hIL-3突变体在大肠杆菌中的表达及纯化
作者：王燕 毛琼国 万瑛 纪贤文 刘昕
单位：王燕(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；毛琼国(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；万瑛(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；纪贤文(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；刘昕(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)
关键词：hIL-3突变体；大肠杆菌；纯化
第三军医大学学报000110
提要 目的：将天然型hIL-3蛋白经定点突变为hIL-3突变体蛋白，并在大肠杆菌中表达及纯化。方法：超声破碎细菌得到包涵体，经DEAEFastFlow,SephaecrylS-200HR等层析步骤纯化。结果：经以上一系列纯化，得到的人IL-3突变体蛋白纯度达90%，比活性为7.3×104U/ml，总回收率为100%。结论：突变体hIL-3在大肠杆菌中得到高效表达，并获得高纯度、高活性的hIL-3蛋白。
, 百拇医药
中图法分类号 R378.21;R394 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0033-03
Purification of hIL-3 mutant highly expressed in E.coli
WANG Yan,MAO Qiong-guo,WAN Yin,JI Xian-wen,LIU Xin
(Department of Molecular Biology,Faculty of Basic Medical Sciences,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To purify hIL-3 mutant from E.coli.Methods:Inclusion bodies were collected after the breakage of bacteria.Then the pure hIL-3 mutant was obtained by DEAE sepharose fast flow and sephacry1S-200HR.Results:The purity of the product was about 90%.In vitro test of the TF-1 cells showed the relative activity of hIL-3 mutant was 7.3× 104 unit/ml.The total recovery of this protocol was approximately 100%.Conclusion：hIL-3 mutant is highly expressed in E.coli.hIL-3 protein with high purity and activity is obtained.
, 百拇医药
Key words human IL-3 mutant; E.coli;purification
IL-3是由活化T细胞产生的一种多集落刺激因子，具有刺激造血细胞增殖分化和免疫调节功能。临床用于治疗造血障碍性疾病，收到较好的效果。hIL-3cDNA克隆化[1，2]及表达[3]为基础研究和临床应用提供了条件。但天然型IL-3蛋白由于自身的原因难以在大肠杆菌中高效表达，本室在前期工作中成功的将天然型的hIL-3蛋白进行改造，得到突变体hIL-3蛋白在大肠杆菌中高效表达。我们在此基础上，进一步对突变体hIL-3的纯化方法进行了研究。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
pSM53MVhIL-3质粒，由本室构建，宿主菌为E.coliTAP106，由第四军医大学陈苏民教授惠赠。
, http://www.100md.com
1.2 TF-I细胞
购于上海细胞所。
1.3 试剂SephaecrylS-200HR,DEAE Sepharose Fast Flow购自美国Sigma公司。
1.4 诱导表达
将含有pSM53MVhIL-3的大肠杆菌经30℃增菌培养，再转42℃诱导表达，收获菌体。
1.5 包涵体处理
超声破碎细菌细胞，释放包涵体。离心10000r/min15min，弃上清，将沉淀用0.7mol/L尿素，0.5%TritonX-100,10mmol/LEDTA反复洗涤处理得纯化包涵体。包涵体用8mol/L盐酸胍含20mmol/Lβ-疏基乙醇溶解变性(pH8.5)。
, 百拇医药
1.6 复性
将变性溶解的hIL-3突变体蛋白离心10000r/min，15min，清除不溶性杂质，上清直接用复性液，50mmol/L Tris-HCl pH8.5,5mmol/L GSH(还原型谷胱甘肽)，5mmol/L GSSG(氧化型谷胱甘肽)，1mmol/LPMSF稀释，使蛋白质终浓度不超过100μg/ml，尿素终浓度为0.5～1mol/L，置4℃10h。超滤浓缩后用50mmol NaAc-HAC pH 6.0透析平衡。
1.6.1 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析 用50mmolNaAc-HACpH6.0平衡DEAE离子交换层析(1.5cm×20cm)。将浓缩平衡后蛋白柱液上柱，流速为1.5ml/min，收集Runthrough部分。
1.6.2 SephaecrylS-200HR凝胶过滤 将DEAE离子交换层析纯化的样品浓缩后，然后过Sephaecry1S-200HR凝胶过滤层析柱(1.5cm×50cm)进一步纯化，流速0.5ml/min，收集峰并进行SDS-PAGE分析。
, 百拇医药
1.7 活性测定
用IL-3依赖细胞株测活性[3]。
2 结果
2.1 包涵体处理
包涵体变性溶解后SDS-PAGE分析，结果见图1，其蛋白纯度约为90%。
图1 纯化hIL-3突变体蛋白SDS-PAGE分析
Fig1 SDS-PAGE analysis of purified hIL-3 matution protein
Lane1:mw standards;Lane2:Protein purified by sephaecryls-200HR;Lane 3:Protein purified by DEAE FF;Lane4:Inclusion body
, http://www.100md.com
2.2 DEAESepharoseFastF1ow离子交换层析
经诱导表达后得到hIL-3突变体蛋白，过DEAESepharoseFastFlow离子交换层析柱，见图2,hIL-3突变体蛋白主要集中在Run-through部分。
图2 hIL-3突变体DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析
Fig2 DEAE sepharose fast flow chromatography of
hIL-3 mutation protein
2.3 SephaecrylS-200HR凝胶过滤层析
, http://www.100md.com
收集DEAE Fast Flow分离的hIL-3进一步用Sephaecry1S-200HR凝胶过滤层析分离，取主峰进行SDS-PAGE分析鉴定其纯度达90%，见图3。
图3 hIL-3突变体Sephaecry1S-200 HR凝胶过滤层析
Fig3 Sephaecry IS-200 HR gel filtration of hIL-3
mutation protein
2.4 活性测定
用IL-3依赖细胞株检测经离子交换，凝胶过滤层析纯化处理的包涵体，后得到大肠杆菌表达有活性的hIL-3突变体蛋白，纯度90%以上的纯品，见表1。
, http://www.100md.com
表1 hIL-3突变体的活性测定
Tab1 Activity of hiL-3 mutant Purificativity stages
Activity(×104U/ml)
Inclusion bodies
1.2
DEAF FE
5.7
Sephaecry1 S-200HR
7.3
3 讨论
, http://www.100md.com
在E.coli中高效表达的外源基因产物都以包涵体的形式存在于其胞浆中[4]，暗视野显微镜下可见细胞浆内有折光性很强的颗粒。在进行hIL-3突变体纯化过程中，都将遇到包涵体的处理。因包涵体中除含有重组蛋白以外，还含有细菌杂蛋白，遗传物质及内毒素等成分。利用包涵体密度大，水不溶性特点，通过离心技术和低浓度变性剂0.7mol/L尿素，0.01%Triton-100反复洗涤，抽提大部分可溶性杂质，使包涵体纯度达到90%，其中比较了含1mg/ml脱氧胆酸钠(DOC)的TE溶液洗涤包涵体，效果不如0.7mol/L尿素，DOC的TE溶液可部分溶解包涵体，导致较多的hIL-3蛋白丢失。而包涵体的变性溶解及复性才是获得有效纯化的关键。包涵体变性溶解后，需要在适当条件下才能使重组蛋白正确折迭恢复活性，同时去除了一些不溶性沉淀的杂蛋白质，复性效率与蛋白质终浓度高低及复性速度有关。蛋白质浓度过高或复性过快都会造成复性不完全而形成较多沉淀。从我们的实验中发现复性时蛋白浓度应控制在100μg/ml以下，hIL-3突变体蛋白稀释到一定浓度才能避免分子间相互作用，相互缠绕。复性过程中尿素浓度保持在0.5～1mol/L之间，使其既能维持hIL-3突变体蛋白溶解性，又不干扰蛋白的折迭复性。直至将盐酸胍完全复性后溶液经10000r/min离心，去除不溶性沉淀，上清再经离子交换层析和凝胶过滤层析，得到hIL-3突变体蛋白纯品。用TF-1细胞检测其活性，达到7.3×104U/ml。此纯化结果表明我们在E.coli中变效表达了具有活性的hIL-3突变体，并初步解决了在大肠杆菌中表达hIL-3突变体的复性及纯化问题，得到了高纯度，高活性的hIL-3突变体，从而为hIL-3突变体的大规模生产，临床应用提供了条件，也为IL-3蛋白质的结构的研究提供了基础。
, 百拇医药
作者简介：王燕(1961.12)，女，江苏省常州市人，博士，讲师，主要从事蛋白质工程方面的研究，发表论文3篇。电话：(023)68752257
参考文献
[1]Merlin S，Rowold E，Abegg A，et al.Phage presentation and affinity selection of a deletion mutant of human interleukin-3[J].Appl iochem Biotechnol,1997,67(3):199-201.
[2]Phillips J A，Lopez A F，Milton S E，et al.Synthesis and expression of the gene encoding human interleukin-3[J].Gene,1989,84(2)：501-503.
[3]王燕，朱锡华 ，万瑛 ，等.人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究[J].中国免疫学杂志，1999,(1):12-14.
[4]Kane J F,Harthey D L.Formation of recombinant Protein inclusion bodies in Escherichia coli[J].Trends in Biotechology，1988，6(1):95-96.
收稿日期：1999-04-15
修回日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：王燕(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；毛琼国(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；万瑛(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；纪贤文(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)；刘昕(第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆 400038)
关键词：hIL-3突变体；大肠杆菌；纯化
第三军医大学学报000110
提要 目的：将天然型hIL-3蛋白经定点突变为hIL-3突变体蛋白，并在大肠杆菌中表达及纯化。方法：超声破碎细菌得到包涵体，经DEAEFastFlow,SephaecrylS-200HR等层析步骤纯化。结果：经以上一系列纯化，得到的人IL-3突变体蛋白纯度达90%，比活性为7.3×104U/ml，总回收率为100%。结论：突变体hIL-3在大肠杆菌中得到高效表达，并获得高纯度、高活性的hIL-3蛋白。
, 百拇医药
中图法分类号 R378.21;R394 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0033-03
Purification of hIL-3 mutant highly expressed in E.coli
WANG Yan,MAO Qiong-guo,WAN Yin,JI Xian-wen,LIU Xin
(Department of Molecular Biology,Faculty of Basic Medical Sciences,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
Abstract Objective:To purify hIL-3 mutant from E.coli.Methods:Inclusion bodies were collected after the breakage of bacteria.Then the pure hIL-3 mutant was obtained by DEAE sepharose fast flow and sephacry1S-200HR.Results:The purity of the product was about 90%.In vitro test of the TF-1 cells showed the relative activity of hIL-3 mutant was 7.3× 104 unit/ml.The total recovery of this protocol was approximately 100%.Conclusion：hIL-3 mutant is highly expressed in E.coli.hIL-3 protein with high purity and activity is obtained.
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Key words human IL-3 mutant; E.coli;purification
IL-3是由活化T细胞产生的一种多集落刺激因子，具有刺激造血细胞增殖分化和免疫调节功能。临床用于治疗造血障碍性疾病，收到较好的效果。hIL-3cDNA克隆化[1，2]及表达[3]为基础研究和临床应用提供了条件。但天然型IL-3蛋白由于自身的原因难以在大肠杆菌中高效表达，本室在前期工作中成功的将天然型的hIL-3蛋白进行改造，得到突变体hIL-3蛋白在大肠杆菌中高效表达。我们在此基础上，进一步对突变体hIL-3的纯化方法进行了研究。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
pSM53MVhIL-3质粒，由本室构建，宿主菌为E.coliTAP106，由第四军医大学陈苏民教授惠赠。
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1.2 TF-I细胞
购于上海细胞所。
1.3 试剂SephaecrylS-200HR,DEAE Sepharose Fast Flow购自美国Sigma公司。
1.4 诱导表达
将含有pSM53MVhIL-3的大肠杆菌经30℃增菌培养，再转42℃诱导表达，收获菌体。
1.5 包涵体处理
超声破碎细菌细胞，释放包涵体。离心10000r/min15min，弃上清，将沉淀用0.7mol/L尿素，0.5%TritonX-100,10mmol/LEDTA反复洗涤处理得纯化包涵体。包涵体用8mol/L盐酸胍含20mmol/Lβ-疏基乙醇溶解变性(pH8.5)。
, 百拇医药
1.6 复性
将变性溶解的hIL-3突变体蛋白离心10000r/min，15min，清除不溶性杂质，上清直接用复性液，50mmol/L Tris-HCl pH8.5,5mmol/L GSH(还原型谷胱甘肽)，5mmol/L GSSG(氧化型谷胱甘肽)，1mmol/LPMSF稀释，使蛋白质终浓度不超过100μg/ml，尿素终浓度为0.5～1mol/L，置4℃10h。超滤浓缩后用50mmol NaAc-HAC pH 6.0透析平衡。
1.6.1 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析 用50mmolNaAc-HACpH6.0平衡DEAE离子交换层析(1.5cm×20cm)。将浓缩平衡后蛋白柱液上柱，流速为1.5ml/min，收集Runthrough部分。
1.6.2 SephaecrylS-200HR凝胶过滤 将DEAE离子交换层析纯化的样品浓缩后，然后过Sephaecry1S-200HR凝胶过滤层析柱(1.5cm×50cm)进一步纯化，流速0.5ml/min，收集峰并进行SDS-PAGE分析。
, 百拇医药
1.7 活性测定
用IL-3依赖细胞株测活性[3]。
2 结果
2.1 包涵体处理
包涵体变性溶解后SDS-PAGE分析，结果见图1，其蛋白纯度约为90%。
图1 纯化hIL-3突变体蛋白SDS-PAGE分析
Fig1 SDS-PAGE analysis of purified hIL-3 matution protein
Lane1:mw standards;Lane2:Protein purified by sephaecryls-200HR;Lane 3:Protein purified by DEAE FF;Lane4:Inclusion body
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2.2 DEAESepharoseFastF1ow离子交换层析
经诱导表达后得到hIL-3突变体蛋白，过DEAESepharoseFastFlow离子交换层析柱，见图2,hIL-3突变体蛋白主要集中在Run-through部分。
图2 hIL-3突变体DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析
Fig2 DEAE sepharose fast flow chromatography of
hIL-3 mutation protein
2.3 SephaecrylS-200HR凝胶过滤层析
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收集DEAE Fast Flow分离的hIL-3进一步用Sephaecry1S-200HR凝胶过滤层析分离，取主峰进行SDS-PAGE分析鉴定其纯度达90%，见图3。
图3 hIL-3突变体Sephaecry1S-200 HR凝胶过滤层析
Fig3 Sephaecry IS-200 HR gel filtration of hIL-3
mutation protein
2.4 活性测定
用IL-3依赖细胞株检测经离子交换，凝胶过滤层析纯化处理的包涵体，后得到大肠杆菌表达有活性的hIL-3突变体蛋白，纯度90%以上的纯品，见表1。
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表1 hIL-3突变体的活性测定
Tab1 Activity of hiL-3 mutant Purificativity stages
Activity(×104U/ml)
Inclusion bodies
1.2
DEAF FE
5.7
Sephaecry1 S-200HR
7.3
3 讨论
, http://www.100md.com
在E.coli中高效表达的外源基因产物都以包涵体的形式存在于其胞浆中[4]，暗视野显微镜下可见细胞浆内有折光性很强的颗粒。在进行hIL-3突变体纯化过程中，都将遇到包涵体的处理。因包涵体中除含有重组蛋白以外，还含有细菌杂蛋白，遗传物质及内毒素等成分。利用包涵体密度大，水不溶性特点，通过离心技术和低浓度变性剂0.7mol/L尿素，0.01%Triton-100反复洗涤，抽提大部分可溶性杂质，使包涵体纯度达到90%，其中比较了含1mg/ml脱氧胆酸钠(DOC)的TE溶液洗涤包涵体，效果不如0.7mol/L尿素，DOC的TE溶液可部分溶解包涵体，导致较多的hIL-3蛋白丢失。而包涵体的变性溶解及复性才是获得有效纯化的关键。包涵体变性溶解后，需要在适当条件下才能使重组蛋白正确折迭恢复活性，同时去除了一些不溶性沉淀的杂蛋白质，复性效率与蛋白质终浓度高低及复性速度有关。蛋白质浓度过高或复性过快都会造成复性不完全而形成较多沉淀。从我们的实验中发现复性时蛋白浓度应控制在100μg/ml以下，hIL-3突变体蛋白稀释到一定浓度才能避免分子间相互作用，相互缠绕。复性过程中尿素浓度保持在0.5～1mol/L之间，使其既能维持hIL-3突变体蛋白溶解性，又不干扰蛋白的折迭复性。直至将盐酸胍完全复性后溶液经10000r/min离心，去除不溶性沉淀，上清再经离子交换层析和凝胶过滤层析，得到hIL-3突变体蛋白纯品。用TF-1细胞检测其活性，达到7.3×104U/ml。此纯化结果表明我们在E.coli中变效表达了具有活性的hIL-3突变体，并初步解决了在大肠杆菌中表达hIL-3突变体的复性及纯化问题，得到了高纯度，高活性的hIL-3突变体，从而为hIL-3突变体的大规模生产，临床应用提供了条件，也为IL-3蛋白质的结构的研究提供了基础。
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作者简介：王燕(1961.12)，女，江苏省常州市人，博士，讲师，主要从事蛋白质工程方面的研究，发表论文3篇。电话：(023)68752257
参考文献
[1]Merlin S，Rowold E，Abegg A，et al.Phage presentation and affinity selection of a deletion mutant of human interleukin-3[J].Appl iochem Biotechnol,1997,67(3):199-201.
[2]Phillips J A，Lopez A F，Milton S E，et al.Synthesis and expression of the gene encoding human interleukin-3[J].Gene,1989,84(2)：501-503.
[3]王燕，朱锡华 ，万瑛 ，等.人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究[J].中国免疫学杂志，1999,(1):12-14.
[4]Kane J F,Harthey D L.Formation of recombinant Protein inclusion bodies in Escherichia coli[J].Trends in Biotechology，1988，6(1):95-96.
收稿日期：1999-04-15
修回日期：1999-10-15, 百拇医药