钙调神经磷酸酶活性测定
作者：符民桂 唐朝枢
单位：符民桂(北京医科大学第一医院心血管研究所,北京 100034)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所,北京 100034)
关键词：钙调神经磷酸酶；活性；钙离子；钙调素
中国动脉硬化杂志000124[摘 要] 钙调神经磷酸酶是一种钙离子敏感的蛋白磷酸酶，广泛分布于包 括心脏在内的全身组织中，参与多种生物功能的调节。本文对四种钙调神经磷酸酶活性测定 法的原理、操作要点及其特点进行简要综述。
[中图分类号] Q55 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0082-02
钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员(又称蛋白磷酸 酶2B，PP2B)，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。 1979年最先从脑组织中发现, 目前认为CaN广泛分布于全身组织, 参与多种细胞功能的调节 [1]。CaN在 细胞因子介导的T细胞活化中起到调节枢纽的作用[2]，在神经递质的释放、突触可 塑性方面亦具有重要的调节作用[3]。新近的研究表明，CaN介导的信号通路在心肌 肥大的发生 发展中可能起到中心作用[4,5]，因此CaN的研究受到基础及临床科学家的 广泛关注。本文对CaN活性测定法进行简要综述。
, 百拇医药
1 发色底物法
根据Pallen等[6]方法进行改良。该法的原理基于两点：①CaN在体外能水解对 硝基磷酸酚小分子底物，水解下的对硝基酚可直接生色；②CaN是体内唯一 受Ca2+/CaM活化的磷酸酶，Ca2+和CaM存在 时与不存在时的磷酸酶活力之差代表CaN活力。
测定方法：总反应体积为400 μL，由20 μL待测提取液和380 μL底物I液或II 液组成 。底物I液含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、0.5 mmol/L DDT、0.2 g/L BSA、10 mmol/L PN PP、2 mmol/L CaCl2及0.3 μmol/L CaM。底物II液含3 mmol/L EGTA，不含CaCl2和 CaM外，其余成分同底物I液。测定时取待测提取液20 μL与底物液380 μL，30℃保温30 mi n，立即加入13%K2HPO4 50 μL终止反应，在分光光度计上410 nm读取吸光度，以空白 底物液调零,每样本的底物I液测出的为CaN和其它磷酸酶的总活力；底物II液测出的仅是其 它磷酸酶活力，二者之差即CaN活力。应用标准CaN(0.5～5 ku/L)作标准曲线，同时用考马 斯亮兰法对样本进行蛋白定量，结果以比活力(ku/g.protein)表示。
, 百拇医药
该法简便而且较稳定，可重复性强。但实验测得的是CaN对磷酸酪氨酸小分子底物的水 解活力，只能间接反映其在体内对丝/苏氨酸蛋白底物的活力。另外，该法特异性较差。
2 放射性同位素法
参考文献[7]方法进行，该法的原理基于两点：①cAMP依赖的蛋白激酶调节亚单位(RII)是 CaN的一种较专 一的底物，且受其它蛋白磷酸酶(磷酸酶1和磷酸酶2A)的影响较少。应用同位素32P 标记RII亚单位，根据释放的32P的多少测定样本中CaN活力；②CaN是目前已知的 唯一对Ca2+依赖、对Okadaic acid(磷酸酶1和磷酸酶2A特异抑制剂)不敏感的磷酸 酶，加入Ca2+和Okadaic acid后可进一步提高该法的特异性。
测定方法：底物肽的序列是与cAMP依赖的蛋白激酶调节亚单位(RII)相应的一段序列， 由Asp-Leu-Asp-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-Ser-Val-Ala-Ala-Glu组 成。可应用蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和[r-32P]ATP对底物肽进行标记， 制备成32P 标记的底物肽。测定时取20 μL待测提取液与40 μL测定缓冲液[含 20 mmol/L Tris(pH 8 .0)、100 mmol/L NaCl、6 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DDT、0.1 g/L BSA、0.1 mmol/L C aCl2、5 μmol/L 32 P标记的底物肽和500 nmol/L Okadaic acid]混合，30℃孵 育15 min，加入100 mmol/L (pH 7.0)磷酸钾缓冲液(含5%三氯乙酸)0.5 mL终止反应。游离的无机磷经Dowex阳离子交 换层析柱分离，液闪计数。所测值减去不含酶的空白测定值为实测值。
, 百拇医药
本法敏感性高，特异性强，是目前最常用的方法。但步骤较复杂，底物肽需特约合成， 没有商品试剂供应。
3 高效液相色谱法
参照文献[8]方法进行，该法的原理是：磷酸化和去磷酸化的底物肽在高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)上的层析行为不 同，因此可借助HPLC分别对磷酸化和去磷酸化的底物肽进行定量，以测定CaN活力。
所用底物肽同前，但直接用ATP和蛋白激酶使底物肽磷酸化，反应在150 μL反应液[含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、0.1 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L DDT、0.01% Brij、 0.3 g/ L BSA、0.1 μmol/L CaM、1 mmol/L MnCl2及1 mmol/L CaCl2]中进行，反应混合物在 30℃预 育15 min ，加入底物(5～200 μmol/L)，在不同时间(2、4、6、10 min)取出20 μL反 应液，并 加0.5%高氯酸70 μL(含0.1%Triton X-100和10 mmol/L羧苯磺胺)，取上清40 μL上HPLC柱 ，酶活性可根据最初6 min的产物线性图求出。
, 百拇医药
该法具有与放射性同位素法同样的敏感性，非放射性标记的底物肽更稳定，更易于储存 ，适于大规模筛选性实验和酶促动力学的检测。
4 其它
Martin等[9]直接应用从Promaga公司获得的磷酸酶测定试剂盒，通过监测无机 磷从磷酸 化的底物肽中释放的量来测定CaN活性。无机磷应用一种malachite green dye方法来检测 。所使用的底物肽为Arg-Arg-Ala-Thr(P)-Val-Ala。反应在Spectramax 250微孔板中进行， 总反应体积为50 μL。反应液含25 mmol/L MOPS(pH 7.0)、1.0 mmol/L MnCl2、20 m g/ L CaM、20 mg/L CaN及1.0 mmol/L底物肽。30℃反应15 min，加入50 μL dye reagent， 孵育10 min， 在630 nm测定吸光度。但此法只能在纯化体系中进行，不能检测样品粗提液中的酶活性。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39730220)
[作者简介] 符民桂，男，35岁，博士研究生。主要研究方 向为“心血管细胞增殖的信号传递机制”。
参考文献
[1] Cuerini D. Calcineurin: not just a simple protein phosphatase [J]. Biochem Biophys Res Commol/Lun, 1997, 235 : 271-275
[2] Klee CB, Ren H, Wang X. Regulation of the calmodulin-stimulat ed p rotein phosphatase, calcineurin [J]. J Biol Chem, 1 998, 273: 13 367-370
, http://www.100md.com
[3] Yakel JL. Calcineurin regulation of synapic function: from io n channels to tr ansmitter release and gene transcription [J]. Trends Pharmcol Sc i, 1997, 18: 124-133
[4] Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin dependent tra nscriptional pathway for cardiac hypertrophy [J]. Cell, 1998, 93: 215-228
[5] Olson EN, Molkentin JD. Prevention of cardiac hypertrophy by calcineurin inhibition: hope or hype[J]? Circ Res, 1 999, 84: 623-632
, 百拇医药
[6] Pallen CJ,Wang JH. Calmodulin-stimulated dephosphorylatio n of p-Nireopheny l phosphate and free phosphotyrosine by calcineurin [J]. J Biol C hem, 1983, 258: 8 550-553
[7] Fruman DA, Klee CB, Bierer BE, et al. Calcineurin phosphatas e activity in T l ymphocytess is inhibited by FK506 and cyclosporin A [J]. Proc Nat l Acad Sci, 1992, 89: 3 686-690
[8] Enz A, Shapiro G, Chappuis A, et al. Nonradioactive assay for protein phosphat ase 2B (calcineurin) activity using a ppartial sequence of the subunit of cAMP- dependent protein kinase as substrate [J]. Anal Biochem, 1994, 216: 147-153
[9] Martin BL. Inhibition of calcineurin by the tyrphostin cl ass of tyrposin kinase inhibitors [J]. Biochem Pharmacol, 1998, 56: 483-488
(此文1999-07-23收到， 2000-02-15修回), 百拇医药
单位：符民桂(北京医科大学第一医院心血管研究所,北京 100034)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所,北京 100034)
关键词：钙调神经磷酸酶；活性；钙离子；钙调素
中国动脉硬化杂志000124[摘 要] 钙调神经磷酸酶是一种钙离子敏感的蛋白磷酸酶，广泛分布于包 括心脏在内的全身组织中，参与多种生物功能的调节。本文对四种钙调神经磷酸酶活性测定 法的原理、操作要点及其特点进行简要综述。
[中图分类号] Q55 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0082-02
钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员(又称蛋白磷酸 酶2B，PP2B)，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。 1979年最先从脑组织中发现, 目前认为CaN广泛分布于全身组织, 参与多种细胞功能的调节 [1]。CaN在 细胞因子介导的T细胞活化中起到调节枢纽的作用[2]，在神经递质的释放、突触可 塑性方面亦具有重要的调节作用[3]。新近的研究表明，CaN介导的信号通路在心肌 肥大的发生 发展中可能起到中心作用[4,5]，因此CaN的研究受到基础及临床科学家的 广泛关注。本文对CaN活性测定法进行简要综述。
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1 发色底物法
根据Pallen等[6]方法进行改良。该法的原理基于两点：①CaN在体外能水解对 硝基磷酸酚小分子底物，水解下的对硝基酚可直接生色；②CaN是体内唯一 受Ca2+/CaM活化的磷酸酶，Ca2+和CaM存在 时与不存在时的磷酸酶活力之差代表CaN活力。
测定方法：总反应体积为400 μL，由20 μL待测提取液和380 μL底物I液或II 液组成 。底物I液含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、0.5 mmol/L DDT、0.2 g/L BSA、10 mmol/L PN PP、2 mmol/L CaCl2及0.3 μmol/L CaM。底物II液含3 mmol/L EGTA，不含CaCl2和 CaM外，其余成分同底物I液。测定时取待测提取液20 μL与底物液380 μL，30℃保温30 mi n，立即加入13%K2HPO4 50 μL终止反应，在分光光度计上410 nm读取吸光度，以空白 底物液调零,每样本的底物I液测出的为CaN和其它磷酸酶的总活力；底物II液测出的仅是其 它磷酸酶活力，二者之差即CaN活力。应用标准CaN(0.5～5 ku/L)作标准曲线，同时用考马 斯亮兰法对样本进行蛋白定量，结果以比活力(ku/g.protein)表示。
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该法简便而且较稳定，可重复性强。但实验测得的是CaN对磷酸酪氨酸小分子底物的水 解活力，只能间接反映其在体内对丝/苏氨酸蛋白底物的活力。另外，该法特异性较差。
2 放射性同位素法
参考文献[7]方法进行，该法的原理基于两点：①cAMP依赖的蛋白激酶调节亚单位(RII)是 CaN的一种较专 一的底物，且受其它蛋白磷酸酶(磷酸酶1和磷酸酶2A)的影响较少。应用同位素32P 标记RII亚单位，根据释放的32P的多少测定样本中CaN活力；②CaN是目前已知的 唯一对Ca2+依赖、对Okadaic acid(磷酸酶1和磷酸酶2A特异抑制剂)不敏感的磷酸 酶，加入Ca2+和Okadaic acid后可进一步提高该法的特异性。
测定方法：底物肽的序列是与cAMP依赖的蛋白激酶调节亚单位(RII)相应的一段序列， 由Asp-Leu-Asp-Val-Pro-Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-Ser-Val-Ala-Ala-Glu组 成。可应用蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和[r-32P]ATP对底物肽进行标记， 制备成32P 标记的底物肽。测定时取20 μL待测提取液与40 μL测定缓冲液[含 20 mmol/L Tris(pH 8 .0)、100 mmol/L NaCl、6 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DDT、0.1 g/L BSA、0.1 mmol/L C aCl2、5 μmol/L 32 P标记的底物肽和500 nmol/L Okadaic acid]混合，30℃孵 育15 min，加入100 mmol/L (pH 7.0)磷酸钾缓冲液(含5%三氯乙酸)0.5 mL终止反应。游离的无机磷经Dowex阳离子交 换层析柱分离，液闪计数。所测值减去不含酶的空白测定值为实测值。
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本法敏感性高，特异性强，是目前最常用的方法。但步骤较复杂，底物肽需特约合成， 没有商品试剂供应。
3 高效液相色谱法
参照文献[8]方法进行，该法的原理是：磷酸化和去磷酸化的底物肽在高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)上的层析行为不 同，因此可借助HPLC分别对磷酸化和去磷酸化的底物肽进行定量，以测定CaN活力。
所用底物肽同前，但直接用ATP和蛋白激酶使底物肽磷酸化，反应在150 μL反应液[含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、0.1 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L DDT、0.01% Brij、 0.3 g/ L BSA、0.1 μmol/L CaM、1 mmol/L MnCl2及1 mmol/L CaCl2]中进行，反应混合物在 30℃预 育15 min ，加入底物(5～200 μmol/L)，在不同时间(2、4、6、10 min)取出20 μL反 应液，并 加0.5%高氯酸70 μL(含0.1%Triton X-100和10 mmol/L羧苯磺胺)，取上清40 μL上HPLC柱 ，酶活性可根据最初6 min的产物线性图求出。
, 百拇医药
该法具有与放射性同位素法同样的敏感性，非放射性标记的底物肽更稳定，更易于储存 ，适于大规模筛选性实验和酶促动力学的检测。
4 其它
Martin等[9]直接应用从Promaga公司获得的磷酸酶测定试剂盒，通过监测无机 磷从磷酸 化的底物肽中释放的量来测定CaN活性。无机磷应用一种malachite green dye方法来检测 。所使用的底物肽为Arg-Arg-Ala-Thr(P)-Val-Ala。反应在Spectramax 250微孔板中进行， 总反应体积为50 μL。反应液含25 mmol/L MOPS(pH 7.0)、1.0 mmol/L MnCl2、20 m g/ L CaM、20 mg/L CaN及1.0 mmol/L底物肽。30℃反应15 min，加入50 μL dye reagent， 孵育10 min， 在630 nm测定吸光度。但此法只能在纯化体系中进行，不能检测样品粗提液中的酶活性。
, 百拇医药
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39730220)
[作者简介] 符民桂，男，35岁，博士研究生。主要研究方 向为“心血管细胞增殖的信号传递机制”。
参考文献
[1] Cuerini D. Calcineurin: not just a simple protein phosphatase [J]. Biochem Biophys Res Commol/Lun, 1997, 235 : 271-275
[2] Klee CB, Ren H, Wang X. Regulation of the calmodulin-stimulat ed p rotein phosphatase, calcineurin [J]. J Biol Chem, 1 998, 273: 13 367-370
, http://www.100md.com
[3] Yakel JL. Calcineurin regulation of synapic function: from io n channels to tr ansmitter release and gene transcription [J]. Trends Pharmcol Sc i, 1997, 18: 124-133
[4] Molkentin JD, Lu JR, Antos CL, et al. A calcineurin dependent tra nscriptional pathway for cardiac hypertrophy [J]. Cell, 1998, 93: 215-228
[5] Olson EN, Molkentin JD. Prevention of cardiac hypertrophy by calcineurin inhibition: hope or hype[J]? Circ Res, 1 999, 84: 623-632
, 百拇医药
[6] Pallen CJ,Wang JH. Calmodulin-stimulated dephosphorylatio n of p-Nireopheny l phosphate and free phosphotyrosine by calcineurin [J]. J Biol C hem, 1983, 258: 8 550-553
[7] Fruman DA, Klee CB, Bierer BE, et al. Calcineurin phosphatas e activity in T l ymphocytess is inhibited by FK506 and cyclosporin A [J]. Proc Nat l Acad Sci, 1992, 89: 3 686-690
[8] Enz A, Shapiro G, Chappuis A, et al. Nonradioactive assay for protein phosphat ase 2B (calcineurin) activity using a ppartial sequence of the subunit of cAMP- dependent protein kinase as substrate [J]. Anal Biochem, 1994, 216: 147-153
[9] Martin BL. Inhibition of calcineurin by the tyrphostin cl ass of tyrposin kinase inhibitors [J]. Biochem Pharmacol, 1998, 56: 483-488
(此文1999-07-23收到， 2000-02-15修回), 百拇医药