不同类型格林-巴利综合征患者单个核细胞免疫学致病特征的实验研究
作者：吴梅 蔡方成
单位：400014 重庆医科大学儿科学院(第一作者现在643000 四川省自贡市第一人民医院儿科)
关键词：IGG；多神经根神经炎；白细胞；单核
中华儿科杂志/980802 【摘要】 目的 探讨急性炎性脱髓鞘多发性神经病(AIDP)与急性运动轴索神经病(AMAN)等不同类型格林-巴利综合征(GBS)患者单个核细胞(PBMC)在发病中的作用。方法 取11例AIDP和14例AMAN患者PBMC体外培养上清液，分别于132条大鼠坐骨神经外膜下和25只鼠静脉内注射。结果 坐骨神经外膜下及静脉注射AMAN患者PBMC上清液后，原纤维轴索变性总发生率23.4%，偶见髓鞘脱失(0.2%)；注射AIDP患者PBMC上清液后，除发生轴索变性(22.8%)外，尚有较多髓鞘脱失(5.2%)。加入血清提供补体后使原纤维病变率增高两倍以上。静脉注射鼠虽有明显周围神经病，但其他脏器无病变。上清液中白细胞介素(IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α和IgG含量显著增高。PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液恒定地引起脱髓鞘纤维增多，而LPS诱导的AMAN患者PBMC上清液致轴索变性纤维数增加，此上清液中肿瘤坏死因子-α含量增高。结论 不同类型GBS患者外周血PBMC在发病中起重要作用，引起相似而又有差异的周围神经病变，并具有组织特异性。与其相关的细胞免疫和补体介入的体液免疫均参与其致病过程。
, 百拇医药
Experimental neuropathies induced by the PBMCs of Guillain-Barré syndrome in different clinical patterns
Wu Mei, Cai Fangcheng. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract 】 【Abstract 】 Objective To explore the pathogenetic role of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) taken from Guillain-Barré syndrome (GBS) patients with acute inflammatory demyelinating polyneuropathy (AIDP) and acute motor axonal neuropathy (AMAN). Methods Supernatants of PBMCs from 11 AIDP and 14 AMAN patients were injected perineurally at 132 lateral sciatic nerves of Wistar rats and intravenously in 25 rats. Results Axonal degeneration was the main pathological pattern along the rat nerve in AMAN supernatant group (23.4%) with a few demyelinating fibers (0.2%). In contrast, 5.2% fibers were undergoing demyelination in AIDP group even though there were also significant axonal degeneration (22.8%). The incidence of axon degenerating and demyelinating fibers were enhanced more than two times after the perineural injection with PBMC supernatants added with complement than that without complement. No abnormality could be detected on the sections of liver, kidney and brain tissues in 8 rats with experimental neuropathy induced already by intravenous PBMC supernatant. There were striking high level of IL-2, IL-6, TNF-α and IgG in the supernatant of PBMCs from both groups. Significant increase of demyelinating fibers was consistently caused by PBMC supernatant of AIDP after stimulation with phyto-hemagglutinin. Remarkable increase of degenerating fibers was also caused by PBMC supernatant of AMAN with highest level of TNF-α after stimulation with lipoplysaccharide. Conclusion The immunocompetent cells in peripheral blood of AIDP and AMAN patients may play a leading role in the pathogenesis of the neuropathy. Their immune specificity to nerve tissue was well shown. The cellular and humoral immunopathogenetic processes associated with the proliferation of PBMC of AIDP/AMAN patients were both involved in development of the experimental neuropathies.
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【Key words 】 【Key words 】 IgG Polyradiculoneuritis Leukocytes, mononuclear
格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)的典型病理改变为神经纤维髓鞘脱失，又称急性炎性脱髓鞘多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP)。近年的研究结果表明，我国部分GBS患儿主要表现为轴索变性，为急性运动轴索神经病(acute motor axonal neuropathy, AMAN)[1，2]。它们的发病机理尚不明确。我们采用AIDP和AMAN患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononeuclear cell, PBMC)体外增殖后上清液诱导大鼠实验性周围神经病，探索两种类型患者免疫活性细胞在发病中的作用。
对象及方法
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一、研究对象
25例GBS患者中儿童16例，成人9例。均符合美国Asbury等[3]关于GBS临床诊断标准。根据Asbury等和Ho等[3，4]的电生理测试分类标准以及作者实验室所测小儿和成人神经传导正常值[5]，将上述患者分为AIDP和AMAN组。所有患者均完成尺神经、正中神经、胫神经和腓总神经运动神经传导电测定，15例完成腓肠神经感觉神经传导电测定。
1.AIDP组：11例，其中3～15岁4例。肌力0～Ⅲ级5例(46%)，颅神经受累者4例(36%)，呼吸肌麻痹2例(18%)。运动神经电测定除1例为2条神经异常外，分别有3条或4条神经异常的各有5例。在神经传导速度、远端潜伏期和F波潜伏期延长及传导阻滞4项异常指标中，具有1项异常者4例，2项和3项异常者分别为4例和3例。本组有6例同时进行腓肠神经感觉神经电测定，其中5例有上述异常。
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2.AMAN组：14例，其中2～15岁12例。肌力0～Ⅲ级10例(71%)，颅神经受累者12例(86%)，呼吸肌麻痹9例(64%)。电测定显示14例均有2条以上运动神经波幅降低，其中有3条或4条神经受累者分别为6例和4例。9例同时进行腓肠神经感觉神经电测定，其中6例异常。14例均无上述脱髓鞘性电生理表现。
3.正常对照组：健康儿童12例，成人4例。
二、方法
取全部病例病后2～11天静脉血，采血前两周内未用过激素和血液制品。取血后即刻分离PBMC。
1.PBMC培养、上清液制备及其免疫成分检测：常规分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×106/ml，分为三管，分别加入不同丝裂原：植物血凝素(PHA，广州医药研究所)、细菌脂多糖(LPS，Sigma)和美洲商陆(PWM，Sigma)进行诱导。终浓度分别为100、5和3 μg/ml。37℃、5%CO2孵育48小时(PWM管10天)，收集上清液，即刻注入大鼠坐骨神经外膜下或静脉内，并取1 ml -70℃保存，以ELISA双夹心法检测上清液中白细胞介素(IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IgG。检测盒分别购自晶美生物工程公司、第四军医大学免疫学教研室和军事医学科学院。
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2.PBMC上清液神经外膜下(简称外膜下)注射：Wistar大鼠，雌雄不限，体重258～351 g，按注射物中丝裂原的不同随机分为PHA、LPS、PWM和PWM加血清四组。1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后暴露大鼠坐骨神经，解剖镜下将40 μl内容物缓慢注入外膜下。前3组每鼠均注射单一患者的上清液40 μl，第4组取单一患者PWM诱导的PBMC上清液30 μl与血清10 μl混合后注入。AIDP和AMAN两实验组共注射132条神经，正常对照组注射44条神经。
3.PBMC上清液静脉注射：大鼠37只(两实验组25只，对照组12只)，体重260～355 g，随机分为PHA、LPS和PWM组，麻醉后按10 ml/kg尾静脉注入相应上清液。
4.实验鼠周围神经组织学观察：注射后第7天处死大鼠，以4%多聚甲醛和2.5%戊二醛左心室灌注作全身组织固定。切取坐骨神经1.5 cm，等分三段分别进行：(1)1%锇酸染色，解剖镜下随机分离20根原纤维，光学显微镜(光镜)下观察；(2)环氧树脂包埋，0.5 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜观察；(3)选择光镜下病变组织作超薄切片，铅、铀染色，H600透射电镜观察。双盲法判定所有切片。
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5.实验鼠脑、肝、肾组织学观察：静脉注射后7天，在切取神经同时取脑、肝和肾脏组织石蜡包埋，HE染色，光镜下双盲观察。
三、统计学方法
多个样本均数采用方差q检验，率的比较采用卡方检验。
结果
一、PBMC上清液细胞因子及IgG含量
经PHA、LPS和PWM诱导后，两组患者PBMC上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IgG含量均高于对照组(q=3.00～7.50，P<0.05或0.01)。除AMAN组上清液中TNF-α(142±53 ng/L)高于AIDP组(93±27 ng/L)(q=3.38，P<0.05)外，两组间其他细胞因子及IgG含量差异无显著意义。
二、原纤维分离光镜观察结果
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1.外膜下注射组：由表1可见，外膜下注射后，三组原纤维轴索变性(图1，2)发生率差异有非常显著意义，χ2=307.40，P<0.001，两实验组均高于对照组。两实验组间原纤维轴索变性总发生率差异虽无显著意义(χ2=0.952，P>0.05)，但注射LPS诱导的PBMC上清液者，AMAN组轴索变性发生率高于AIDP组(χ2=20.552，P<0.001)；注射PWM诱导和PWM诱导加血清的PBMC上清液者，AIDP组轴索变性发生率则高于AMAN组，χ2分别为6.330(P<0.05)和26.116(P<0.001)。
表1 不同诱导种类的PBMC上清液神经外膜下注射后异常原纤维发生数及发生率 上清液种类
观察纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
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脱髓鞘纤维数(率%)
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
PHA
440
480
, http://www.100md.com
280
146 (33.2)
134 (27.9)
2 (0.7)
0
22 ( 4.6)
0
LPS
440
480
280
135 (30.7)
86 (17.9)
, http://www.100md.com
4 (1.4)
2 (0.5)
34 ( 7.1)
0
PWM
240
160
160
24 (10.0)
30 (18.8)
0
0
0
, 百拇医药
0
PWM+血清
240
160
160
98 (40.8)
107 (66.9)
0
0
20 (12.5)
0
合计
1 360
, http://www.100md.com
1 280
880
403 (29.6)
357 (27.9)
6 (0.7)
2 (0.1)
76 ( 5.9)
0
表2 不同诱导种类的PBMC上清液静脉注射后异常原纤维发生数及发生率 上清液种类
观察纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
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脱髓鞘纤维数(率%)
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
PHA
200
240
, http://www.100md.com
200
9 (4.5)
14 ( 5.8)
1 (0.5)
0
20 (8.3)
0
LPS
160
200
200
7 (4.4)
24 (12.0)
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1 (0.5)
2 (1.3)
0
0
PWM
80
120
80
1 (1.3)
24 (20.0)
0
0
0
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0
合计
440
560
480
17 (3.9)
62 (11.1)
2 (0.4)
2 (0.5)
20 (3.6)
0
对照组无髓鞘脱失发生，AMAN组也仅极个别发生(0.1%)，AIDP组则为5.9%(图3)，高于对照组及AMAN组(χ2=77.103，P<0.001)。
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2.静脉注射组：由表2可见，静脉注射患者的PBMC上清液后，三组原纤维轴索变性总发生率差异有非常显著意义，χ2=59.831，P<0.001，AIDP组高于AMAN组(χ2=17.60，P<0.001)，AMAN组又高于对照组(χ2=13.49，P<0.001)。与外膜下注射相同的是，注射PHA诱导的PBMC上清液后两实验组轴索变性发生率无明显差别，注射PWM诱导的PBMC上清液后，AIDP组轴索变性发生率高于AMAN组(χ2=15.429，P<0.001)；不同的是，注射LPS诱导的PBMC上清液后，AIDP组轴索变性发生率高于AMAN组(χ2=6.567，P<0.05)。
对照组无髓鞘脱失发生，AMAN组亦只极个别纤维发生，与AIDP组比较，差异有非常显著意义(χ2=11.137，P<0.001)。
三、半薄切片光镜观察结果
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患者PBMC上清液外膜下和静脉注射后，两实验组各有一半以上神经在光镜下可见显著改变，表现为程度不等的轴索变性、散在或大片状区域性原纤维缺失，约1/3切片伴有巨噬细胞和(或)淋巴细胞浸润(图4，5)，偶见浆细胞。AIDP组更易见薄髓鞘原纤维(图6)。两种注射方法的对照组均无明显病变。
四、超薄切片电镜观察结果
电镜下可见轴索变性的原纤维轴浆内膜性细胞器退变，轴浆溶解，髓鞘塌陷，巨噬细胞(图7，8)和淋巴细胞浸润，并有典型丛集状轴索再生(cluster)(图9)。髓鞘脱失区域内可见原纤维髓鞘分层，或髓内空泡形成。
五、实验鼠脑、肝、肾组织学观察结果
静脉注射后周围神经已有典型病变的8只实验鼠的脑、肝和肾脏光镜下均未发现异常。讨论
近年来有关GBS的免疫学研究已取得较多进展，但其确切病因和发病机理仍不清楚。文献中有用髓鞘蛋白致敏的淋巴细胞注入大鼠坐骨神经诱发实验性变态反应性神经炎的报告[6]。本组则以两种GBS患者PBMC上清液分别作神经外膜下和静脉注射，皆成功地使实验大鼠获得了与AMAN和AIDP组织病理学改变相似的实验性周围神经病。采用外膜下注射可避免因神经内注射造成的人为损伤，能更好地证实免疫活性细胞在本组实验性周围神经病发病中的致病作用。静脉注射后已发生典型周围神经病变之大鼠的脑、肝和肾脏作光镜检查，均未发现明显异常，说明GBS患者PBMC上清液中免疫活性成分对周围神经损伤有明显的组织特异性。
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已有报告GBS急性期常有血清IL-2、IL-6和TNF-α增高[7]。本组进一步证实GBS患者的PBMC体外增殖上清液中，上述细胞因子及IgG含量也显著高于正常对照，表明两类GBS患者都存在着T、B细胞免疫活性增强。各种丝裂原诱导的AIDP患者的PBMC上清液均引起更高比例原纤维病变，提示其PBMC有更强的免疫致病力的可能性。
AMAN与AIDP虽然有相似的临床表现，但组织学和神经电生理检查结果却有较大差别，其原因尚不清楚。本研究中AIDP各实验组均有明显增多的原纤维髓鞘脱失发生，说明AIDP患者的PBMC更易导致髓鞘脱失病理过程。这在PHA诱导的上清液更为突出，无论外膜下或静脉注射，均引起显著增多的脱髓鞘性损害，提示细胞免疫在AIDP患者的髓鞘脱失中所起的重要作用。
实验结果还显示，两组患者的PBMC上清液均诱发较多原纤维轴索变性，表明AIDP和AMAN患者的PBMC均有损伤轴索的能力。然而，AMAN患者的PBMC上清液很少引起髓鞘脱失性改变，在由LPS诱导的PBMC上清液外膜下注射中，轴索变性发生率显著增高，测定该上清液中TNF-α含量较AIDP组明显增多，提示TNF-α在周围神经轴索变性中具有重要作用。Redford等[8]用TNF-α行神经局部注射，同样发现神经内TNF-α局部浓度增多是导致实验动物周围神经轴索变性的决定因素。
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两组患者PBMC上清液中IgG含量均高出正常对照1倍，加入新鲜血清以供给补体后，轴索变性纤维数较未加血清者增加两倍以上，AIDP实验组还伴有显著增多的髓鞘脱失纤维，充分说明在本组实验性神经病的发病机理中，同样存在有补体参与的体液免疫损伤过程。
本实验结果直接显示了不同类型GBS患者外周血免疫活性细胞对周围神经存在致病力的差异。为阐明导致AIDP和AMAN组织学差异的确切原因，还需进一步通过病变神经超微结构去证实相关免疫学成分的特殊定位。
图1 Wistar大鼠正常神经原纤维 原纤维均匀光滑，郎飞结清晰可见 图2 用LPS诱导的AMAN患者PBMC上清液经神经外膜下注射后大鼠坐骨神经原纤维 典型轴索变性。髓鞘因失去轴索支撑，塌陷成团，似串珠或腊肠样 图3 用PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液经静脉注射后大鼠坐骨神经原纤维 典型节段性脱髓鞘改变，轴索完整(图1～3锇酸染色，光镜，×100)
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图4 图2病变神经的半薄切片图 神经束膜内区域性原纤维丧失，间质水肿，大量轴索变性(
)伴巨噬细胞(
)和淋巴细胞(△)浸润(甲苯胺蓝染色，光镜，×400) 图5 经LPS诱导的AIDP患者PBMC上清液外膜下注射后大鼠坐骨神经半薄切片图 AIDP患者上清液也引起典型轴索变性()，同时可见显著纤维丧失，间质水肿，大量巨噬细胞()和散在淋巴细胞(△)浸润(甲苯胺蓝染色，光镜，×400) 图6 图3病变神经半薄切片图 广泛神经纤维丧失，伴大量薄髓鞘神经纤维()形成(甲苯胺蓝染色，光镜，×400)
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图7 经PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液静脉注射后大鼠坐骨神经超薄切片图 图中有3个巨噬细胞，其中两个()胞浆中有被吞噬的变性轴索(铅、铀染色，电镜，×4 000) 图8 图2病变神经的超薄切片图 巨噬细胞胞浆中被吞噬的两条原纤维，其一轴索已近消失，残留髓鞘碎片()，另一为脱髓鞘纤维，仅见相对完好的轴素()(铅、铀染色，电镜，×10 000) 图9 图2病变神经的超薄切片图 轴索变性后出现的典型丛集状再生(cluster)()(铅、铀染色，电镜，× 15 000)
参考文献
, 百拇医药
1 Mckhann GM, Cornblath DR, Griffin JW, et al. Acute motor axonal neuropathy: a frequent cause of acute flaccid paralysis in China. Ann Neurol, 1993, 33:333-342.
2 李春岩，高长玉，薛平，等.急性运动性轴索性格林-巴利综合征.中华神经精神科杂志，1993，26：282-284.
3 Asbury AK, Cornblath DR. Assessment of current diagnostic criteria for Guillain-Barré syndrome. Ann Neurol, 1990, 27(Suppl):S21-24.
4 Ho TW, Mishu B, Li CY, et al. Guillain-Barré syndrome in northern China relationship to campylobacter jejuni infection and antiglycolipid antibodies. Brain, 1995, 118:597-605.
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5 Cai FC, Zhang JM. Study of nerve conduction and late responses in normal Chinese infants, children and adults. J Child Neurol, 1997, 12:13-18.
6 Hodgkinson SJ, Westland KW, Pollard JD. Transfer of experimented allergic neuritis by intraneural injection of sensitived lymphocytes. J Neurol Sci, 1994, 132:162-172.
7 管阳太.格林-巴利综合征免疫学研究进展[综述].国外医学神经病学神经外科学分册，1996，23：317-320.
8 Redford EJ, Hall SM, Smith KJ. Vascular changes and demyelination induced by the intraneural injection of tumor necrosis factor. Brain, 1995, 118:869-878., http://www.100md.com
单位：400014 重庆医科大学儿科学院(第一作者现在643000 四川省自贡市第一人民医院儿科)
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中华儿科杂志/980802 【摘要】 目的 探讨急性炎性脱髓鞘多发性神经病(AIDP)与急性运动轴索神经病(AMAN)等不同类型格林-巴利综合征(GBS)患者单个核细胞(PBMC)在发病中的作用。方法 取11例AIDP和14例AMAN患者PBMC体外培养上清液，分别于132条大鼠坐骨神经外膜下和25只鼠静脉内注射。结果 坐骨神经外膜下及静脉注射AMAN患者PBMC上清液后，原纤维轴索变性总发生率23.4%，偶见髓鞘脱失(0.2%)；注射AIDP患者PBMC上清液后，除发生轴索变性(22.8%)外，尚有较多髓鞘脱失(5.2%)。加入血清提供补体后使原纤维病变率增高两倍以上。静脉注射鼠虽有明显周围神经病，但其他脏器无病变。上清液中白细胞介素(IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α和IgG含量显著增高。PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液恒定地引起脱髓鞘纤维增多，而LPS诱导的AMAN患者PBMC上清液致轴索变性纤维数增加，此上清液中肿瘤坏死因子-α含量增高。结论 不同类型GBS患者外周血PBMC在发病中起重要作用，引起相似而又有差异的周围神经病变，并具有组织特异性。与其相关的细胞免疫和补体介入的体液免疫均参与其致病过程。
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Experimental neuropathies induced by the PBMCs of Guillain-Barré syndrome in different clinical patterns
Wu Mei, Cai Fangcheng. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract 】 【Abstract 】 Objective To explore the pathogenetic role of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) taken from Guillain-Barré syndrome (GBS) patients with acute inflammatory demyelinating polyneuropathy (AIDP) and acute motor axonal neuropathy (AMAN). Methods Supernatants of PBMCs from 11 AIDP and 14 AMAN patients were injected perineurally at 132 lateral sciatic nerves of Wistar rats and intravenously in 25 rats. Results Axonal degeneration was the main pathological pattern along the rat nerve in AMAN supernatant group (23.4%) with a few demyelinating fibers (0.2%). In contrast, 5.2% fibers were undergoing demyelination in AIDP group even though there were also significant axonal degeneration (22.8%). The incidence of axon degenerating and demyelinating fibers were enhanced more than two times after the perineural injection with PBMC supernatants added with complement than that without complement. No abnormality could be detected on the sections of liver, kidney and brain tissues in 8 rats with experimental neuropathy induced already by intravenous PBMC supernatant. There were striking high level of IL-2, IL-6, TNF-α and IgG in the supernatant of PBMCs from both groups. Significant increase of demyelinating fibers was consistently caused by PBMC supernatant of AIDP after stimulation with phyto-hemagglutinin. Remarkable increase of degenerating fibers was also caused by PBMC supernatant of AMAN with highest level of TNF-α after stimulation with lipoplysaccharide. Conclusion The immunocompetent cells in peripheral blood of AIDP and AMAN patients may play a leading role in the pathogenesis of the neuropathy. Their immune specificity to nerve tissue was well shown. The cellular and humoral immunopathogenetic processes associated with the proliferation of PBMC of AIDP/AMAN patients were both involved in development of the experimental neuropathies.
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【Key words 】 【Key words 】 IgG Polyradiculoneuritis Leukocytes, mononuclear
格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)的典型病理改变为神经纤维髓鞘脱失，又称急性炎性脱髓鞘多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy, AIDP)。近年的研究结果表明，我国部分GBS患儿主要表现为轴索变性，为急性运动轴索神经病(acute motor axonal neuropathy, AMAN)[1，2]。它们的发病机理尚不明确。我们采用AIDP和AMAN患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononeuclear cell, PBMC)体外增殖后上清液诱导大鼠实验性周围神经病，探索两种类型患者免疫活性细胞在发病中的作用。
对象及方法
, 百拇医药
一、研究对象
25例GBS患者中儿童16例，成人9例。均符合美国Asbury等[3]关于GBS临床诊断标准。根据Asbury等和Ho等[3，4]的电生理测试分类标准以及作者实验室所测小儿和成人神经传导正常值[5]，将上述患者分为AIDP和AMAN组。所有患者均完成尺神经、正中神经、胫神经和腓总神经运动神经传导电测定，15例完成腓肠神经感觉神经传导电测定。
1.AIDP组：11例，其中3～15岁4例。肌力0～Ⅲ级5例(46%)，颅神经受累者4例(36%)，呼吸肌麻痹2例(18%)。运动神经电测定除1例为2条神经异常外，分别有3条或4条神经异常的各有5例。在神经传导速度、远端潜伏期和F波潜伏期延长及传导阻滞4项异常指标中，具有1项异常者4例，2项和3项异常者分别为4例和3例。本组有6例同时进行腓肠神经感觉神经电测定，其中5例有上述异常。
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2.AMAN组：14例，其中2～15岁12例。肌力0～Ⅲ级10例(71%)，颅神经受累者12例(86%)，呼吸肌麻痹9例(64%)。电测定显示14例均有2条以上运动神经波幅降低，其中有3条或4条神经受累者分别为6例和4例。9例同时进行腓肠神经感觉神经电测定，其中6例异常。14例均无上述脱髓鞘性电生理表现。
3.正常对照组：健康儿童12例，成人4例。
二、方法
取全部病例病后2～11天静脉血，采血前两周内未用过激素和血液制品。取血后即刻分离PBMC。
1.PBMC培养、上清液制备及其免疫成分检测：常规分离PBMC，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×106/ml，分为三管，分别加入不同丝裂原：植物血凝素(PHA，广州医药研究所)、细菌脂多糖(LPS，Sigma)和美洲商陆(PWM，Sigma)进行诱导。终浓度分别为100、5和3 μg/ml。37℃、5%CO2孵育48小时(PWM管10天)，收集上清液，即刻注入大鼠坐骨神经外膜下或静脉内，并取1 ml -70℃保存，以ELISA双夹心法检测上清液中白细胞介素(IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IgG。检测盒分别购自晶美生物工程公司、第四军医大学免疫学教研室和军事医学科学院。
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2.PBMC上清液神经外膜下(简称外膜下)注射：Wistar大鼠，雌雄不限，体重258～351 g，按注射物中丝裂原的不同随机分为PHA、LPS、PWM和PWM加血清四组。1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后暴露大鼠坐骨神经，解剖镜下将40 μl内容物缓慢注入外膜下。前3组每鼠均注射单一患者的上清液40 μl，第4组取单一患者PWM诱导的PBMC上清液30 μl与血清10 μl混合后注入。AIDP和AMAN两实验组共注射132条神经，正常对照组注射44条神经。
3.PBMC上清液静脉注射：大鼠37只(两实验组25只，对照组12只)，体重260～355 g，随机分为PHA、LPS和PWM组，麻醉后按10 ml/kg尾静脉注入相应上清液。
4.实验鼠周围神经组织学观察：注射后第7天处死大鼠，以4%多聚甲醛和2.5%戊二醛左心室灌注作全身组织固定。切取坐骨神经1.5 cm，等分三段分别进行：(1)1%锇酸染色，解剖镜下随机分离20根原纤维，光学显微镜(光镜)下观察；(2)环氧树脂包埋，0.5 μm半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜观察；(3)选择光镜下病变组织作超薄切片，铅、铀染色，H600透射电镜观察。双盲法判定所有切片。
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5.实验鼠脑、肝、肾组织学观察：静脉注射后7天，在切取神经同时取脑、肝和肾脏组织石蜡包埋，HE染色，光镜下双盲观察。
三、统计学方法
多个样本均数采用方差q检验，率的比较采用卡方检验。
结果
一、PBMC上清液细胞因子及IgG含量
经PHA、LPS和PWM诱导后，两组患者PBMC上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IgG含量均高于对照组(q=3.00～7.50，P<0.05或0.01)。除AMAN组上清液中TNF-α(142±53 ng/L)高于AIDP组(93±27 ng/L)(q=3.38，P<0.05)外，两组间其他细胞因子及IgG含量差异无显著意义。
二、原纤维分离光镜观察结果
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1.外膜下注射组：由表1可见，外膜下注射后，三组原纤维轴索变性(图1，2)发生率差异有非常显著意义，χ2=307.40，P<0.001，两实验组均高于对照组。两实验组间原纤维轴索变性总发生率差异虽无显著意义(χ2=0.952，P>0.05)，但注射LPS诱导的PBMC上清液者，AMAN组轴索变性发生率高于AIDP组(χ2=20.552，P<0.001)；注射PWM诱导和PWM诱导加血清的PBMC上清液者，AIDP组轴索变性发生率则高于AMAN组，χ2分别为6.330(P<0.05)和26.116(P<0.001)。
表1 不同诱导种类的PBMC上清液神经外膜下注射后异常原纤维发生数及发生率 上清液种类
观察纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
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脱髓鞘纤维数(率%)
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
PHA
440
480
, http://www.100md.com
280
146 (33.2)
134 (27.9)
2 (0.7)
0
22 ( 4.6)
0
LPS
440
480
280
135 (30.7)
86 (17.9)
, http://www.100md.com
4 (1.4)
2 (0.5)
34 ( 7.1)
0
PWM
240
160
160
24 (10.0)
30 (18.8)
0
0
0
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0
PWM+血清
240
160
160
98 (40.8)
107 (66.9)
0
0
20 (12.5)
0
合计
1 360
, http://www.100md.com
1 280
880
403 (29.6)
357 (27.9)
6 (0.7)
2 (0.1)
76 ( 5.9)
0
表2 不同诱导种类的PBMC上清液静脉注射后异常原纤维发生数及发生率 上清液种类
观察纤维数(条)
轴索变性纤维数(率%)
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脱髓鞘纤维数(率%)
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
AMAN组
AIDP组
对照组
PHA
200
240
, http://www.100md.com
200
9 (4.5)
14 ( 5.8)
1 (0.5)
0
20 (8.3)
0
LPS
160
200
200
7 (4.4)
24 (12.0)
, http://www.100md.com
1 (0.5)
2 (1.3)
0
0
PWM
80
120
80
1 (1.3)
24 (20.0)
0
0
0
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0
合计
440
560
480
17 (3.9)
62 (11.1)
2 (0.4)
2 (0.5)
20 (3.6)
0
对照组无髓鞘脱失发生，AMAN组也仅极个别发生(0.1%)，AIDP组则为5.9%(图3)，高于对照组及AMAN组(χ2=77.103，P<0.001)。
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2.静脉注射组：由表2可见，静脉注射患者的PBMC上清液后，三组原纤维轴索变性总发生率差异有非常显著意义，χ2=59.831，P<0.001，AIDP组高于AMAN组(χ2=17.60，P<0.001)，AMAN组又高于对照组(χ2=13.49，P<0.001)。与外膜下注射相同的是，注射PHA诱导的PBMC上清液后两实验组轴索变性发生率无明显差别，注射PWM诱导的PBMC上清液后，AIDP组轴索变性发生率高于AMAN组(χ2=15.429，P<0.001)；不同的是，注射LPS诱导的PBMC上清液后，AIDP组轴索变性发生率高于AMAN组(χ2=6.567，P<0.05)。
对照组无髓鞘脱失发生，AMAN组亦只极个别纤维发生，与AIDP组比较，差异有非常显著意义(χ2=11.137，P<0.001)。
三、半薄切片光镜观察结果
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患者PBMC上清液外膜下和静脉注射后，两实验组各有一半以上神经在光镜下可见显著改变，表现为程度不等的轴索变性、散在或大片状区域性原纤维缺失，约1/3切片伴有巨噬细胞和(或)淋巴细胞浸润(图4，5)，偶见浆细胞。AIDP组更易见薄髓鞘原纤维(图6)。两种注射方法的对照组均无明显病变。
四、超薄切片电镜观察结果
电镜下可见轴索变性的原纤维轴浆内膜性细胞器退变，轴浆溶解，髓鞘塌陷，巨噬细胞(图7，8)和淋巴细胞浸润，并有典型丛集状轴索再生(cluster)(图9)。髓鞘脱失区域内可见原纤维髓鞘分层，或髓内空泡形成。
五、实验鼠脑、肝、肾组织学观察结果
静脉注射后周围神经已有典型病变的8只实验鼠的脑、肝和肾脏光镜下均未发现异常。讨论
近年来有关GBS的免疫学研究已取得较多进展，但其确切病因和发病机理仍不清楚。文献中有用髓鞘蛋白致敏的淋巴细胞注入大鼠坐骨神经诱发实验性变态反应性神经炎的报告[6]。本组则以两种GBS患者PBMC上清液分别作神经外膜下和静脉注射，皆成功地使实验大鼠获得了与AMAN和AIDP组织病理学改变相似的实验性周围神经病。采用外膜下注射可避免因神经内注射造成的人为损伤，能更好地证实免疫活性细胞在本组实验性周围神经病发病中的致病作用。静脉注射后已发生典型周围神经病变之大鼠的脑、肝和肾脏作光镜检查，均未发现明显异常，说明GBS患者PBMC上清液中免疫活性成分对周围神经损伤有明显的组织特异性。
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已有报告GBS急性期常有血清IL-2、IL-6和TNF-α增高[7]。本组进一步证实GBS患者的PBMC体外增殖上清液中，上述细胞因子及IgG含量也显著高于正常对照，表明两类GBS患者都存在着T、B细胞免疫活性增强。各种丝裂原诱导的AIDP患者的PBMC上清液均引起更高比例原纤维病变，提示其PBMC有更强的免疫致病力的可能性。
AMAN与AIDP虽然有相似的临床表现，但组织学和神经电生理检查结果却有较大差别，其原因尚不清楚。本研究中AIDP各实验组均有明显增多的原纤维髓鞘脱失发生，说明AIDP患者的PBMC更易导致髓鞘脱失病理过程。这在PHA诱导的上清液更为突出，无论外膜下或静脉注射，均引起显著增多的脱髓鞘性损害，提示细胞免疫在AIDP患者的髓鞘脱失中所起的重要作用。
实验结果还显示，两组患者的PBMC上清液均诱发较多原纤维轴索变性，表明AIDP和AMAN患者的PBMC均有损伤轴索的能力。然而，AMAN患者的PBMC上清液很少引起髓鞘脱失性改变，在由LPS诱导的PBMC上清液外膜下注射中，轴索变性发生率显著增高，测定该上清液中TNF-α含量较AIDP组明显增多，提示TNF-α在周围神经轴索变性中具有重要作用。Redford等[8]用TNF-α行神经局部注射，同样发现神经内TNF-α局部浓度增多是导致实验动物周围神经轴索变性的决定因素。
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两组患者PBMC上清液中IgG含量均高出正常对照1倍，加入新鲜血清以供给补体后，轴索变性纤维数较未加血清者增加两倍以上，AIDP实验组还伴有显著增多的髓鞘脱失纤维，充分说明在本组实验性神经病的发病机理中，同样存在有补体参与的体液免疫损伤过程。
本实验结果直接显示了不同类型GBS患者外周血免疫活性细胞对周围神经存在致病力的差异。为阐明导致AIDP和AMAN组织学差异的确切原因，还需进一步通过病变神经超微结构去证实相关免疫学成分的特殊定位。
图1 Wistar大鼠正常神经原纤维 原纤维均匀光滑，郎飞结清晰可见 图2 用LPS诱导的AMAN患者PBMC上清液经神经外膜下注射后大鼠坐骨神经原纤维 典型轴索变性。髓鞘因失去轴索支撑，塌陷成团，似串珠或腊肠样 图3 用PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液经静脉注射后大鼠坐骨神经原纤维 典型节段性脱髓鞘改变，轴索完整(图1～3锇酸染色，光镜，×100)
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图4 图2病变神经的半薄切片图 神经束膜内区域性原纤维丧失，间质水肿，大量轴索变性(
)伴巨噬细胞()和淋巴细胞(△)浸润(甲苯胺蓝染色，光镜，×400) 图5 经LPS诱导的AIDP患者PBMC上清液外膜下注射后大鼠坐骨神经半薄切片图 AIDP患者上清液也引起典型轴索变性()，同时可见显著纤维丧失，间质水肿，大量巨噬细胞()和散在淋巴细胞(△)浸润(甲苯胺蓝染色，光镜，×400) 图6 图3病变神经半薄切片图 广泛神经纤维丧失，伴大量薄髓鞘神经纤维()形成(甲苯胺蓝染色，光镜，×400), 百拇医药
图7 经PHA诱导的AIDP患者PBMC上清液静脉注射后大鼠坐骨神经超薄切片图 图中有3个巨噬细胞，其中两个(
)胞浆中有被吞噬的变性轴索(铅、铀染色，电镜，×4 000) 图8 图2病变神经的超薄切片图 巨噬细胞胞浆中被吞噬的两条原纤维，其一轴索已近消失，残留髓鞘碎片()，另一为脱髓鞘纤维，仅见相对完好的轴素()(铅、铀染色，电镜，×10 000) 图9 图2病变神经的超薄切片图 轴索变性后出现的典型丛集状再生(cluster)()(铅、铀染色，电镜，× 15 000)参考文献
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2 李春岩，高长玉，薛平，等.急性运动性轴索性格林-巴利综合征.中华神经精神科杂志，1993，26：282-284.
3 Asbury AK, Cornblath DR. Assessment of current diagnostic criteria for Guillain-Barré syndrome. Ann Neurol, 1990, 27(Suppl):S21-24.
4 Ho TW, Mishu B, Li CY, et al. Guillain-Barré syndrome in northern China relationship to campylobacter jejuni infection and antiglycolipid antibodies. Brain, 1995, 118:597-605.
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7 管阳太.格林-巴利综合征免疫学研究进展[综述].国外医学神经病学神经外科学分册，1996，23：317-320.
8 Redford EJ, Hall SM, Smith KJ. Vascular changes and demyelination induced by the intraneural injection of tumor necrosis factor. Brain, 1995, 118:869-878., http://www.100md.com