文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制
作者：彭辉银 周显明 沈瑞菊 陈世维 刘家欣 陈新文 杨春华 谢天恩
单位：彭辉银 刘家欣 陈新文 谢天恩(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)周显明 杨春华(贵州省林业科学研究院，贵阳 550011)；沈瑞菊(武汉市卫生防疫站，武汉 430032)；陈世维(云南省林业科学研究院森林保护研究所，昆明 650000)
关键词：文山松毛虫质型多角体病毒；杀虫剂；林业；制剂
中国病毒学000209 摘要：报道了文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制，包括多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型研制、产品包装以及病毒杀虫剂的产品质量检测及生产等。该杀虫剂为乳剂，多角体浓度达2.5×109PIB/mL；所选辅助剂取材方便、容易配制，对环境没有污染。经安全检测证明，无致病菌，符合国家卫生标准，对试验动物小白鼠无毒性和致病性。生物测定用1×106PIB/mL感染2龄文山松毛虫幼虫，其死亡率平均为85.5%。
, 百拇医药
中图分类号：S482.3 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0149-07
Development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis virus (DpwCPV) Insecticide
PENG Hui-yin,LIU Jia-xin,CHEN Xin-wen,XIE Tian-en
(Wuhan Institute of Virology,CAS,Wuhan 430071,China)
ZHOU Xian-min,YANG Chun-hua
(Guizhou Province Forest Academy of Sciences,Guiyan 550011,China)
, 百拇医药
SHENG Rui-ju
(Wuhan Health Control Station,Hankou 430022,China)
CHEN Shi-wei
(Yunnan Province Forest Academy of Sciences,Kunming 650000,China)
Abstract:The development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV) insecticide is reported.The formulation is an oil-in-water emulsion and the concentration of polyhedrosis is 2.5×109 PIB/mL.The auxiliary materials come from the agriculture products.It is safety and the viral insecticide contained no any pathogenic bacteria.The average mortality is 85.5% when the second instar larvae were infected by 106 PIB/mL DpwCPV.
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Key words:Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV);Viral insecticide;Forestry;Formulation
文山松毛虫(Dendrolimus punctatus wenshanensis)属鳞翅目，枯叶蛾科。分布在云南(文山、红河、昆明等地)、贵州(兴义、望谟、盘县等地)，是林业的一种重要害虫[1～3]。松毛虫(其中包括马尾松毛虫、云南松毛虫、赤松毛虫、文山松毛虫等)是中国林业的一种重要害虫，每年危害面积达800万公顷，给林业生产和环境带来了极大的危害。仅湖北省一年就有15万公顷松林被马尾松毛虫危害，湖南、四川等省受云南松毛虫的危害十分严重。广东、广西、福建等省主要受马尾松毛虫的危害。我们从1991年开始进行松毛虫病毒杀虫剂的研制，经过多年努力，取得了良好的效果。现将试验结果报道如下：
1 材料与方法
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1.1 材料
文山松毛虫质型多角体病毒病死虫尸由云南省林科院提供[4]。
文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂(简称DpwCPV-HL)由中国科学院武汉病毒研究所病毒室提供，多角体含量为2.5×109PIB/mL。实验用纯系昆明小白鼠由中国科学院武汉病毒研究所实验动物饲养中心提供。
1.2 方法
1.2.1 差速离心提取多角体
将病死虫尸加适量无菌水置高速组织匀浆器皿中匀浆3min，取出按1∶10加蒸馏水，先用低速(500r/min)离心3min，除去沉淀和细胞组织碎片，取上清液再用高速(3500r/min)离心30min，收集沉淀用蒸馏水悬浮，重复交替使用上述方法2～3次，得较纯净的DpwCPV多角体置冰箱保存备用。
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1.2.2 DpwCPV多角体的计数
准确称取湿重1.0g提纯的多角体，以蒸馏水稀释成10mL，然后按10倍梯度依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，充分摇匀。用移液管吸取配制好的悬液置预先准备的血球计数板上，静止2～3min后，置光学显微镜下计数，采用五点取样法，以每个大格中多角体数目不超过30个为宜(比较不同的稀释度)，重复3次，取其平均值，所得结果按下述公式计算：
多角体浓度(PIB/mL)=五大格的多角体数×5×104×稀释倍数
1.2.3 辅助剂的筛选
筛选经济、取材方便、便于运输，在常温下保存三年不影响病毒活性的辅助剂。文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂主要为乳悬剂。
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1.2.4 DpwCPV-HL制剂的产品质量检测和安全性试验[5～7]
将DpwCPV-HL制剂进行产品活性测定和安全性检测，对病毒原生物活性与制成产品后的生物活性进行比较，按常规毒力测定方法进行。同时，根据国际标准(FB4789、1-4789、24-48)对所研制的产品进行病原微生物的检测，检测的主要对象是沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和细菌总数等八项指标。经检验合格后，再进行实验动物的急性试验，以保证产品的安全性和稳定性，按照Horn氏方法进行[5]。
1.2.5 微生物检验
按我国卫生防疫细菌检验方法进行逐项检查[7]。
1.2.5.1 杂菌总数检测 取DpwCPV-HL制剂1mL注入无菌平皿中，同时取制剂1mL作10-1～10-9稀释，取各稀释液1mL分别注入无菌平皿中，再加入事先溶化并冷至45℃细菌培养基，摇匀，待冷却后放入37℃恒温箱培养24h，取出作菌落计数。
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1.2.5.2 大肠杆菌群检测 用无菌吸液管吸取病毒制剂1、0.1、0.01、0.001mL分别接种到4支单倍乳糖发酵管中，经37℃培养18～24h，若有产酸产气管则转接伊红美兰平板，挑选可疑菌落做重复发酵试验，乳糖管不产酸不产气者即为大肠杆菌群阴性。
1.2.6 致病菌检测 取病毒制剂5mL加无菌水495mL，加化学沉淀剂，充分摇匀，静置60min，将上清液倒入另一无菌瓶中备用，取沉淀直接做下列菌的分离，按常规法作进一步鉴定。
1.2.6.1 志贺氏菌 直接分离法：取0.1mL沉淀直接用SS平板分离。增菌培养：取病毒制剂0.5mL接种10mL单倍9N增菌液，再取病毒稀释液100mL，接种100mL双倍GN增菌液，将上述二种培养液置37℃恒温培养箱中培养6～8h后，用SS和HE平板进行分离。
1.2.6.2 沙门氏细菌 检验沙门氏菌需先接种选择性不同的增菌培养基。取病毒制剂0.5mL接种于单倍SEM增菌液中，在37℃恒温箱中培养18～24h后用SS和HE平板分离。另取前述病毒制剂稀释液100mL注入双倍SEN增菌液，置37℃恒温培养箱中培养18～24h，再经SS，WS及麦康凯平板分离。
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1.2.6.3 耶尔森氏菌 取沉淀0.5mL直接用麦康凯平板分离，置25℃培养48h。
1.2.6.4 穹肠弯曲菌 取沉淀0.1mL直接用布氏平板分离，置42℃培养48h。
1.2.6.5 弧菌 取病毒制剂0.5mL接种于10mL单倍硷胨水，另取前述病毒制剂稀释液100mL接种二倍碱胨水。然后分别装入37℃恒温箱中培养12h后转接大平板分离。
1.2.6.6 化脓性球菌 取沉淀0.1mL直接用皿平板分离，另取沉淀1mL接种10mL却浦曼增菌液置37℃恒温培养箱中培养22～24h后转接却浦曼平板。
1.2.6.7 炭疽杆菌 取沉淀0.1mL直接用平板分离。
1.2.6.8 厌氧菌 取沉淀1mL接种疱肉培养基增菌48h后转接皿平板作厌氧培养。
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1.2.7 动物急性毒性实验
动物急性毒性实验参照陈尔厚等[4]方法进行，分为口服、灌胃、腹腔注射共三个处理，每个处理设实验2组和对照组2组，每组10只纯系昆明小白鼠，雌雄各5只，每只重18～20g。
1.2.7.1 口服组
取1∶100倍DpwCPV-HL制剂稀释液1.6mL(每只用量0.32mL)，均匀拌入5粒固体饲料上，分别让5只小白鼠自然取食，隔日一次，吃完后再添加新鲜饲料。连续饲喂一周。其接种剂量按体重计为4×108PIB/kg，相当大田使用浓度的160倍。口服对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。
1.2.7.2 腹腔注射组 取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(约2×106PIB)分别给小白鼠作腹腔注射，隔日一次，共4次，总有效剂量为4×108PIB/kg体重。只。腹腔注射对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。
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1.2.7.3 灌胃组 取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(2×106PIB)分别给每只小白鼠作灌胃，隔日一次，共4次，有效剂量为4×108PIB/kg体重。只。灌胃对照组用不含DpwCPV-HL制剂辅助剂作同样处理。
2 结果与讨论
2.1 DpwCPV多角体计数
经纯化的多角体含量为5×109PIB/mL。
2.2 DpwCPV-HL制剂辅助剂的选择
有效成分为：湿润剂有茶枯粉、中性肥皂粉；乳化剂有656H、656L；保护剂有荧光素、荧光素钠、黄连素、甘油等佐剂，经过严格的筛选，对每一种成分都进行毒性试验。结果表明，上述所加佐剂对被测试幼虫均无不良的影响，其死亡率在2.8%～12%之间，与对照无明显差异(5.4%)，详见表1。
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表1 DpwCPV-HL制剂的辅助剂对松毛虫的毒力测定
Table 1 Selection of assistant agent for the DpwCPV-HL viral insecticide 辅助剂名称
Name of assistant agent
for insecticide
供试含量(%)
Dose
供试虫数(头)*
Tested larvae*
死虫数(头)
, 百拇医药
Died larvae
死亡率(%)
Mortality
中性肥皂粉Neutral soap
0.3
37
3
8.1
茶枯粉Tea seed power
2.0
34
4
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12.0
656H
0.3
37
4
2.9
656L
0.3
34
1
5.4
荧光素钠Sodium fluorescein
0.02
, 百拇医药
35
2
5.7
黄连素Berberine
0.02
35
3
8.7
甘油Glycerin
10.0
35
1
2.8
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CK
0.0
37
2
5.4
*二龄幼虫 Second instar
DpwCPV-HL制剂所用辅助剂选用656H乳化剂、光保护剂和病毒保护剂为基础材料，另加非极性佐剂制成油乳剂。其方法简洁、经济、有效，既可用于常规喷雾，又可用于超低容量喷雾；它能以任何比例与水混合，不沉淀、不堵塞喷头、无毒、无臭，使用安全，运输方便。
2.3 剂型研制工艺
2.3.1 剂型配制
将提纯的多角体经血球计数板在光学显微镜下计数后，准确称取其多角体的重量(以克为单位)，按每毫升25亿多角体进行配制；配制时按比例计算所需水、光保护剂、乳化剂、及佐剂的量，然后按先后顺序依次将各种佐剂和水徐徐加入，在电动搅拌机中搅拌使其混合均匀，搅拌时应尽量避免产生气泡或泡沫，以免影响灌封机操作。
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2.3.2 剂型包装
DpwCPV-HL制剂为一种水溶性的油乳剂，采用上海制药机械厂生产的LSAG5/10 I型单针头机械式安瓿拉丝灌封机进行灌封，每毫升含有效成分(多角体)20亿，每安瓿装5mL(详见图1)。
2.4 产品毒力测定
用2龄马尾松毛虫幼虫为供试昆虫，每组30头，重复三次，将DpwCPV-HL制剂稀释成1×106PIB/mL感染浓度添食松毛虫幼虫，在温度23～25℃。湿度80～85%的情况下，接毒12d后，幼虫死亡率高达90.2%，最低71%，平均达85.5%。表达DpwCPV-HL制剂对马尾松毛虫具有较高的毒性和致病性[4]。
2.5 DpwCPV-HL剂制对动物安全性检测
2.5.1 动物急性毒性试验
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动物急性毒性试验结果见表2。
表2 DpwCPV-HL制剂对小白鼠的毒性试验
Table 2 Toxicity test to mice with DpwCPV-HL viral insecticides 接种途径
Inoculation
ways
接种剂量
Inoculated dose PIB/kg
试验动物
数量(只)
Trial
, 百拇医药
animal number
供试天数(天)
Trial days
外表病症a：呼吸，皮肤，脱毛，死亡
Character of Outside body (Breathe,skin,lose hair death)
b解剖内脏，心，肺，脾，胃等的变化
Character of inside Body (Heart,lung,Spleen and stomach)
口服组
Oral
, 百拇医药
4×108PIB/kg
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
(CK)
♀
5
, 百拇医药
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
腹腔注射
Abdomina
l4×108PIB/kg
♀
5
14
, 百拇医药
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
(CK)
♀
5
14
无异常
无异常
♂
, http://www.100md.com 5
Normal
Normal
胃组
stomach
4×108PIB/kg
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
, 百拇医药
Normal
Normal
CK
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
a外表病症：呼吸、皮肤、脱毛和死亡变化 Characteristics of outside body:breathe,skin,lose hair deaths,etc.
, 百拇医药
b解剖心、肺、脾和胃，观察其病理变化 Characteristics of inside body:heart,lung,spleen,stomach,etc.
2.5.2 病原微生物检测
按照我国卫生防疫细菌检验方法进行检查[7]，结果详见表3。
2.6 DpwCPV-HL剂制防治松毛虫的田间试验
1993年5月在宁乡灰塘林场，选择林分适中、虫情中等、树高3～5米的马尾松林地进行野外田间试验。设置3个处理：A)松毛虫赤眼锋(18～22.5万头/hm2)；B)松毛虫赤眼蜂携带病毒(18～22.5万头+DpwCPV 2.75×1010PIB/hm2)；C)DpwCPV-HL病毒制剂(2.75×1010PIB/hm2)；1994年5月在长沙浏阳林场进行大田试验，除上述处理外，增加一项化学农药试验(Decise 375ml/hm2)。放蜂前和放蜂后均做虫口基数调查。处理后分别于5d、10d、15d调查现有活虫数，计算虫口下降率。累计调查结果见表4。
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图1 病毒制剂的生产工艺示意图
Fig.1 Production technology of viral insecticide
由表4可知，单用松毛虫赤眼锋防治马尾松毛虫调查效果为45.3%～86.8%，平均为66.08%，与张帆等(私人通讯1995)试验结果一致。而松毛虫赤眼蜂携带病毒防治效果为87.78%～95.20%，平均为91.50%。
表3 三种病毒制剂的微生物学检测结果比较
Table 3 Comparison of disease organism examination with three viral insecticides 杀虫剂种类
Sorts of
, 百拇医药 pesticide
细菌总数
(个/ml)
Bacterial/
mL
检测项目 Deteching items
大肠
杆菌
E.coli
沙门
氏菌
Salm-
onella
, 百拇医药
志贺
氏菌
Shi-
gella
穹肠
弯曲菌
Camp
jejuni
耶尔森
氏菌
Yersinia enteroco lltica
炭疽
杆菌
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Bacillus anthracis
厌氧菌
Anaero-
bacteria化脓性
球菌
Staphylococus
弧菌
Vibrio paraha
emolyticus
BsNPV-90-HL*
1.2×106
, 百拇医药
-
-
-
-
-
-
-
-
-
TM-Bio-control-1
107-109
-
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-
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-
-
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-
DpwCPV-HL
4.5×104
-
-
-
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, 百拇医药
-
-
-
-
-
*油桐尺蠖病毒杀虫剂，BsSNPV viral insecticides;**午毒蛾病毒杀虫剂，LdMNPV viral insecticides表4 DpwCPV-HL制剂防治松毛虫田间试验结果
Table 4 The test results of DpwCPV-HL viral insecticide controlling the pest in the field 供试地点
Place of trials
, 百拇医药 供试项目
Contents
试验面积
Trial area (hm2)
虫口基数
Insects
防治效果
Mortality(%)
宁乡林场
Linxiang
Forestry Farm
寄生蜂
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(Trichogramma M.)
0.33
165
45.37
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M+CPV)
0.33
600
87.78
病毒(CPV)*
2.00
345
, 百拇医药
99.50
长沙林场
Changsha
Forestry Farm
寄生蜂
(Trichogramma M.)
1.00
150
86.80
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M+CPV)
0.67
, 百拇医药
150
95.20
病毒(CPV)*
1.00
105
96.00
化学农药(Decise)*
0.67
90
99.10
应城市
团山林场
, 百拇医药
Yinchen
Forestry Farm
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M.+CPV)
100
139
91.00
*注：置初孵幼虫期使用病毒和化学农药的结果
The results of using viral insecticide and chemical for the lower instar larvae.
综上所述，DpwCPV-HL制剂的研制、多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型加工、产品包装以及产品质量检测等均取得了良好的效果。该制剂性能稳定，所选辅助剂符合配制杀虫剂的要求，对环境不会造成任何污染；产品经武汉市卫生防疫站进行的安全检测，符合国家卫生标准，无任何致病菌；生物测定结果表明，用1×106PIB/mL感染2龄马尾松毛虫幼虫，其死亡率平均为85.5%；对试验动物无任何致病性和毒性。在该制剂中不含有任何致病菌，对人畜安全无害。
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彭辉银(1950年-),男,湖北秭归人.研究员.主要从事昆虫病毒资源的调查、病毒的分离鉴定、病毒杀虫剂的生产及应用研究.
参考文献
[1]林业部南方植物检疫所编.防治棉毛虫专辑[C].北京：中国林业出版社，1983.3～8
[2]林业部南方植物检疫所编.防治棉毛虫专辑[C].北京：中国林业出版社，1983.9～16
[3]林业部南方植物检疫所编.防治棉毛虫专辑[C].北京：中国林业出版社，1983.24～34
[4]陈尔厚，陈杨维，段兆尧，等.文山松毛虫质型多角体病毒生物活性测定[J].云南农业科技，1987.1：54～57
[5]Martin Shapiro,In:Kurstak,E M ed.Microbial and Viral Pesticides [C].New Youk:Marcel Dekker,Inc.1982.483～484
[6]祝庆荃，刘军.油桐尺蠖核型多角体病毒对实验动物的毒性试验[J].中国茶叶，1982，4：30～32
[7]高树德，汪美先主编.防疫检验手册[C].北京：人民卫生出版社，1981.22～85
1999-06-04
1999-07-19, 百拇医药
单位：彭辉银 刘家欣 陈新文 谢天恩(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)周显明 杨春华(贵州省林业科学研究院，贵阳 550011)；沈瑞菊(武汉市卫生防疫站，武汉 430032)；陈世维(云南省林业科学研究院森林保护研究所，昆明 650000)
关键词：文山松毛虫质型多角体病毒；杀虫剂；林业；制剂
中国病毒学000209 摘要：报道了文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制，包括多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型研制、产品包装以及病毒杀虫剂的产品质量检测及生产等。该杀虫剂为乳剂，多角体浓度达2.5×109PIB/mL；所选辅助剂取材方便、容易配制，对环境没有污染。经安全检测证明，无致病菌，符合国家卫生标准，对试验动物小白鼠无毒性和致病性。生物测定用1×106PIB/mL感染2龄文山松毛虫幼虫，其死亡率平均为85.5%。
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中图分类号：S482.3 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0149-07
Development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis virus (DpwCPV) Insecticide
PENG Hui-yin,LIU Jia-xin,CHEN Xin-wen,XIE Tian-en
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SHENG Rui-ju
(Wuhan Health Control Station,Hankou 430022,China)
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Abstract:The development of Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV) insecticide is reported.The formulation is an oil-in-water emulsion and the concentration of polyhedrosis is 2.5×109 PIB/mL.The auxiliary materials come from the agriculture products.It is safety and the viral insecticide contained no any pathogenic bacteria.The average mortality is 85.5% when the second instar larvae were infected by 106 PIB/mL DpwCPV.
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Key words:Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasm Polyhedrosis Virus (DpwCPV);Viral insecticide;Forestry;Formulation
文山松毛虫(Dendrolimus punctatus wenshanensis)属鳞翅目，枯叶蛾科。分布在云南(文山、红河、昆明等地)、贵州(兴义、望谟、盘县等地)，是林业的一种重要害虫[1～3]。松毛虫(其中包括马尾松毛虫、云南松毛虫、赤松毛虫、文山松毛虫等)是中国林业的一种重要害虫，每年危害面积达800万公顷，给林业生产和环境带来了极大的危害。仅湖北省一年就有15万公顷松林被马尾松毛虫危害，湖南、四川等省受云南松毛虫的危害十分严重。广东、广西、福建等省主要受马尾松毛虫的危害。我们从1991年开始进行松毛虫病毒杀虫剂的研制，经过多年努力，取得了良好的效果。现将试验结果报道如下：
1 材料与方法
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1.1 材料
文山松毛虫质型多角体病毒病死虫尸由云南省林科院提供[4]。
文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂(简称DpwCPV-HL)由中国科学院武汉病毒研究所病毒室提供，多角体含量为2.5×109PIB/mL。实验用纯系昆明小白鼠由中国科学院武汉病毒研究所实验动物饲养中心提供。
1.2 方法
1.2.1 差速离心提取多角体
将病死虫尸加适量无菌水置高速组织匀浆器皿中匀浆3min，取出按1∶10加蒸馏水，先用低速(500r/min)离心3min，除去沉淀和细胞组织碎片，取上清液再用高速(3500r/min)离心30min，收集沉淀用蒸馏水悬浮，重复交替使用上述方法2～3次，得较纯净的DpwCPV多角体置冰箱保存备用。
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1.2.2 DpwCPV多角体的计数
准确称取湿重1.0g提纯的多角体，以蒸馏水稀释成10mL，然后按10倍梯度依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，充分摇匀。用移液管吸取配制好的悬液置预先准备的血球计数板上，静止2～3min后，置光学显微镜下计数，采用五点取样法，以每个大格中多角体数目不超过30个为宜(比较不同的稀释度)，重复3次，取其平均值，所得结果按下述公式计算：
多角体浓度(PIB/mL)=五大格的多角体数×5×104×稀释倍数
1.2.3 辅助剂的筛选
筛选经济、取材方便、便于运输，在常温下保存三年不影响病毒活性的辅助剂。文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂主要为乳悬剂。
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1.2.4 DpwCPV-HL制剂的产品质量检测和安全性试验[5～7]
将DpwCPV-HL制剂进行产品活性测定和安全性检测，对病毒原生物活性与制成产品后的生物活性进行比较，按常规毒力测定方法进行。同时，根据国际标准(FB4789、1-4789、24-48)对所研制的产品进行病原微生物的检测，检测的主要对象是沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌和细菌总数等八项指标。经检验合格后，再进行实验动物的急性试验，以保证产品的安全性和稳定性，按照Horn氏方法进行[5]。
1.2.5 微生物检验
按我国卫生防疫细菌检验方法进行逐项检查[7]。
1.2.5.1 杂菌总数检测 取DpwCPV-HL制剂1mL注入无菌平皿中，同时取制剂1mL作10-1～10-9稀释，取各稀释液1mL分别注入无菌平皿中，再加入事先溶化并冷至45℃细菌培养基，摇匀，待冷却后放入37℃恒温箱培养24h，取出作菌落计数。
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1.2.5.2 大肠杆菌群检测 用无菌吸液管吸取病毒制剂1、0.1、0.01、0.001mL分别接种到4支单倍乳糖发酵管中，经37℃培养18～24h，若有产酸产气管则转接伊红美兰平板，挑选可疑菌落做重复发酵试验，乳糖管不产酸不产气者即为大肠杆菌群阴性。
1.2.6 致病菌检测 取病毒制剂5mL加无菌水495mL，加化学沉淀剂，充分摇匀，静置60min，将上清液倒入另一无菌瓶中备用，取沉淀直接做下列菌的分离，按常规法作进一步鉴定。
1.2.6.1 志贺氏菌 直接分离法：取0.1mL沉淀直接用SS平板分离。增菌培养：取病毒制剂0.5mL接种10mL单倍9N增菌液，再取病毒稀释液100mL，接种100mL双倍GN增菌液，将上述二种培养液置37℃恒温培养箱中培养6～8h后，用SS和HE平板进行分离。
1.2.6.2 沙门氏细菌 检验沙门氏菌需先接种选择性不同的增菌培养基。取病毒制剂0.5mL接种于单倍SEM增菌液中，在37℃恒温箱中培养18～24h后用SS和HE平板分离。另取前述病毒制剂稀释液100mL注入双倍SEN增菌液，置37℃恒温培养箱中培养18～24h，再经SS，WS及麦康凯平板分离。
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1.2.6.3 耶尔森氏菌 取沉淀0.5mL直接用麦康凯平板分离，置25℃培养48h。
1.2.6.4 穹肠弯曲菌 取沉淀0.1mL直接用布氏平板分离，置42℃培养48h。
1.2.6.5 弧菌 取病毒制剂0.5mL接种于10mL单倍硷胨水，另取前述病毒制剂稀释液100mL接种二倍碱胨水。然后分别装入37℃恒温箱中培养12h后转接大平板分离。
1.2.6.6 化脓性球菌 取沉淀0.1mL直接用皿平板分离，另取沉淀1mL接种10mL却浦曼增菌液置37℃恒温培养箱中培养22～24h后转接却浦曼平板。
1.2.6.7 炭疽杆菌 取沉淀0.1mL直接用平板分离。
1.2.6.8 厌氧菌 取沉淀1mL接种疱肉培养基增菌48h后转接皿平板作厌氧培养。
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1.2.7 动物急性毒性实验
动物急性毒性实验参照陈尔厚等[4]方法进行，分为口服、灌胃、腹腔注射共三个处理，每个处理设实验2组和对照组2组，每组10只纯系昆明小白鼠，雌雄各5只，每只重18～20g。
1.2.7.1 口服组
取1∶100倍DpwCPV-HL制剂稀释液1.6mL(每只用量0.32mL)，均匀拌入5粒固体饲料上，分别让5只小白鼠自然取食，隔日一次，吃完后再添加新鲜饲料。连续饲喂一周。其接种剂量按体重计为4×108PIB/kg，相当大田使用浓度的160倍。口服对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。
1.2.7.2 腹腔注射组 取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(约2×106PIB)分别给小白鼠作腹腔注射，隔日一次，共4次，总有效剂量为4×108PIB/kg体重。只。腹腔注射对照组用不含DpwCPV-HL制剂的辅助剂作同样处理。
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1.2.7.3 灌胃组 取DpwCPV-HL制剂稀释液0.32mL(2×106PIB)分别给每只小白鼠作灌胃，隔日一次，共4次，有效剂量为4×108PIB/kg体重。只。灌胃对照组用不含DpwCPV-HL制剂辅助剂作同样处理。
2 结果与讨论
2.1 DpwCPV多角体计数
经纯化的多角体含量为5×109PIB/mL。
2.2 DpwCPV-HL制剂辅助剂的选择
有效成分为：湿润剂有茶枯粉、中性肥皂粉；乳化剂有656H、656L；保护剂有荧光素、荧光素钠、黄连素、甘油等佐剂，经过严格的筛选，对每一种成分都进行毒性试验。结果表明，上述所加佐剂对被测试幼虫均无不良的影响，其死亡率在2.8%～12%之间，与对照无明显差异(5.4%)，详见表1。
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表1 DpwCPV-HL制剂的辅助剂对松毛虫的毒力测定
Table 1 Selection of assistant agent for the DpwCPV-HL viral insecticide 辅助剂名称
Name of assistant agent
for insecticide
供试含量(%)
Dose
供试虫数(头)*
Tested larvae*
死虫数(头)
, 百拇医药
Died larvae
死亡率(%)
Mortality
中性肥皂粉Neutral soap
0.3
37
3
8.1
茶枯粉Tea seed power
2.0
34
4
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12.0
656H
0.3
37
4
2.9
656L
0.3
34
1
5.4
荧光素钠Sodium fluorescein
0.02
, 百拇医药
35
2
5.7
黄连素Berberine
0.02
35
3
8.7
甘油Glycerin
10.0
35
1
2.8
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CK
0.0
37
2
5.4
*二龄幼虫 Second instar
DpwCPV-HL制剂所用辅助剂选用656H乳化剂、光保护剂和病毒保护剂为基础材料，另加非极性佐剂制成油乳剂。其方法简洁、经济、有效，既可用于常规喷雾，又可用于超低容量喷雾；它能以任何比例与水混合，不沉淀、不堵塞喷头、无毒、无臭，使用安全，运输方便。
2.3 剂型研制工艺
2.3.1 剂型配制
将提纯的多角体经血球计数板在光学显微镜下计数后，准确称取其多角体的重量(以克为单位)，按每毫升25亿多角体进行配制；配制时按比例计算所需水、光保护剂、乳化剂、及佐剂的量，然后按先后顺序依次将各种佐剂和水徐徐加入，在电动搅拌机中搅拌使其混合均匀，搅拌时应尽量避免产生气泡或泡沫，以免影响灌封机操作。
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2.3.2 剂型包装
DpwCPV-HL制剂为一种水溶性的油乳剂，采用上海制药机械厂生产的LSAG5/10 I型单针头机械式安瓿拉丝灌封机进行灌封，每毫升含有效成分(多角体)20亿，每安瓿装5mL(详见图1)。
2.4 产品毒力测定
用2龄马尾松毛虫幼虫为供试昆虫，每组30头，重复三次，将DpwCPV-HL制剂稀释成1×106PIB/mL感染浓度添食松毛虫幼虫，在温度23～25℃。湿度80～85%的情况下，接毒12d后，幼虫死亡率高达90.2%，最低71%，平均达85.5%。表达DpwCPV-HL制剂对马尾松毛虫具有较高的毒性和致病性[4]。
2.5 DpwCPV-HL剂制对动物安全性检测
2.5.1 动物急性毒性试验
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动物急性毒性试验结果见表2。
表2 DpwCPV-HL制剂对小白鼠的毒性试验
Table 2 Toxicity test to mice with DpwCPV-HL viral insecticides 接种途径
Inoculation
ways
接种剂量
Inoculated dose PIB/kg
试验动物
数量(只)
Trial
, 百拇医药
animal number
供试天数(天)
Trial days
外表病症a：呼吸，皮肤，脱毛，死亡
Character of Outside body (Breathe,skin,lose hair death)
b解剖内脏，心，肺，脾，胃等的变化
Character of inside Body (Heart,lung,Spleen and stomach)
口服组
Oral
, 百拇医药
4×108PIB/kg
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
(CK)
♀
5
, 百拇医药
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
腹腔注射
Abdomina
l4×108PIB/kg
♀
5
14
, 百拇医药
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
(CK)
♀
5
14
无异常
无异常
♂
, http://www.100md.com 5
Normal
Normal
胃组
stomach
4×108PIB/kg
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
, 百拇医药
Normal
Normal
CK
♀
5
14
无异常
无异常
♂
5
Normal
Normal
a外表病症：呼吸、皮肤、脱毛和死亡变化 Characteristics of outside body:breathe,skin,lose hair deaths,etc.
, 百拇医药
b解剖心、肺、脾和胃，观察其病理变化 Characteristics of inside body:heart,lung,spleen,stomach,etc.
2.5.2 病原微生物检测
按照我国卫生防疫细菌检验方法进行检查[7]，结果详见表3。
2.6 DpwCPV-HL剂制防治松毛虫的田间试验
1993年5月在宁乡灰塘林场，选择林分适中、虫情中等、树高3～5米的马尾松林地进行野外田间试验。设置3个处理：A)松毛虫赤眼锋(18～22.5万头/hm2)；B)松毛虫赤眼蜂携带病毒(18～22.5万头+DpwCPV 2.75×1010PIB/hm2)；C)DpwCPV-HL病毒制剂(2.75×1010PIB/hm2)；1994年5月在长沙浏阳林场进行大田试验，除上述处理外，增加一项化学农药试验(Decise 375ml/hm2)。放蜂前和放蜂后均做虫口基数调查。处理后分别于5d、10d、15d调查现有活虫数，计算虫口下降率。累计调查结果见表4。
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图1 病毒制剂的生产工艺示意图
Fig.1 Production technology of viral insecticide
由表4可知，单用松毛虫赤眼锋防治马尾松毛虫调查效果为45.3%～86.8%，平均为66.08%，与张帆等(私人通讯1995)试验结果一致。而松毛虫赤眼蜂携带病毒防治效果为87.78%～95.20%，平均为91.50%。
表3 三种病毒制剂的微生物学检测结果比较
Table 3 Comparison of disease organism examination with three viral insecticides 杀虫剂种类
Sorts of
, 百拇医药 pesticide
细菌总数
(个/ml)
Bacterial/
mL
检测项目 Deteching items
大肠
杆菌
E.coli
沙门
氏菌
Salm-
onella
, 百拇医药
志贺
氏菌
Shi-
gella
穹肠
弯曲菌
Camp
jejuni
耶尔森
氏菌
Yersinia enteroco lltica
炭疽
杆菌
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Bacillus anthracis
厌氧菌
Anaero-
bacteria化脓性
球菌
Staphylococus
弧菌
Vibrio paraha
emolyticus
BsNPV-90-HL*
1.2×106
, 百拇医药
-
-
-
-
-
-
-
-
-
TM-Bio-control-1
107-109
-
-
, http://www.100md.com
-
-
-
-
-
-
-
DpwCPV-HL
4.5×104
-
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
-
-
*油桐尺蠖病毒杀虫剂，BsSNPV viral insecticides;**午毒蛾病毒杀虫剂，LdMNPV viral insecticides表4 DpwCPV-HL制剂防治松毛虫田间试验结果
Table 4 The test results of DpwCPV-HL viral insecticide controlling the pest in the field 供试地点
Place of trials
, 百拇医药 供试项目
Contents
试验面积
Trial area (hm2)
虫口基数
Insects
防治效果
Mortality(%)
宁乡林场
Linxiang
Forestry Farm
寄生蜂
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(Trichogramma M.)
0.33
165
45.37
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M+CPV)
0.33
600
87.78
病毒(CPV)*
2.00
345
, 百拇医药
99.50
长沙林场
Changsha
Forestry Farm
寄生蜂
(Trichogramma M.)
1.00
150
86.80
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M+CPV)
0.67
, 百拇医药
150
95.20
病毒(CPV)*
1.00
105
96.00
化学农药(Decise)*
0.67
90
99.10
应城市
团山林场
, 百拇医药
Yinchen
Forestry Farm
寄生蜂+病毒
(Trichogramma M.+CPV)
100
139
91.00
*注：置初孵幼虫期使用病毒和化学农药的结果
The results of using viral insecticide and chemical for the lower instar larvae.
综上所述，DpwCPV-HL制剂的研制、多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型加工、产品包装以及产品质量检测等均取得了良好的效果。该制剂性能稳定，所选辅助剂符合配制杀虫剂的要求，对环境不会造成任何污染；产品经武汉市卫生防疫站进行的安全检测，符合国家卫生标准，无任何致病菌；生物测定结果表明，用1×106PIB/mL感染2龄马尾松毛虫幼虫，其死亡率平均为85.5%；对试验动物无任何致病性和毒性。在该制剂中不含有任何致病菌，对人畜安全无害。
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彭辉银(1950年-),男,湖北秭归人.研究员.主要从事昆虫病毒资源的调查、病毒的分离鉴定、病毒杀虫剂的生产及应用研究.
参考文献
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[2]林业部南方植物检疫所编.防治棉毛虫专辑[C].北京：中国林业出版社，1983.9～16
[3]林业部南方植物检疫所编.防治棉毛虫专辑[C].北京：中国林业出版社，1983.24～34
[4]陈尔厚，陈杨维，段兆尧，等.文山松毛虫质型多角体病毒生物活性测定[J].云南农业科技，1987.1：54～57
[5]Martin Shapiro,In:Kurstak,E M ed.Microbial and Viral Pesticides [C].New Youk:Marcel Dekker,Inc.1982.483～484
[6]祝庆荃，刘军.油桐尺蠖核型多角体病毒对实验动物的毒性试验[J].中国茶叶，1982，4：30～32
[7]高树德，汪美先主编.防疫检验手册[C].北京：人民卫生出版社，1981.22～85
1999-06-04
1999-07-19, 百拇医药