钆喷酸葡甲胺脂质体的制备及对大鼠肝癌灶的诊断作用
作者：许乙凯 刘杏元 张嘉惠 乔东访
单位：许乙凯(510515 广州第一军 医大学南方医院影像中心)；刘杏元(510515 广州第一军 医大学南方医院影像中心)；张嘉惠(华南农业大学兽医系药理教研室)；乔东访(第一军医大学电镜室)
关键词：造影剂；磁共振成像；肝癌；脂质体
放射学实践000201 【摘要】 目的：探讨Gd-DTPA脂质体造影剂对大鼠 肝癌灶的诊断价值。方法：采用冻融超声法制备出粒径0.61±0.34μm 的装载Gd-DTPA的脂质体，二乙基亚硝胺法建立大鼠肝癌灶模型(5例)；观察静注0.1mmol/1 00g体重Gd-DTPA脂质体后大鼠肝癌灶显示情况，并与尸检对照。结果：脂 质体造影剂包裹率为20.1%，能有效、持续地造成肝脏选择性靶向强化，从而衬托出肝癌病 灶，使癌灶检出率由平扫17.6%上升至增强后的76.5%(0.01
Preparation and application of liposomes loaded with Gd-DTPA in earl y detection of small hepatocellular carcinomas in rat model
Xu Yikai ,Liu Xingyuan,Zhang Jiahui,et al.
(Medical Imaging Center,Nan Fang Hospital,the Fi rst Military Medical University, Guangzhou 510515)
【Abstract】 Objective:To investigate the value of liposomal G d-DTPA enhanced MR imaging for improving detection of small hepatocellular carc inoma nodules (HCCs) in rat model.Methods:Gd-DTPA liposomes,whi ch averaged 0.61±0.34μM in diameter,were synthesized by freeze-thaw-sonifica tion extrusion process.The rat model with HCCs was chemically induced by oral ad ministration of diethylnitrosamine (DENA) for 16 weeks (n=5).After intravenous i njection of Gd-DTPA-liposomes at a dose of 0.1mmol per 100g body weight,MR con trast features of HCCs were observed and correlated with pathologic changes.Results:Encapsulation efficiency was 20.1% in the present liposomal Gd-DTPA preparation.After the injection,liposomal Gd-DTPA resulted in a persi sting and considerable liver parenchymal contrast enhancement,and permited signi ficant improvement of detection of HCCs.The detecting rate of HCCs was 17.6% on precontrast T1 weighted images,while rised to 76.5% on the postcontrast images (0.01
【Key words】 Contrast agent Magnetic resonance imaging Hepat ocellular carcinoma Liposome
钆喷酸葡甲胺(Gd-DTPA)是目前应用最为广泛的磁共振阳性造影剂，其分子量小(仅590 道尔顿)，属全身非特异性分布，对肝脏疾病的强化效果远不如中枢神经系统疾病理想 [1]。本文尝试将Gd-DTPA包裹入脂质体(liposomes)中，目的是提高肝脏靶向强化效果 ，并探讨其对大鼠肝癌模型的诊断价值。
材料和方法
1. Gd-DTPA脂质体的制备
装载(包裹)Gd-DTPA的脂质体采用冻融超声法制备[2]：2.83g卵磷脂和0.93g胆固 醇溶解在25ml氯仿中，置圆底烧瓶，用旋转式蒸发器将氯仿挥发至尽，此时瓶壁上留下一层 磷脂膜；加入0.5mol/l 20ml，剧烈震荡；置塑料离心管中，再放入液氮罐中冰冻5min，转 至37℃水溶融化，超声波(输出功率60W)作用30s，如此反复冻融及超声处理3个循环。最近 将产物用0.2mol/l PBS缓冲液透析72h(换水4000ml)，除尽游离Gd-DTPA。最后过0.22 μM滤膜除去过大粒子及滤菌，浓缩至20ml左右备用。
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2. Gd-DTPA脂质体形态观测
取1滴上述脂质体造影剂，放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入2%磷钨酸染30s，干 燥后移入透视电镜观测脂质体大小及形态。
3. 脂质体造影剂的浓度及包裹(包封)率测定
①建立Gd-DTPA浓度与MR信号强度值关系的工作曲线：现已证明，在较低的浓度范围下(Gd-DTPA<0.5mmol/l)，信号强度与Gd-DTPA的浓度成正比[3，4]。因此，我们用0. 2mol/l PBS配制浓度梯度为0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mmol/l的Gd-DTPA液(每管10m l)，置我院1.5Tesla MR仪(Siemens，vision Plus)进行SE序列扫描(参数规定TR/TE=400ms/ 15ms，温度22℃)，用Evaluation软件测各管信号强度，求出Gd-DTPA浓度梯度(y)与信号强度(x)的直线回归方程：
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y=373.7±1934.x (r=0.98，P<0.01)
②脂质体造影剂浓度测定：取1ml Gd-DTPA脂质体，加入5%Triton X-100 2ml，使脂质体 破裂，再稀释至20ml，用上述同样参数测信号强度，代入直线回归方程式求出Gd-DTPA脂质体中含Gd-DTPA的浓度为0.1mmol/ml。
③包裹率测定：将制备脂质体造影剂过程中4000ml透析液(内含未被包裹的游离Gd-DTPA)， 按上述同样方式扫描及测信号强度，代入直线回归方程求出游离Gd-DTPA总含量。脂质体 包裹率定义为(投料时Gd-DTPA加入总量-透析液中游离Gd-DTPA含量)/投料时Gd-DTPA加 入总量×100%。
4. 大鼠肝癌模型建立及Gd-DTPA脂质体增强试验
15只清洁级雄性Wistar大鼠，体重154.5±19.7g，按先前报道的方法诱癌[2]至22 周时先后死亡10只，余5只分别腹腔注射50mg/kg戊巴比妥麻醉，用头部线圈行Turbo-SE平 扫T1加权像(TR/TE＝500ms/15ms)和T2加权像(TR/TE＝2000ms/90ms)；随后，从尾静脉 注入1ml/100g(含Gd-DTPA 0.1mmol/100g)Gd-DTPA脂质体，分别于注药后5min、10min、30 min获T1加权像比较增强前后大鼠模型病灶显示情况，并与肉眼检查及镜下病理染色(HE染 色)对照分析。
, 百拇医药
结果
1. Gd-DTPA脂质体的包裹率及形态特点
本文Gd-DTPA脂质体的包裹率为20.3%，透视电镜下脂质体被染成电子致密圆形影，周边有 透光的磷脂膜(图1)，粒度范围0.03～2.6μm，平均粒径0.61±0.34μm。
图1 Gd-DTPA脂质体电镜下放大4800倍所见，呈类圆形，周边可见透亮的双脂 膜。
2. 大鼠肝癌MR表现与病理对照结果
5只大鼠，病理检查共发现17个瘤灶，大小1.0～10mm，平均3.8±2.9mm，平扫T1加权像上 多呈等信号或仅信号稍不均匀，瘤灶检出率17.6%(3/17)；T2加权像上瘤灶呈略高信号或 等信号，检出率52.9%(9/17)；注射脂质体造影剂后，肝实质15min左右强化达高峰，持 续强化达30min以上；此外，肾脏也有一定程度强化，而肌肉、肺、脑组织未见明显强化， 提示Gd-DTPA脂质体有靶向趋肝的特性；瘤灶在明显强化的肝实质衬托下呈清楚的低信号， 增强后瘤灶检出率上升为76.5%(13/17)，远高于平扫时T1加权像的检出率(χ2=6.4， 0.01
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图2 大鼠肝癌模型轴位T1加权像，肝内可见一个瘤灶。
图3 同一大鼠模型注射Gd-DTPA脂质体后冠状切面T1加权像，肝实质明 显强化，衬托出斑片状分布的多个瘤灶。
结果
脂质体(liposomes)是由类脂质双分子层所形成的小囊中，囊内为含液空间，起药物载体作 用。它可使包封的药物在血液循环中免遭破坏或清除，并借助肝脏Kupffer细胞吞噬作用 [6]，选择性地到达靶器官——肝脏。利用脂质体这一特性能大大提高Gd-DTPA造影 剂在肝脏的浓度水平，产生明显和持续的肝脏靶向增强效果。由于肝癌缺乏Kupffer细胞， 因此，脂质体造影剂在癌灶区的分布少，瘤灶在明显强化的肝实质的衬托下显示更加清晰。 本文试验结果表明，注射脂质体造影剂后，肝癌灶检出率由平扫的17.6%上升至76.5%(0.01[6]，对提高肝 脏病灶的检出水平将有重要价值。我们认为，脂质体装载Gd-DTPA造影剂尚具有下列优点： ①构成脂质体的磷脂膜可生物降解，对人体无毒；②由于构成脂质体的磷脂膜与体内生物膜 成份上十分相似，因而有良好的生物相容性；③每个脂质体的载药量大，且包裹过程仅为简 单物理学过程，并没有改变Gd-DTPA造影剂的分子结构，因此可望获得较佳安全性。
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本文制备的脂质体造影剂在粒径上稍大于国内、外报道，包裹率仍较低(仅20.1%)，有待今 后进一步改进。此外，Gd-DTPA脂质体的贮存稳定性仍不理想[7]。其原因主要是 脂质体多用天然磷脂(如鸡蛋黄卵磷脂)为原料，分子结构上含有相当数量的不饱和键，易产 生氧化，导致脂质体的渗漏及结构破裂，因此脂质体稳定期仍较短。如果采用加氢法预先饱 和天然磷脂的双键，则一定程度上可望克服上述问题。
参考文献
[1]Okendal A,Hals PA. Biodistribution and toxicity of MR imaging contras t media[J]. JMRI,1993,3∶157.
[2]Tilcock C,Unger E,Cullis P,et al.Liposomal Gd-DTPA：preparation and characte rization of relaxivity[J]. Radiology,1989,17∶77.
, http://www.100md.com
[3]Koenig SH. From the relaxivity of Gd(DTPA) 2- to everything else[J]. MRM, 1991,22∶183.
[4]戴平丰,刘继汉,余伟南,等. 顺磁性造影剂Gd-DTPA与FAC弛豫增强特性的实验研究[J ]. 中国医学计算机成像杂志,1998,4(1)∶60.
[5]张嘉宁,顾为望,许乙凯,等. 大鼠肝癌模型的建立及影像学表现[J].中国实验动物学 杂志,1999,9(2)∶98.
[6]Unger EC,Shen Dk,Fritz TA. Status of liposomes as MR contrast agents[J]. J MRI,1993,3∶1957.
[7]Unger EC,Winokur T,Mac Dougall P,et al. Hepatic metastases:liposomal Gd-DTPA -enhance MR imaging[J]. Radiology,1989,171∶81.
(1999-11-01 收稿), 百拇医药
单位：许乙凯(510515 广州第一军 医大学南方医院影像中心)；刘杏元(510515 广州第一军 医大学南方医院影像中心)；张嘉惠(华南农业大学兽医系药理教研室)；乔东访(第一军医大学电镜室)
关键词：造影剂；磁共振成像；肝癌；脂质体
放射学实践000201 【摘要】 目的：探讨Gd-DTPA脂质体造影剂对大鼠 肝癌灶的诊断价值。方法：采用冻融超声法制备出粒径0.61±0.34μm 的装载Gd-DTPA的脂质体，二乙基亚硝胺法建立大鼠肝癌灶模型(5例)；观察静注0.1mmol/1 00g体重Gd-DTPA脂质体后大鼠肝癌灶显示情况，并与尸检对照。结果：脂 质体造影剂包裹率为20.1%，能有效、持续地造成肝脏选择性靶向强化，从而衬托出肝癌病 灶，使癌灶检出率由平扫17.6%上升至增强后的76.5%(0.01
Preparation and application of liposomes loaded with Gd-DTPA in earl y detection of small hepatocellular carcinomas in rat model
Xu Yikai ,Liu Xingyuan,Zhang Jiahui,et al.
(Medical Imaging Center,Nan Fang Hospital,the Fi rst Military Medical University, Guangzhou 510515)
【Abstract】 Objective:To investigate the value of liposomal G d-DTPA enhanced MR imaging for improving detection of small hepatocellular carc inoma nodules (HCCs) in rat model.Methods:Gd-DTPA liposomes,whi ch averaged 0.61±0.34μM in diameter,were synthesized by freeze-thaw-sonifica tion extrusion process.The rat model with HCCs was chemically induced by oral ad ministration of diethylnitrosamine (DENA) for 16 weeks (n=5).After intravenous i njection of Gd-DTPA-liposomes at a dose of 0.1mmol per 100g body weight,MR con trast features of HCCs were observed and correlated with pathologic changes.Results:Encapsulation efficiency was 20.1% in the present liposomal Gd-DTPA preparation.After the injection,liposomal Gd-DTPA resulted in a persi sting and considerable liver parenchymal contrast enhancement,and permited signi ficant improvement of detection of HCCs.The detecting rate of HCCs was 17.6% on precontrast T1 weighted images,while rised to 76.5% on the postcontrast images (0.01
【Key words】 Contrast agent Magnetic resonance imaging Hepat ocellular carcinoma Liposome
钆喷酸葡甲胺(Gd-DTPA)是目前应用最为广泛的磁共振阳性造影剂，其分子量小(仅590 道尔顿)，属全身非特异性分布，对肝脏疾病的强化效果远不如中枢神经系统疾病理想 [1]。本文尝试将Gd-DTPA包裹入脂质体(liposomes)中，目的是提高肝脏靶向强化效果 ，并探讨其对大鼠肝癌模型的诊断价值。
材料和方法
1. Gd-DTPA脂质体的制备
装载(包裹)Gd-DTPA的脂质体采用冻融超声法制备[2]：2.83g卵磷脂和0.93g胆固 醇溶解在25ml氯仿中，置圆底烧瓶，用旋转式蒸发器将氯仿挥发至尽，此时瓶壁上留下一层 磷脂膜；加入0.5mol/l 20ml，剧烈震荡；置塑料离心管中，再放入液氮罐中冰冻5min，转 至37℃水溶融化，超声波(输出功率60W)作用30s，如此反复冻融及超声处理3个循环。最近 将产物用0.2mol/l PBS缓冲液透析72h(换水4000ml)，除尽游离Gd-DTPA。最后过0.22 μM滤膜除去过大粒子及滤菌，浓缩至20ml左右备用。
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2. Gd-DTPA脂质体形态观测
取1滴上述脂质体造影剂，放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入2%磷钨酸染30s，干 燥后移入透视电镜观测脂质体大小及形态。
3. 脂质体造影剂的浓度及包裹(包封)率测定
①建立Gd-DTPA浓度与MR信号强度值关系的工作曲线：现已证明，在较低的浓度范围下(Gd-DTPA<0.5mmol/l)，信号强度与Gd-DTPA的浓度成正比[3，4]。因此，我们用0. 2mol/l PBS配制浓度梯度为0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mmol/l的Gd-DTPA液(每管10m l)，置我院1.5Tesla MR仪(Siemens，vision Plus)进行SE序列扫描(参数规定TR/TE=400ms/ 15ms，温度22℃)，用Evaluation软件测各管信号强度，求出Gd-DTPA浓度梯度(y)与信号强度(x)的直线回归方程：
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y=373.7±1934.x (r=0.98，P<0.01)
②脂质体造影剂浓度测定：取1ml Gd-DTPA脂质体，加入5%Triton X-100 2ml，使脂质体 破裂，再稀释至20ml，用上述同样参数测信号强度，代入直线回归方程式求出Gd-DTPA脂质体中含Gd-DTPA的浓度为0.1mmol/ml。
③包裹率测定：将制备脂质体造影剂过程中4000ml透析液(内含未被包裹的游离Gd-DTPA)， 按上述同样方式扫描及测信号强度，代入直线回归方程求出游离Gd-DTPA总含量。脂质体 包裹率定义为(投料时Gd-DTPA加入总量-透析液中游离Gd-DTPA含量)/投料时Gd-DTPA加 入总量×100%。
4. 大鼠肝癌模型建立及Gd-DTPA脂质体增强试验
15只清洁级雄性Wistar大鼠，体重154.5±19.7g，按先前报道的方法诱癌[2]至22 周时先后死亡10只，余5只分别腹腔注射50mg/kg戊巴比妥麻醉，用头部线圈行Turbo-SE平 扫T1加权像(TR/TE＝500ms/15ms)和T2加权像(TR/TE＝2000ms/90ms)；随后，从尾静脉 注入1ml/100g(含Gd-DTPA 0.1mmol/100g)Gd-DTPA脂质体，分别于注药后5min、10min、30 min获T1加权像比较增强前后大鼠模型病灶显示情况，并与肉眼检查及镜下病理染色(HE染 色)对照分析。
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结果
1. Gd-DTPA脂质体的包裹率及形态特点
本文Gd-DTPA脂质体的包裹率为20.3%，透视电镜下脂质体被染成电子致密圆形影，周边有 透光的磷脂膜(图1)，粒度范围0.03～2.6μm，平均粒径0.61±0.34μm。
图1 Gd-DTPA脂质体电镜下放大4800倍所见，呈类圆形，周边可见透亮的双脂 膜。
2. 大鼠肝癌MR表现与病理对照结果
5只大鼠，病理检查共发现17个瘤灶，大小1.0～10mm，平均3.8±2.9mm，平扫T1加权像上 多呈等信号或仅信号稍不均匀，瘤灶检出率17.6%(3/17)；T2加权像上瘤灶呈略高信号或 等信号，检出率52.9%(9/17)；注射脂质体造影剂后，肝实质15min左右强化达高峰，持 续强化达30min以上；此外，肾脏也有一定程度强化，而肌肉、肺、脑组织未见明显强化， 提示Gd-DTPA脂质体有靶向趋肝的特性；瘤灶在明显强化的肝实质衬托下呈清楚的低信号， 增强后瘤灶检出率上升为76.5%(13/17)，远高于平扫时T1加权像的检出率(χ2=6.4， 0.01
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图2 大鼠肝癌模型轴位T1加权像，肝内可见一个瘤灶。
图3 同一大鼠模型注射Gd-DTPA脂质体后冠状切面T1加权像，肝实质明 显强化，衬托出斑片状分布的多个瘤灶。
结果
脂质体(liposomes)是由类脂质双分子层所形成的小囊中，囊内为含液空间，起药物载体作 用。它可使包封的药物在血液循环中免遭破坏或清除，并借助肝脏Kupffer细胞吞噬作用 [6]，选择性地到达靶器官——肝脏。利用脂质体这一特性能大大提高Gd-DTPA造影 剂在肝脏的浓度水平，产生明显和持续的肝脏靶向增强效果。由于肝癌缺乏Kupffer细胞， 因此，脂质体造影剂在癌灶区的分布少，瘤灶在明显强化的肝实质的衬托下显示更加清晰。 本文试验结果表明，注射脂质体造影剂后，肝癌灶检出率由平扫的17.6%上升至76.5%(0.01
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本文制备的脂质体造影剂在粒径上稍大于国内、外报道，包裹率仍较低(仅20.1%)，有待今 后进一步改进。此外，Gd-DTPA脂质体的贮存稳定性仍不理想[7]。其原因主要是 脂质体多用天然磷脂(如鸡蛋黄卵磷脂)为原料，分子结构上含有相当数量的不饱和键，易产 生氧化，导致脂质体的渗漏及结构破裂，因此脂质体稳定期仍较短。如果采用加氢法预先饱 和天然磷脂的双键，则一定程度上可望克服上述问题。
参考文献
[1]Okendal A,Hals PA. Biodistribution and toxicity of MR imaging contras t media[J]. JMRI,1993,3∶157.
[2]Tilcock C,Unger E,Cullis P,et al.Liposomal Gd-DTPA：preparation and characte rization of relaxivity[J]. Radiology,1989,17∶77.
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[3]Koenig SH. From the relaxivity of Gd(DTPA) 2- to everything else[J]. MRM, 1991,22∶183.
[4]戴平丰,刘继汉,余伟南,等. 顺磁性造影剂Gd-DTPA与FAC弛豫增强特性的实验研究[J ]. 中国医学计算机成像杂志,1998,4(1)∶60.
[5]张嘉宁,顾为望,许乙凯,等. 大鼠肝癌模型的建立及影像学表现[J].中国实验动物学 杂志,1999,9(2)∶98.
[6]Unger EC,Shen Dk,Fritz TA. Status of liposomes as MR contrast agents[J]. J MRI,1993,3∶1957.
[7]Unger EC,Winokur T,Mac Dougall P,et al. Hepatic metastases:liposomal Gd-DTPA -enhance MR imaging[J]. Radiology,1989,171∶81.
(1999-11-01 收稿), 百拇医药