in tractus solitarius.Epilepsia,1999; 40(8)∶1051～1057.
4，冯周琴，徐军，党雷，等.刺激迷走神经治疗癫痫的实验与临床观察.河南医学研究.1995；4(1)∶3～5.
5，韩劲松，陈炳桓.迷走神经刺激术控制癫痫发作.中国医药导刊.2000，2(2)∶41～43.
6，Takaya M,Terry WJ,Naritoku DK.Vagus nerve stimulation induces a sustained anticonvulsant effect.Epilepsia,1996;37(11)∶1111～1116.
收稿日期：2000-06-13, http://www.100md.com