血管生长素对缺血心肌促血管生长作用的初步观察
作者：黄盛东 唐昊 张宝仁
单位：黄盛东(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)；唐昊(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)；张宝仁(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)
关键词：血管生成因子；心肌缺血
第二军医大学学报000306 【摘要】 目的: 探索血管生长素(angiogenin,ANG)对缺血性心肌的促血管生长作用，以评价其应用于生物治疗的可行性。方法：以先期成功表达的基因重组人血管生长素衍生物Asp116His 对心肌梗死模型兔的缺血心肌边缘部作直接心肌内注射。注射后8 d行冠状动脉血管造影，并取注射点心肌切片作常规病理苏木精-伊红染色、VB染色、Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记。结果：用药组兔心脏表面注射点周围心肌缺血情况较对照组明显减轻，镜检可见心肌间质内有大量小血管，免疫组化标记发现心肌纤维间毛细血管数明显增多。结论：首次证实了ANG在心脏冠状血管内存在有效作用位点；ANG有可能成为缺血心肌再血管化生物治疗因子。
, 百拇医药
【中图分类号】 R 541.4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0216-03
Stimulation of neo-eangiogenesis in ischemic myocardium by recombinant human angiogenin derivative Asp116His
HUANG Sheng-Dong，TANG Hao，ZHANG Bao-Ren
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the angiogenic potentiality of angiogenin in ischemic myocardium and estimate the possibility of its application in biologic treatment. Methods: Recombinant human angiogenin derivative Asp116His was applied in an acute myocardial infarction model in rabbits which were established by direct intramyocardial injection into the border zone of the ischemic myocardium. The animals were sacrificed on the eighth postoperative day and their hearts were harvested and subjected to histologic studies. Results: Myocardium around the injection sites was apparently less ischemia in the experiment group as compared with control groups. A large number of small vessels were observed in the interstitial tissues and even more were revealed in the myocardium on immunohistochemistry studies. Conclusion: The results indicate for the first time that angiogenin or its derivatives may act on ischemic myocardium and stimulate neo-angiogenesis, which holds great promise for their future application in biologic revascularization of ischemic myocardium.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 angiogenin; angiogenesis factor; myocardium ischemia▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 216-218]
冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)是目前导致人类死亡的最常见病之一，西方发达国家冠心病的死亡人数占总死亡数的30%。随着物质生活水平的改善，我国冠心病患病率呈明显上升趋势，其死亡人数约占总死亡数的15%～20%。目前治疗冠心病最常用的方法是介入治疗(冠状动脉球囊扩张术或内支架放置术)和冠状动脉旁路移植术，旨在消除冠状动脉的狭窄或梗阻，改善心肌血供。但上述方法对于弥漫性冠状动脉远端分支狭窄的患者，则很难奏效。为进一步提高对冠心病的疗效，当前国外正尝试针对缺血心肌应用促血管生长因子来促进小血管生长及侧枝循环的形成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)目前已进入Ⅰ期临床试验并获得明显疗效[1，2]。该方法不仅可以单独应用，而且可以与现有的治疗方法联合使用，在冠心病治疗研究领域中得到了广泛重视，被称作“生物旁路”(biological bypass)。由于条件限制，目前国内尚未见这方面的研究报道。我们在成功地进行基因重组人血管生长素衍生物Asp116His(rhD116H-ANG)原核表达及复性的基础上[3]，首次经动物实验证实，血管生长素(ANG)对缺血性心肌的再血管化及侧枝循环的形成有积极的促进作用。
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1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只,本校实验动物中心提供， 雄雌不拘, 体质量2.5～3.0 kg, 随机分为3组，每组5只动物：(1)rhD116H-ANG用药(Ⅰ)组，(2)PBS对照(Ⅱ)组，(3)空白对照(Ⅲ)组。
1.2 动物模型的建立及评价 连接心电图肢体导联并记录心电图, 局麻下胸部正中切开皮肤, 沿胸骨左缘切断胸大肌附着部, 显露胸肋关节, 切断第2～4肋软骨, 牵开胸壁显露心包, 注意保护左侧胸膜, 切开并悬吊心包,显露心脏, 以5-0涤纶线在左心耳下缘水平缝扎冠状动脉左前降支(LAD)2道, 观察左室心肌颜色及运动的变化, 描记心电图。当左室心肌呈充血暗红色，前壁运动减弱，心电图出现ST段明显弓背抬高或压低，即认为模型建立成功。
1.3 给药方法 动物模型建立成功后，在左室心肌变色区边缘部、冠状动脉左前降支与左室支供血区交界处，纵行取上、中、下3点作心肌内注射并置心外膜标记缝线。其中Ⅰ组注射溶于PBS缓冲液的rhD116H-ANG(本实验室制备)蛋白溶液50 μl/点，含rhD116H-ANG 1 μg。Ⅱ组：注射PBS缓冲液50 μl/点。Ⅲ组：仅在注射点针刺，并不注射。
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1.4 取材与病理学检查 术后8 d经耳缘静脉注射空气处死动物，取出心脏，在生理盐水中漂洗干净，中性甲醛固定。沿注射方向纵行取注射点心肌进行切片行苏木精-伊红(H-E)染色、VB染色、Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记等。
2 结 果
2.1 动物存活情况 术中动物死亡4只，其中3只死于室颤，1只死于气胸。术后无死亡。术后8 d，各组存活动物数目：Ⅰ组为4只， Ⅱ组为3只， Ⅲ组为4只。
2.2 心脏大体观察 LAD结扎部位以下，各组均见沿LAD走行左室心肌呈灰白色，条形分布，形状不规则。Ⅰ组兔心脏表面注射点周围有大量的新生血管，缺血累及区域虽难以准确测量，但肉眼估测明显小于Ⅱ，Ⅲ组。
2.3 注射点心肌切片病理检测 Ⅰ组各样本均未见梗死区， H-E染色心肌细胞无明显颗粒样变性，心肌间质内有少量淋巴细胞浸润，同时可见大量小血管结构，以薄壁血管居多。高倍镜下，可见小血管呈簇状(图1A，图见封三)，毛细血管计数约(10～20)/HPF。VB染色下可见部分血管中层弹力纤维着色，心肌纤维间偶见内皮细胞条索样走行。Ⅱ，Ⅲ组各标本均可见心肌中层梗死区，周边部心肌细胞变性，心肌间质淋巴细胞浸润，小血管结构较Ⅰ组明显为少，毛细血管计数<8/HPF。Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记：可清楚地显示心肌纤维间大量毛细血管结构，管腔内可见红细胞(图1B，图见封三)。
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图1 实验组动物用药后8d注射点心组织结构
Fig1 Myocardium around the injection siutes on the eighth postoperative day in the experiment group A:H-E staining B;Factor-Ⅷrelated antigen immunohistochemistry staining
3 讨 论
ANG作为一种具有强烈促血管生长活性的调节因子，已经在兔半月板损伤愈合及肢体缺血模型中显示了十分明显的促侧枝循环形成作用[4]。而有关ANG对缺血心肌再血管化作用的研究国内外均未见报道。本研究初步证实了ANG在心脏冠状血管内存在有效作用位点，并可能引起缺血心肌灌注的改善。由于ANG的促血管生长活性远较已进入临床试验的VEGF等为强，因而有望成为新的心肌再血管化介导因子而进入临床，值得深入研究。
, 百拇医药
当前，心肌再血管化生物治疗的常见方法有2种：一是将蛋白因子直接注射于缺血区心肌，二是以编码蛋白因子的基因转染缺血区心肌。至于哪种方法更安全、有效，目前尚无定论。一般认为，前者的优点是方法简便、剂量准确、安全性高，缺点是起效虽快但作用时间短；而后者的优点是作用时间长，更符合少量、缓释的临床用药原则，可达到良好的治疗效果，但缺点是尚缺乏令人满意的载体。目前国外研究报道较多且已进入Ⅰ期临床试验的基因转染载体是E1，E3区缺失的腺病毒载体。用这种载体生产的重组腺病毒与野生型腺病毒相比，除了保留感染力强的特点之外，还具有抗原性弱、复制能力缺陷等优点。在被转染入心肌细胞后，重组的腺病毒并不整合到宿主染色体中，因而避免了插入突变的危险。根据上述情况，我们对这两种方法分别进行了探索。目前，ANG及其衍生物原核表达的研究已顺利完成，ANG重组腺病毒已构建成功。有关侧枝循环形成后对心肌病理改变的影响，ANG在心肌慢性缺血模型中的作用，以及用药方式正在深入研究之中。
目前，国外有关促血管生长因子促心肌缺血区再血管化研究仅限于VEGF和bFGF等少数因子，新近发现的VEGF-B，C，D等也属于VEGF家族[5～7]，其促血管生长作用已被证实。此外，已被证实具有促血管生长作用的生物因子还包括血管生长素、血管形成素(angiopoietin)等[8]，而有关这些因子在缺血性心肌中的促血管生长作用的研究国内外尚未见报道。鉴于上述研究现状，我们拟将这几种促血管生长因子基因选择性地进行单独或联合转染缺血的心肌，观察侧枝循环形成和心脏功能改善状况，并在此基础上进一步探讨其促血管生长的机制及临床应用的可行性。目前，有关研究已取得了较大的进展，VEGF-165，VEGF-B(186)、血管形成素等促血管生长因子的重组腺病毒已构建成功，有关这些因子在慢性心肌缺血的再血管化中的作用及是否存在协同效应的研究正在积极进行中。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970735)
作者简介：黄盛东(1965-)，男(汉族)，博士，助理研究员
【参 考 文 献】
[1] Bauters C. Growth factors as a potential new treatment for ischemic heart disease[J]. Clin Cardiol, 1997,20(11 Suppl 2): 52-57.
[2] Schumacher B, von Specht BU, Haberstroh J, et al. The stimulation of neo-angiogenesis in the ischemic heart by the human growth factor FGF[J]. J Cardiovasc Surg Torino,1998, 39(4):445-453.
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[3] 唐 昊，黄盛东，梅 举，等. 基因重组人血管生长素衍生物Asp116His的原核表达[J]. 第二军医大学学报，1999，20(12): 937-940.
[4] King TV, Vallee BL.Neovascularization of the meniscus with angiogenin. An experimental study in rabbits[J]. J Bone Joint Surg [Br]， 1991 ,73(4):587-590.
[5] Olofsson B, Korpelainen E, Pepper MS, et al. Vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) binds to VEGF receptor-1 and all cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998，95(20):11709-11714.
, http://www.100md.com
[6] Joukov V,Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2) receptor tyrosine kinases[J]. EMBO J, 1996, 15(2): 290-298.
[7] Marconcini L, Marchio S, Morbidelli L. c-fos-induced growth factor/vascular endothelial growth factor D induces angiogenesis in vivo and in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(17):9671.
[8] Fujikawa K, de Aos Scherpenseel I, Jain SK, et al. Role of PI 3-kinase in angiopoietin-1-mediated migration and attachment-dependent survival of endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(2):663-672.
【收稿日期】 2000-02-01
【修回日期】 2000-03-15, http://www.100md.com
单位：黄盛东(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)；唐昊(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)；张宝仁(第二军医大学长海医院胸心外科，上海 200433)
关键词：血管生成因子；心肌缺血
第二军医大学学报000306 【摘要】 目的: 探索血管生长素(angiogenin,ANG)对缺血性心肌的促血管生长作用，以评价其应用于生物治疗的可行性。方法：以先期成功表达的基因重组人血管生长素衍生物Asp116His 对心肌梗死模型兔的缺血心肌边缘部作直接心肌内注射。注射后8 d行冠状动脉血管造影，并取注射点心肌切片作常规病理苏木精-伊红染色、VB染色、Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记。结果：用药组兔心脏表面注射点周围心肌缺血情况较对照组明显减轻，镜检可见心肌间质内有大量小血管，免疫组化标记发现心肌纤维间毛细血管数明显增多。结论：首次证实了ANG在心脏冠状血管内存在有效作用位点；ANG有可能成为缺血心肌再血管化生物治疗因子。
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【中图分类号】 R 541.4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0216-03
Stimulation of neo-eangiogenesis in ischemic myocardium by recombinant human angiogenin derivative Asp116His
HUANG Sheng-Dong，TANG Hao，ZHANG Bao-Ren
(Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the angiogenic potentiality of angiogenin in ischemic myocardium and estimate the possibility of its application in biologic treatment. Methods: Recombinant human angiogenin derivative Asp116His was applied in an acute myocardial infarction model in rabbits which were established by direct intramyocardial injection into the border zone of the ischemic myocardium. The animals were sacrificed on the eighth postoperative day and their hearts were harvested and subjected to histologic studies. Results: Myocardium around the injection sites was apparently less ischemia in the experiment group as compared with control groups. A large number of small vessels were observed in the interstitial tissues and even more were revealed in the myocardium on immunohistochemistry studies. Conclusion: The results indicate for the first time that angiogenin or its derivatives may act on ischemic myocardium and stimulate neo-angiogenesis, which holds great promise for their future application in biologic revascularization of ischemic myocardium.
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【KEY WORDS】 angiogenin; angiogenesis factor; myocardium ischemia▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 216-218]
冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)是目前导致人类死亡的最常见病之一，西方发达国家冠心病的死亡人数占总死亡数的30%。随着物质生活水平的改善，我国冠心病患病率呈明显上升趋势，其死亡人数约占总死亡数的15%～20%。目前治疗冠心病最常用的方法是介入治疗(冠状动脉球囊扩张术或内支架放置术)和冠状动脉旁路移植术，旨在消除冠状动脉的狭窄或梗阻，改善心肌血供。但上述方法对于弥漫性冠状动脉远端分支狭窄的患者，则很难奏效。为进一步提高对冠心病的疗效，当前国外正尝试针对缺血心肌应用促血管生长因子来促进小血管生长及侧枝循环的形成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)目前已进入Ⅰ期临床试验并获得明显疗效[1，2]。该方法不仅可以单独应用，而且可以与现有的治疗方法联合使用，在冠心病治疗研究领域中得到了广泛重视，被称作“生物旁路”(biological bypass)。由于条件限制，目前国内尚未见这方面的研究报道。我们在成功地进行基因重组人血管生长素衍生物Asp116His(rhD116H-ANG)原核表达及复性的基础上[3]，首次经动物实验证实，血管生长素(ANG)对缺血性心肌的再血管化及侧枝循环的形成有积极的促进作用。
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1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大白兔15只,本校实验动物中心提供， 雄雌不拘, 体质量2.5～3.0 kg, 随机分为3组，每组5只动物：(1)rhD116H-ANG用药(Ⅰ)组，(2)PBS对照(Ⅱ)组，(3)空白对照(Ⅲ)组。
1.2 动物模型的建立及评价 连接心电图肢体导联并记录心电图, 局麻下胸部正中切开皮肤, 沿胸骨左缘切断胸大肌附着部, 显露胸肋关节, 切断第2～4肋软骨, 牵开胸壁显露心包, 注意保护左侧胸膜, 切开并悬吊心包,显露心脏, 以5-0涤纶线在左心耳下缘水平缝扎冠状动脉左前降支(LAD)2道, 观察左室心肌颜色及运动的变化, 描记心电图。当左室心肌呈充血暗红色，前壁运动减弱，心电图出现ST段明显弓背抬高或压低，即认为模型建立成功。
1.3 给药方法 动物模型建立成功后，在左室心肌变色区边缘部、冠状动脉左前降支与左室支供血区交界处，纵行取上、中、下3点作心肌内注射并置心外膜标记缝线。其中Ⅰ组注射溶于PBS缓冲液的rhD116H-ANG(本实验室制备)蛋白溶液50 μl/点，含rhD116H-ANG 1 μg。Ⅱ组：注射PBS缓冲液50 μl/点。Ⅲ组：仅在注射点针刺，并不注射。
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1.4 取材与病理学检查 术后8 d经耳缘静脉注射空气处死动物，取出心脏，在生理盐水中漂洗干净，中性甲醛固定。沿注射方向纵行取注射点心肌进行切片行苏木精-伊红(H-E)染色、VB染色、Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记等。
2 结 果
2.1 动物存活情况 术中动物死亡4只，其中3只死于室颤，1只死于气胸。术后无死亡。术后8 d，各组存活动物数目：Ⅰ组为4只， Ⅱ组为3只， Ⅲ组为4只。
2.2 心脏大体观察 LAD结扎部位以下，各组均见沿LAD走行左室心肌呈灰白色，条形分布，形状不规则。Ⅰ组兔心脏表面注射点周围有大量的新生血管，缺血累及区域虽难以准确测量，但肉眼估测明显小于Ⅱ，Ⅲ组。
2.3 注射点心肌切片病理检测 Ⅰ组各样本均未见梗死区， H-E染色心肌细胞无明显颗粒样变性，心肌间质内有少量淋巴细胞浸润，同时可见大量小血管结构，以薄壁血管居多。高倍镜下，可见小血管呈簇状(图1A，图见封三)，毛细血管计数约(10～20)/HPF。VB染色下可见部分血管中层弹力纤维着色，心肌纤维间偶见内皮细胞条索样走行。Ⅱ，Ⅲ组各标本均可见心肌中层梗死区，周边部心肌细胞变性，心肌间质淋巴细胞浸润，小血管结构较Ⅰ组明显为少，毛细血管计数<8/HPF。Ⅷ因子相关抗原免疫组化标记：可清楚地显示心肌纤维间大量毛细血管结构，管腔内可见红细胞(图1B，图见封三)。
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图1 实验组动物用药后8d注射点心组织结构
Fig1 Myocardium around the injection siutes on the eighth postoperative day in the experiment group A:H-E staining B;Factor-Ⅷrelated antigen immunohistochemistry staining
3 讨 论
ANG作为一种具有强烈促血管生长活性的调节因子，已经在兔半月板损伤愈合及肢体缺血模型中显示了十分明显的促侧枝循环形成作用[4]。而有关ANG对缺血心肌再血管化作用的研究国内外均未见报道。本研究初步证实了ANG在心脏冠状血管内存在有效作用位点，并可能引起缺血心肌灌注的改善。由于ANG的促血管生长活性远较已进入临床试验的VEGF等为强，因而有望成为新的心肌再血管化介导因子而进入临床，值得深入研究。
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当前，心肌再血管化生物治疗的常见方法有2种：一是将蛋白因子直接注射于缺血区心肌，二是以编码蛋白因子的基因转染缺血区心肌。至于哪种方法更安全、有效，目前尚无定论。一般认为，前者的优点是方法简便、剂量准确、安全性高，缺点是起效虽快但作用时间短；而后者的优点是作用时间长，更符合少量、缓释的临床用药原则，可达到良好的治疗效果，但缺点是尚缺乏令人满意的载体。目前国外研究报道较多且已进入Ⅰ期临床试验的基因转染载体是E1，E3区缺失的腺病毒载体。用这种载体生产的重组腺病毒与野生型腺病毒相比，除了保留感染力强的特点之外，还具有抗原性弱、复制能力缺陷等优点。在被转染入心肌细胞后，重组的腺病毒并不整合到宿主染色体中，因而避免了插入突变的危险。根据上述情况，我们对这两种方法分别进行了探索。目前，ANG及其衍生物原核表达的研究已顺利完成，ANG重组腺病毒已构建成功。有关侧枝循环形成后对心肌病理改变的影响，ANG在心肌慢性缺血模型中的作用，以及用药方式正在深入研究之中。
目前，国外有关促血管生长因子促心肌缺血区再血管化研究仅限于VEGF和bFGF等少数因子，新近发现的VEGF-B，C，D等也属于VEGF家族[5～7]，其促血管生长作用已被证实。此外，已被证实具有促血管生长作用的生物因子还包括血管生长素、血管形成素(angiopoietin)等[8]，而有关这些因子在缺血性心肌中的促血管生长作用的研究国内外尚未见报道。鉴于上述研究现状，我们拟将这几种促血管生长因子基因选择性地进行单独或联合转染缺血的心肌，观察侧枝循环形成和心脏功能改善状况，并在此基础上进一步探讨其促血管生长的机制及临床应用的可行性。目前，有关研究已取得了较大的进展，VEGF-165，VEGF-B(186)、血管形成素等促血管生长因子的重组腺病毒已构建成功，有关这些因子在慢性心肌缺血的再血管化中的作用及是否存在协同效应的研究正在积极进行中。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970735)
作者简介：黄盛东(1965-)，男(汉族)，博士，助理研究员
【参 考 文 献】
[1] Bauters C. Growth factors as a potential new treatment for ischemic heart disease[J]. Clin Cardiol, 1997,20(11 Suppl 2): 52-57.
[2] Schumacher B, von Specht BU, Haberstroh J, et al. The stimulation of neo-angiogenesis in the ischemic heart by the human growth factor FGF[J]. J Cardiovasc Surg Torino,1998, 39(4):445-453.
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[3] 唐 昊，黄盛东，梅 举，等. 基因重组人血管生长素衍生物Asp116His的原核表达[J]. 第二军医大学学报，1999，20(12): 937-940.
[4] King TV, Vallee BL.Neovascularization of the meniscus with angiogenin. An experimental study in rabbits[J]. J Bone Joint Surg [Br]， 1991 ,73(4):587-590.
[5] Olofsson B, Korpelainen E, Pepper MS, et al. Vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) binds to VEGF receptor-1 and all cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998，95(20):11709-11714.
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[6] Joukov V,Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4(VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2) receptor tyrosine kinases[J]. EMBO J, 1996, 15(2): 290-298.
[7] Marconcini L, Marchio S, Morbidelli L. c-fos-induced growth factor/vascular endothelial growth factor D induces angiogenesis in vivo and in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(17):9671.
[8] Fujikawa K, de Aos Scherpenseel I, Jain SK, et al. Role of PI 3-kinase in angiopoietin-1-mediated migration and attachment-dependent survival of endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(2):663-672.
【收稿日期】 2000-02-01
【修回日期】 2000-03-15, http://www.100md.com