异常疤痕中血管内皮生长因子和增殖细胞核抗原的表达
作者：李军辉 邢新 欧阳天祥 文军慧 郭恩覃
单位：解放军第二军医大学长海医院，上海 200433
关键词：血管内皮生长因子；增殖细胞核抗原；角朊细胞；瘢痕疙瘩；增殖性瘢痕
现代康复000941
摘要：目的 探讨瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常疤痕中血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及其意义。方法 应用免疫组织化学染色技术，以正常皮肤和正常瘢痕作对照，观察了瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF和PCNA的表达。结果 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层角朊细胞均大量表达VEGF，较正常皮肤和正常瘢痕显著增加。PCNA的表达与VEGF相似，但真皮内少量的成纤维细胞有较弱的PCNA表达。结论 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕表皮基底层的角朊细胞大量表达VEGF和PCNA可能与异常疤痕的形成密切相关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R619 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)09-1358-02
Vascular endothelial growth factor and proliferating cell nuclear antigen expression in abnormal scars
LI Jun-hui, XING Xin, OUYANG Tian-xiang， et al
(Department of Plastic Surgery, Changhai Hospital ， Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract:Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in keloids and hypertrophic scars. Method With immunohistochemistry technique, the expression of VEGF and PCNA in keloids and hypertrophic scars was investigated, and the normal skins and scars were taken as controls. Result The expression of VEGF and PCNA in keratinocytes in keloids and hypertrophic scars was higher than control (normal scars or normal skins).Most positive cells were on basal layer in epidermis,rare fibroblasts in dermis were positive. Conclusion There is enhanced expression of VEGF and PCNA in basal cells in keloids and hypertrophic scars, which may take a role in the formation of abnormal scars.
, 百拇医药
Key Words:vascular endothelial growth factor; proliferating cell nuclear antigen; keratinocyte; keloid;hypertrophic scar
血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)是血管内皮细胞的特异有丝分裂原[1]。研究证实，在正常皮肤角朊细胞有低度的VEGF表达，而在上皮肿瘤或伤口愈合过程中其表达明显升高，VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关[2]。其他研究亦证实[3,4]，多种细胞因子能调节培养之角朊细胞VEGF的表达，VEGF在上皮肿瘤的形成及伤口愈合中具有重要的作用。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕中角朊细胞VEGF的表达及其与增殖细胞核抗原的关系却鲜见研究。我们观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤角朊细胞VEGF和PCNA的表达，并对其意义进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1组织标本(1)瘢痕疙瘩组织标本来源于1995年4月～1998年4月我院收治的患者12例，术后经病理检查并结合临床均明确诊断为瘢痕疙瘩。(2)增殖性瘢痕标本取自1998年4月～1998年8月收治的10例烧伤创面愈合后的增殖性瘢痕患者，均为伤后半年左右，瘢痕处于增殖期。(3)正常瘢痕和正常皮肤组织来源于门诊已软化的瘢痕切除和重睑手术标本，均为10例。所有标本以中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片。
1.2免疫组织化学染色兔抗人VEGF多克隆抗体和LSAB试剂盒分别购自SantaCruz和DAKO公司，按照试剂盒说明并参照Imoto[4]的染色方法进行染色。简要步骤如下：切片经二甲苯脱蜡并梯度脱水，0.3%过氧化氢孵育30min阻断内源性过氧化物酶活性，1:200稀释的VEGF抗体于室温下反应2h，PBS漂洗后加生物素化的二抗(1：400稀释)室温下反应30min，再漂洗后加结合过氧化物酶的avidin(1：400稀释)室温下反应30min，DAB底物显色，苏木素衬染。同时切片作空白对照染色，避免假阳性。PCNA的染色按DAKO公司试剂盒的方法进行。另有组织切片作常规H-E染色。
, 百拇医药
1.3结果判断VEGF染色后，于显微镜下观察，细胞质内有棕褐色颗粒为阳性细胞，在低倍镜下测定切片中上皮长度，在高倍镜下计数阳性细胞数目，计算每毫米长度上皮中阳性细胞数目。PCNA的辨别亦类似，但以半定量方法计量。
1.4统计学处理数据以
±s表示,采用F检验,并计算组间差异。
2 结果
2.1VEGF的免疫组化染色在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中均有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于角朊细胞的基底层，染色颗粒位于细胞质内(图1)，真皮层少见阳性细胞。正常皮肤和正常瘢痕组织角朊细胞VEGF有弱的表达，无论其阳性细胞数目或染色颗粒深度均与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕有极显著的差异(表1)。
2.2PCNA的免疫组化染色与VEGF的染色较类似，阳性细胞大多位于基底细胞层，在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中，其染色深度或染色细胞数目均较正常皮肤和正常疤痕组织明显升高，真皮组织中有极少量的成纤维细胞染色阳性。
, 百拇医药
图1瘢痕疙瘩中VEGF的表达
A：阳性细胞主要位于角朊细胞基底层(SP×400)
B：阳性染色颗位于角朊细胞的细胞质内(SP×400)
表1 各组组织中VEGF的表达 组别
n
阳性细胞数目/mm上皮
正常皮肤(A组)
10
8.4±4.5
正常疤痕(B组)
10
, 百拇医药
15.6±8.7
增殖性疤痕(C组)
10
65.9±18.7
疤痕疙瘩(D组)
12
78.3±13.8
注：与A组或B组比较P<0.01
2.3H-E染色在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有大量的胶原沉积，真皮内尤其乳头层有大量的微小血管，较正常皮肤和正常瘢痕组织明显增多，以Ⅷ因子特异性单抗染色进一步证实是微小血管。
3 讨论
, 百拇医药
研究证实[1]，VEGF是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，能促进内皮细胞的增殖、分化，它能够诱导并形成大量新生血管。Viac等[2]发现VEGF在正常皮肤角朊细胞中有低度的表达，而在鳞状细胞癌及病毒性皮肤患者的角朊细胞中其表达明显增高，作者认为VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关，高度增殖活性的角朊细胞合成分泌的VEGF明显增多。伤口愈合过程中角朊细胞表达VEGF亦明显升高，体外实验亦证实，多种细胞因子如表皮生长因子(EGF)、角朊细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等均能上调角朊细胞VEGF的表达，而这些细胞因子在伤口愈合中均有表达，VEGF在伤口愈合中具有重要的作用[5]。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕角朊细胞VEGF的表达与其与细胞增殖活性的关系尚未见文献报道。我们应用免疫组化技术，观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤四种组织角朊细胞VEGF和PCNA的表达，发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕组织标本中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于角朊细胞基底层，染色颗粒位于细胞质内，真皮内少见阳性细胞。与之相对照，正常皮肤和正常瘢痕角朊细胞VEGF有较弱的表达，无论阳性细胞数目或染色颗粒深度与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有显著的差异。实验中我们亦发现PCNA的表达与VEGF的染色较类似，阳性细胞大多位于基底细胞层，在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中，其染色深度或染色细胞数目均较正常皮肤和正常疤痕组织明显升高。这与文献报道相吻合，在这些异常瘢痕组织中存在多量高度增殖活性的角朊细胞，又有组织缺氧[6,7]，高度增殖活性的角朊细胞能够表达大量的VEGFmRNA[5]，而缺氧也可刺激细胞分泌VEGF[8]。因此瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞VEGF的大量表达，既与角朊细胞的增殖活性程度有关，又与组织细胞缺氧相关。胶原的大量生成与成纤维细胞的增殖分泌能力有关，但我们发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕真皮内成纤维细胞仅低度表达PCNA，成纤维细胞并没有表现出明显升高的增殖活性。我们推测具有高度增殖活性的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞过度表达的VEGF，通过旁分泌机制作用于血管内皮细胞，在真皮诱导生成大量新生血管，并能通过某种机制调节成纤维细胞的活性[9]，影响胶原的代谢，这与Detmar的观点一致[3]。异常瘢痕的形成受诸多细胞及细胞外基质的影响，本实验应用免疫组化技术证实瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞基底层大量表达VEGF和PCNA，推测高度增殖活性的角朊细胞大量表达的VEGF在异常瘢痕的形成中具有重要的作用，但增殖性瘢痕随着时间的流逝，颜色将渐变浅，质地变软，角朊细胞的增殖活性程度降低，与正常瘢痕组织逐渐接近；而瘢痕疙瘩却出现一种向周围正常组织侵润的特性，角朊细胞仍保持高度的增殖活性，这两种不同转归的机制有待于进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：上海青年科技基金资助项目(9733001)
作者简介：李军辉(1970-)，男，江西人，整形外科讲师，硕士，研究方向：异常疤痕防治。
参考文献：
[1] Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis[J]. Am J Pathol, 1995, 146(5): 1 029- 1 039
[2] Viac J, Palacio S, Schmitt D, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in normal epidermis, epithelial tumors and cultured ker atinocytes[J]. Arch Dermatol Res, 1997, 289(3): 158- 163
, http://www.100md.com
[3] Detmar M, Yeo KT, Nagy JA, et al. Keratinocyte- derived vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) is a potent mi togen for dermal microvascular endothelial cells[J]. J Invest Dermatol, 1995, 105(1): 44- 50
[4] Imoto H, Osaki T, Taga S, et al. Vascular endothelial growth factor expression in non- small- cell lung cancer: prognostic significance in squamous cell carcinoma[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 115(5): 1 007 - 1 014
, http://www.100md.com
[5] Frank S, Hubner G, Breier G, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes. Implications for nor mal and impaired wound healing[J]. J Biol Chem, 1995, 270(21): 12 607- 12 613
[6] Appletori I, Brown NJ, Willoughby DA. Apoptosis, necrosis, and proliferation possible implications in the etiology of keloids[J]. Am J Pathol, 1996, 149(5): 1 441- 1 447
[7]Machesney M, Tidman N, Waseem A, et al. Activated keratinocytes in the epidermis of hypertrophic scars[J]. Am J Pathol, 1998, 152(5): 1 133- 1 441
, 百拇医药
[8] Detmar M, Brown LF, Berse B, et al. Hypoxia regulars the expression of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) and its receptors in human skin[J]. J Invest Dermatol, 1997, 108(3): 263- 268
[9] Garner WL. Epidermal regulation of dermal fibroblast activity[J]. Plast Reconstr Surg, 1998, 102(1): 135- 139
收稿日期：2000-04-28, 百拇医药
单位：解放军第二军医大学长海医院，上海 200433
关键词：血管内皮生长因子；增殖细胞核抗原；角朊细胞；瘢痕疙瘩；增殖性瘢痕
现代康复000941
摘要：目的 探讨瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常疤痕中血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及其意义。方法 应用免疫组织化学染色技术，以正常皮肤和正常瘢痕作对照，观察了瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕中VEGF和PCNA的表达。结果 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕基底层角朊细胞均大量表达VEGF，较正常皮肤和正常瘢痕显著增加。PCNA的表达与VEGF相似，但真皮内少量的成纤维细胞有较弱的PCNA表达。结论 瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕表皮基底层的角朊细胞大量表达VEGF和PCNA可能与异常疤痕的形成密切相关。
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中图分类号：R619 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)09-1358-02
Vascular endothelial growth factor and proliferating cell nuclear antigen expression in abnormal scars
LI Jun-hui, XING Xin, OUYANG Tian-xiang， et al
(Department of Plastic Surgery, Changhai Hospital ， Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
Abstract:Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in keloids and hypertrophic scars. Method With immunohistochemistry technique, the expression of VEGF and PCNA in keloids and hypertrophic scars was investigated, and the normal skins and scars were taken as controls. Result The expression of VEGF and PCNA in keratinocytes in keloids and hypertrophic scars was higher than control (normal scars or normal skins).Most positive cells were on basal layer in epidermis,rare fibroblasts in dermis were positive. Conclusion There is enhanced expression of VEGF and PCNA in basal cells in keloids and hypertrophic scars, which may take a role in the formation of abnormal scars.
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Key Words:vascular endothelial growth factor; proliferating cell nuclear antigen; keratinocyte; keloid;hypertrophic scar
血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)是血管内皮细胞的特异有丝分裂原[1]。研究证实，在正常皮肤角朊细胞有低度的VEGF表达，而在上皮肿瘤或伤口愈合过程中其表达明显升高，VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关[2]。其他研究亦证实[3,4]，多种细胞因子能调节培养之角朊细胞VEGF的表达，VEGF在上皮肿瘤的形成及伤口愈合中具有重要的作用。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕中角朊细胞VEGF的表达及其与增殖细胞核抗原的关系却鲜见研究。我们观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤角朊细胞VEGF和PCNA的表达，并对其意义进行了初步探讨。
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1 资料与方法
1.1组织标本(1)瘢痕疙瘩组织标本来源于1995年4月～1998年4月我院收治的患者12例，术后经病理检查并结合临床均明确诊断为瘢痕疙瘩。(2)增殖性瘢痕标本取自1998年4月～1998年8月收治的10例烧伤创面愈合后的增殖性瘢痕患者，均为伤后半年左右，瘢痕处于增殖期。(3)正常瘢痕和正常皮肤组织来源于门诊已软化的瘢痕切除和重睑手术标本，均为10例。所有标本以中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm切片。
1.2免疫组织化学染色兔抗人VEGF多克隆抗体和LSAB试剂盒分别购自SantaCruz和DAKO公司，按照试剂盒说明并参照Imoto[4]的染色方法进行染色。简要步骤如下：切片经二甲苯脱蜡并梯度脱水，0.3%过氧化氢孵育30min阻断内源性过氧化物酶活性，1:200稀释的VEGF抗体于室温下反应2h，PBS漂洗后加生物素化的二抗(1：400稀释)室温下反应30min，再漂洗后加结合过氧化物酶的avidin(1：400稀释)室温下反应30min，DAB底物显色，苏木素衬染。同时切片作空白对照染色，避免假阳性。PCNA的染色按DAKO公司试剂盒的方法进行。另有组织切片作常规H-E染色。
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1.3结果判断VEGF染色后，于显微镜下观察，细胞质内有棕褐色颗粒为阳性细胞，在低倍镜下测定切片中上皮长度，在高倍镜下计数阳性细胞数目，计算每毫米长度上皮中阳性细胞数目。PCNA的辨别亦类似，但以半定量方法计量。
1.4统计学处理数据以
±s表示,采用F检验,并计算组间差异。2 结果
2.1VEGF的免疫组化染色在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中均有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于角朊细胞的基底层，染色颗粒位于细胞质内(图1)，真皮层少见阳性细胞。正常皮肤和正常瘢痕组织角朊细胞VEGF有弱的表达，无论其阳性细胞数目或染色颗粒深度均与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕有极显著的差异(表1)。
2.2PCNA的免疫组化染色与VEGF的染色较类似，阳性细胞大多位于基底细胞层，在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中，其染色深度或染色细胞数目均较正常皮肤和正常疤痕组织明显升高，真皮组织中有极少量的成纤维细胞染色阳性。
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图1瘢痕疙瘩中VEGF的表达
A：阳性细胞主要位于角朊细胞基底层(SP×400)
B：阳性染色颗位于角朊细胞的细胞质内(SP×400)
表1 各组组织中VEGF的表达 组别
n
阳性细胞数目/mm上皮
正常皮肤(A组)
10
8.4±4.5
正常疤痕(B组)
10
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15.6±8.7
增殖性疤痕(C组)
10
65.9±18.7
疤痕疙瘩(D组)
12
78.3±13.8
注：与A组或B组比较P<0.01
2.3H-E染色在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有大量的胶原沉积，真皮内尤其乳头层有大量的微小血管，较正常皮肤和正常瘢痕组织明显增多，以Ⅷ因子特异性单抗染色进一步证实是微小血管。
3 讨论
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研究证实[1]，VEGF是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，能促进内皮细胞的增殖、分化，它能够诱导并形成大量新生血管。Viac等[2]发现VEGF在正常皮肤角朊细胞中有低度的表达，而在鳞状细胞癌及病毒性皮肤患者的角朊细胞中其表达明显增高，作者认为VEGF的表达与角朊细胞的增殖、分化状态有关，高度增殖活性的角朊细胞合成分泌的VEGF明显增多。伤口愈合过程中角朊细胞表达VEGF亦明显升高，体外实验亦证实，多种细胞因子如表皮生长因子(EGF)、角朊细胞生长因子(KGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等均能上调角朊细胞VEGF的表达，而这些细胞因子在伤口愈合中均有表达，VEGF在伤口愈合中具有重要的作用[5]。但伤口愈合后形成的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕等异常瘢痕角朊细胞VEGF的表达与其与细胞增殖活性的关系尚未见文献报道。我们应用免疫组化技术，观察了瘢痕疙瘩、增殖性瘢痕、正常瘢痕和正常皮肤四种组织角朊细胞VEGF和PCNA的表达，发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕组织标本中有较强的VEGF表达，阳性细胞主要位于角朊细胞基底层，染色颗粒位于细胞质内，真皮内少见阳性细胞。与之相对照，正常皮肤和正常瘢痕角朊细胞VEGF有较弱的表达，无论阳性细胞数目或染色颗粒深度与瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕均有显著的差异。实验中我们亦发现PCNA的表达与VEGF的染色较类似，阳性细胞大多位于基底细胞层，在瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本中，其染色深度或染色细胞数目均较正常皮肤和正常疤痕组织明显升高。这与文献报道相吻合，在这些异常瘢痕组织中存在多量高度增殖活性的角朊细胞，又有组织缺氧[6,7]，高度增殖活性的角朊细胞能够表达大量的VEGFmRNA[5]，而缺氧也可刺激细胞分泌VEGF[8]。因此瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞VEGF的大量表达，既与角朊细胞的增殖活性程度有关，又与组织细胞缺氧相关。胶原的大量生成与成纤维细胞的增殖分泌能力有关，但我们发现瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕真皮内成纤维细胞仅低度表达PCNA，成纤维细胞并没有表现出明显升高的增殖活性。我们推测具有高度增殖活性的瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞过度表达的VEGF，通过旁分泌机制作用于血管内皮细胞，在真皮诱导生成大量新生血管，并能通过某种机制调节成纤维细胞的活性[9]，影响胶原的代谢，这与Detmar的观点一致[3]。异常瘢痕的形成受诸多细胞及细胞外基质的影响，本实验应用免疫组化技术证实瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕角朊细胞基底层大量表达VEGF和PCNA，推测高度增殖活性的角朊细胞大量表达的VEGF在异常瘢痕的形成中具有重要的作用，但增殖性瘢痕随着时间的流逝，颜色将渐变浅，质地变软，角朊细胞的增殖活性程度降低，与正常瘢痕组织逐渐接近；而瘢痕疙瘩却出现一种向周围正常组织侵润的特性，角朊细胞仍保持高度的增殖活性，这两种不同转归的机制有待于进一步研究。
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基金项目：上海青年科技基金资助项目(9733001)
作者简介：李军辉(1970-)，男，江西人，整形外科讲师，硕士，研究方向：异常疤痕防治。
参考文献：
[1] Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis[J]. Am J Pathol, 1995, 146(5): 1 029- 1 039
[2] Viac J, Palacio S, Schmitt D, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in normal epidermis, epithelial tumors and cultured ker atinocytes[J]. Arch Dermatol Res, 1997, 289(3): 158- 163
, http://www.100md.com
[3] Detmar M, Yeo KT, Nagy JA, et al. Keratinocyte- derived vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) is a potent mi togen for dermal microvascular endothelial cells[J]. J Invest Dermatol, 1995, 105(1): 44- 50
[4] Imoto H, Osaki T, Taga S, et al. Vascular endothelial growth factor expression in non- small- cell lung cancer: prognostic significance in squamous cell carcinoma[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 115(5): 1 007 - 1 014
, http://www.100md.com
[5] Frank S, Hubner G, Breier G, et al. Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes. Implications for nor mal and impaired wound healing[J]. J Biol Chem, 1995, 270(21): 12 607- 12 613
[6] Appletori I, Brown NJ, Willoughby DA. Apoptosis, necrosis, and proliferation possible implications in the etiology of keloids[J]. Am J Pathol, 1996, 149(5): 1 441- 1 447
[7]Machesney M, Tidman N, Waseem A, et al. Activated keratinocytes in the epidermis of hypertrophic scars[J]. Am J Pathol, 1998, 152(5): 1 133- 1 441
, 百拇医药
[8] Detmar M, Brown LF, Berse B, et al. Hypoxia regulars the expression of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) and its receptors in human skin[J]. J Invest Dermatol, 1997, 108(3): 263- 268
[9] Garner WL. Epidermal regulation of dermal fibroblast activity[J]. Plast Reconstr Surg, 1998, 102(1): 135- 139
收稿日期：2000-04-28, 百拇医药