脑缺血再灌注ICAM-1的表达与神经元损伤
作者：周华东 张莉莉 陈曼娥
单位：周华东(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)；张莉莉(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)；陈曼娥(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)
关键词：脑缺血再灌注；细胞间粘附分子-1；转录
第三军医大学学报000205
提要 目的：观察细胞间粘附分子ICAM-1mRNA及蛋白在大鼠脑缺血再灌注不同时程脑组织中的表达与脑组 织神经元的损伤。方法：45只雄性Wistar大鼠随机分为3组 ：正常组、假手术组、缺血2h再灌注2、4、10、24、48、96、168h组，分别进行原位杂交、免疫组织化学和组织 HE染色。结果：大脑中动脉缺血再灌注2h，局部脑组 织ICAM-1mRNA表达开始升高，再灌注10h达高峰，持续168 h；ICAM-1蛋白表达于再灌注2h开始升高，至48h达到高峰，持续168h以上。结论：脑缺血再灌注后ICAM-1表达 增高，介导了粒细胞与脑血管内皮细胞的粘附增强 ，和脑缺血再灌注损伤关系密切。
, 百拇医药
中图法分类号R619.9;R743.31 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0115-04
Expression of intercellular adhesion molecule-1 and neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion in rats
ZHOU Hua-dong, ZHANG Li-li, CHEN Man-e
(Department of Neurology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective: To investigate the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and neuronal damage in cerebral foci after cerebral ischemia/reperfusion in rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomized into the normal control, sham-operated and cerebral ischemia/reperfusion groups. In situ hybridization, histochemistry, immunohistochemistry and histological techniques were used to determine expression of ICAM-1 and its mRNA and neuronal damage in ischemic brain tissue at different time phases after middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2h in rats. Results: The expression of ICAM-1 and its mRNA started to increase at the 2nd h, peaked at the 12th and 48th h respectively after reperfusion. The high levels of expression of ICAM-1 and its mRNA maintained for 96 and 148 h respectively. Conclusion: The expression of ICAM-1 is increased after cerebral ischemia/reperfusion, which participates in the adhesion between neutrophils and capillary endothelial cells. This indicates that ICAM-1 is closely associated with the neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemia/reperfusion; intercellular adhesion molecule-1; transcription; rat
局部脑缺血后白细胞向缺血区浸润，引发组织炎症 反应，造成局部脑损害。白细胞向缺血区浸润的一 个主要原因是血管内皮细胞和白细胞表面粘附分子 表达增高，致使白细胞贴壁、滚动、游离出血管外 。在这一过程中，细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)起到了关键的作用。本文用大 鼠局灶性脑缺血再灌注模型，原位杂交的方法观察测 定ICAM-1转录水平的变化，免疫组织化学方法测定ICAM-1蛋白表达情况，同时行普通HE染色光镜观察神经元损 伤情况，以探讨ICAM-1在缺血性脑损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组
, 百拇医药
选用体重250～280g雄性Wistar大鼠45只，随机分组情况如 下：对照组(n=5);假手术组(n=5)；缺血2h再灌注2、 4、8、24、48、96、168h，每个时相点各5只大鼠。
1.2 缺血再灌注模型制作和标本制备
德国产尼龙鱼线，直径0.2mm，顶端烫成直径约0.25mm的 光滑圆球状，用肝素处理后晾干备用。
1%戊巴比妥钠按35mg/kg进行腹腔注射麻醉，分离右 侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA) ，结扎并切断ECA及其分支，由ECA残端插入已制备好的 栓线，沿ECA，CCA分叉部和ICA轻柔推进约2.0cm时到达ICA颅 内分叉部即MCA起始处，阻断流入MCA的血流。再灌注组 于缺血2h后拔除栓线。假手术组操作同上，但仅分离 右侧颈总动脉。各组手术时间均在30min内完成。术中 及缺血期间采用反馈式电热毯保持肛温(37±0.2)°C。
, 百拇医药
模型成功的标志是动物苏醒后出现手术同侧(右侧 的)Horner征和手术对侧(左侧)肢体瘫痪，表现为左 前肢不能伸出、行走时向左侧倾倒或按逆时针方向 转圈。入选动物在取材时发现有蛛网膜下腔出血的 ，则弃置不用。
动物按上述分组情况到规定时间腹腔注射戊巴比妥 钠麻醉，经左心室主动脉插管灌注生理盐水200ml，然 后用Zamboni固定液200ml灌注固定，取脑组织投入Zamboni固 定液，于4℃下继续固定20h，放入30%蔗糖溶液(用4% 多聚甲醛配制)过夜，取出标本置于恒冷切片机上 经下丘脑中央部行全脑连续冠状切片(厚20μm)。
1.3 原位杂交方法检测ICAM-1mRNA的表达
1.3.1 cDNA探针制 备鼠ICAM-1cDNA质粒由日本T.horiuchi博士惠赠，转化到大肠杆菌(JM109)中扩增，用酚氯仿进行 质粒提取和纯化，加入内切酶BamHI进行酶切，低熔点 琼脂糖凝胶法回收目的片段，随机引物法地高辛标 记(标记试剂盒购于Boehringermannheim公司)。
, http://www.100md.com
1.3.2 原位杂交操作步骤 切片经0.3%TritonX-100漂洗、蛋 白酶K消化、预杂交后，在探针浓度为5ng/μl的杂交液 中于43°C下孵育20h，1∶800的抗地高辛抗体在室温下反 应12h，经NBT/BCIP显色系统染色后得到结果。杂交前所 用器械均经过RNA酶处理。原位杂交阴性对照采用以下 3种方法：①杂交前将切片用20μg/mlRNA酶37°C下预处理 30min；②杂交液中未加探针；③未加抗地高辛抗体。 相邻切片作HE染色。
1.4 免疫组织化学方法检测ICAM-1的表达
上述冰冻切片经H2O2处理10min后，用非免疫血清封闭 15min。一抗为小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体(购于武汉 博士德公司)，工作浓度为1∶100，室温下过夜进行 抗原抗体反应。ABC试剂盒按说明书进行操作。PBS漂洗 后，DAB显色系统进行闭光显色，光镜观察。阴性对照 用PBS代替一抗进行孵育。
, 百拇医药
1.5 数据分析
在10×10光镜下，以阳性染色的单个内皮细胞或内皮 细胞簇为一个阳性血管标记，每例观察切片1张，于血管丰富区随机选取5个相互非重叠视野进行观察， 并做定量图象分析(MAS-图象分析系统，重庆大学)，测出每平方毫米组织切片的阳性微血管数，进行 统计学分析，数据以
±s表示，用t检验。光镜下观察 中性白细胞浸润及病理形态学变化。
2 结果
2.1 ICAM-1mRNA阳性反应的变化
缺血2h再灌注不同时间组大鼠，其缺血区均有不同 程度ICAM-1mRNA阳性反应的血管，与缺血侧相比有显著 性差异；缺血2h再灌注2h大鼠缺血侧ICAM-1mRNA表达开 始升高，至再灌注10h达高峰，其后水平略有下降， 持续至再灌注168h仍有表达。阳性反应血管以微血管 为主，阳性染色见于微血管的内皮细胞胞浆内，呈 紫蓝色，主要分布于额顶叶皮层及尾壳核区域，这 与缺血灶的部位相一致。对照组与假手术组可见少 量的、低表达的ICAM-1mRNA阳性血管，见表1，图1。
, 百拇医药
表1 对照组、假手术组及缺血再灌注组大鼠脑组织ICAM-1mRNA阳性血管数(/mm2，n=5)
Group
Time points of ischemia-reperfusion(h)
2
4
10
24
48
96
168
Control
, 百拇医药
51.6±6.2
72.4±14.4
78.3±13.8
63.2±9.5
74.1±12.2
64.6±10.4
58.9±13.4
Sham operation
60.2±8.4
69.3±12.3
70.0±10.1
67.5±12.7
, http://www.100md.com
76.6±13.5
57.1±12.6
64.3±10.1
Ischemia-reperfusion
187.0±41.6*△
449.3±53.1*△
1108.4±80.3*△
860.5±80.3*△
708.0±79.5*△
604.3±66.1*△
, http://www.100md.com
574.8±75.3*△
*:P<0.01 vs control;△:P<0.01 vs sham operation
图1 再灌注10h脑血管内皮细胞ICAM-1mRNA的表达(NBT/BCIP× 100)
Fig1 Expression of ICAM-1 mRNA in endothelial cells of cerebral vessels 10 h after reperfusion(NBT/BCIP×100)
, 百拇医药
2.2 ICAM-1免疫染色阳性的变化
缺血2h再灌注不同时间组大鼠，其缺血区均有不同 程度ICAM-1阳性反应的血管，与缺血侧相比有显著性 差异；缺血2h再灌注2h大鼠缺血侧ICAM-1表达开始升高 ，至再灌注48h达高峰，其后水平逐渐有所下降，持 续至再灌注168h仍保持较高水平，主要分布在梗死灶 周围区域。阳性反应血管以缺血区的微血管为主， 表现为血管壁呈棕黄色深染。对照组与假手术组双 侧未见有明显的ICAM-1阳性染色血管，见图2。
图2 再灌注48h脑血管内皮细胞ICAM-1的表达(ABC×200)
, 百拇医药
Fig2 ExpressionofICAM-1inendothelialcellsofcerebralvessels48hafterreperfusion(ABC×200)
2.3 脑缺血再灌注后缺血区中性白细胞浸润及细胞形态的变化
脑缺血2h开始出现轻度的神经元缺血性改变，至再 灌注24h神经元缺血性改变和白细胞浸润改变明显；再灌注72h，缺血区神经元表现为严重的缺血性损伤，缺血周围组织与缺血区边界明显，白细胞大量聚 集在缺血梗死周围区，这一现象出现在ICAM-1表达高 峰的后面，提示ICAM-1参与了白细胞聚集和神经元损伤机制；再灌注168h坏死组织区域逐渐扩大，有的出现缺血区腔穴，这与ICAM-1的表达情况相一致。对照组和假手术组未见脑组织有白细胞浸润及神经元损伤。
3 讨论
脑缺血再灌注后快速恢复的血流是加重缺血区损伤 的重要原因，正常情况下，中性粒细胞及血管内皮 细胞表面有少量ICAM-1表达，但在脑缺血等病理情况 下，ICAM-l明显上调[1]，使得白细胞与血管内皮细胞 间粘附力增加，进而贴壁、滚动、嵌塞微血管，造 成局部血液动力学环境改变；白细胞跨过内皮细胞 间隙进入周围组织，释放大量炎性介质和细胞因子 ，造成缺血区域的脑组织损伤，并吸引更多的白细 胞进入组织，形成恶性循环。本实验中对照组及假 手术组动物双侧皮质ICAM-1mRNA呈低水平表达，ICAM-l免 疫染色未见有明显阳性反应；各组大鼠缺血对侧的 ICAM-1mRNA和ICAM-l表达较少，随再灌注时间的延长，无 明显上升趋势。缺血2h再灌注2h组动物缺血侧ICAM-l mRNA和ICAM-1表达均开始升高，再灌流10h，ICAM-lmRNA阳性 反应最强，达到高峰，其后略有下降，至再灌流168h后 仍有表达;再灌流48h,ICAM-l阳性反应达到高峰，其后逐 渐下降，至再灌流168h后仍保持较高水平，这与Zhang等[1]的研究结果相一致。
, 百拇医药
ICAM-lmRNA和ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血 侧额叶、顶叶皮质及尾状核与壳核外侧部，与缺血 灶部位相一致。除缺血部位血管内皮细胞外，某些 部位如海马CAl区、额、顶叶皮层及尾壳核内的某些神 经核团也有阳性表达。参与缺血再灌注脑损伤的粘 附分子除ICAM-l外还有E-选择素[2]、P-选择素[3]、 CDl8[4]等，这些粘附分子相互协调，共同作用，介导着 白细胞和内皮细胞间的粘附。
应用抗粘附分子抗体治疗缺血性脑血管病的尝试也 取得了令人瞩目的成绩。1993年Bowes等[5]报道在鼠大脑 中动脉缺血再灌注损伤中使用ICAM-l抗体减少了脑缺 血性损伤。1995年，Zhang等[6]发现在阻断大鼠大脑中动 脉2h再灌注1h，使用ICAM-1单克隆抗体能使缺血性损伤 面积明显缩小，而在大脑中动脉永久阻断无再灌注 时则无此作用。近来研究发现ICAM-1的单克隆抗体能 选择性地减少神经细胞凋亡，这可能是其脑保护作 用机制之一[7]。
, 百拇医药
总之，脑缺血再灌注时白细胞与内皮细胞间的粘附是导致缺血区组织损伤的主要原因，粘附分子介导 了这两种细胞间的粘附作用。有效阻断这一过程，减轻缺血性脑损伤，是目前治疗缺血性脑血管病的一条有效途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670268)
作者简介：周华东(1955.11)，男，安徽省蚌埠市人， 博士，副教授，主要从事缺血性脑血管疾病方面的 研究，发表论文31篇。电话：(023)68757874
参考文献
[1] Zhang R L, Chopp M, Zaloga C, et al. The temporal profiles of ICAM-1 protein and mRNA expression after transient MCA occlu-sion in the rat[J]. Brain Research, 1995, 682(1):182-186.
, http://www.100md.com
[2] Limdsberg P J, Carpen O, Paetau A, et al. Endothelial ICAM-1 expression associated with inflammatory cell response in ischemic stroke[J]. Circulation,1996,94(5):939-943.
[3] Geng J G, Bevilacoua M P, Moore K L, et al. Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated by GMP-140[J].Nature, 1990, 343(6260):757-760.
[4] Catsuo Y, Onodera H, Shiga Y, et al. Role of cell adhesion molecules in brain injury afte r transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J]. Brain Res,1994,656(2):344-350.
, http://www.100md.com
[5] Bowes M P, Zivin J A, Rothleic R. Monoclonal antibody to the ICAM-1 adhesion site reduces neurological damage in a rabbit cerebral embolism stroke model[J]. Exp Neurol, 1993, 119(1): 215-219.
[6] Zhang R L, Chopp M, Jiang N, et al. Anti-intercellular adhesion molecule-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rats[J]. Stoke, 1995, 26(5):1 438-1 444.
[7] Chopp M, Li Y, Jiang N, et al. Antibodies against adhesion molecules reduce apoptosis after transient middle cerebral artery occlusion in rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab,1996,16 (4):578-584.
收稿日期：1999-11-10；修回日期：1999-12-30, 百拇医药
单位：周华东(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)；张莉莉(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)；陈曼娥(第三军医大学附属大坪 医院野战外科研究所脑血管病医院二科，重庆400042)
关键词：脑缺血再灌注；细胞间粘附分子-1；转录
第三军医大学学报000205
提要 目的：观察细胞间粘附分子ICAM-1mRNA及蛋白在大鼠脑缺血再灌注不同时程脑组织中的表达与脑组 织神经元的损伤。方法：45只雄性Wistar大鼠随机分为3组 ：正常组、假手术组、缺血2h再灌注2、4、10、24、48、96、168h组，分别进行原位杂交、免疫组织化学和组织 HE染色。结果：大脑中动脉缺血再灌注2h，局部脑组 织ICAM-1mRNA表达开始升高，再灌注10h达高峰，持续168 h；ICAM-1蛋白表达于再灌注2h开始升高，至48h达到高峰，持续168h以上。结论：脑缺血再灌注后ICAM-1表达 增高，介导了粒细胞与脑血管内皮细胞的粘附增强 ，和脑缺血再灌注损伤关系密切。
, 百拇医药
中图法分类号R619.9;R743.31 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0115-04
Expression of intercellular adhesion molecule-1 and neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion in rats
ZHOU Hua-dong, ZHANG Li-li, CHEN Man-e
(Department of Neurology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
Abstract Objective: To investigate the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and neuronal damage in cerebral foci after cerebral ischemia/reperfusion in rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomized into the normal control, sham-operated and cerebral ischemia/reperfusion groups. In situ hybridization, histochemistry, immunohistochemistry and histological techniques were used to determine expression of ICAM-1 and its mRNA and neuronal damage in ischemic brain tissue at different time phases after middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 2h in rats. Results: The expression of ICAM-1 and its mRNA started to increase at the 2nd h, peaked at the 12th and 48th h respectively after reperfusion. The high levels of expression of ICAM-1 and its mRNA maintained for 96 and 148 h respectively. Conclusion: The expression of ICAM-1 is increased after cerebral ischemia/reperfusion, which participates in the adhesion between neutrophils and capillary endothelial cells. This indicates that ICAM-1 is closely associated with the neuronal damage after cerebral ischemia/reperfusion.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemia/reperfusion; intercellular adhesion molecule-1; transcription; rat
局部脑缺血后白细胞向缺血区浸润，引发组织炎症 反应，造成局部脑损害。白细胞向缺血区浸润的一 个主要原因是血管内皮细胞和白细胞表面粘附分子 表达增高，致使白细胞贴壁、滚动、游离出血管外 。在这一过程中，细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)起到了关键的作用。本文用大 鼠局灶性脑缺血再灌注模型，原位杂交的方法观察测 定ICAM-1转录水平的变化，免疫组织化学方法测定ICAM-1蛋白表达情况，同时行普通HE染色光镜观察神经元损 伤情况，以探讨ICAM-1在缺血性脑损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组
, 百拇医药
选用体重250～280g雄性Wistar大鼠45只，随机分组情况如 下：对照组(n=5);假手术组(n=5)；缺血2h再灌注2、 4、8、24、48、96、168h，每个时相点各5只大鼠。
1.2 缺血再灌注模型制作和标本制备
德国产尼龙鱼线，直径0.2mm，顶端烫成直径约0.25mm的 光滑圆球状，用肝素处理后晾干备用。
1%戊巴比妥钠按35mg/kg进行腹腔注射麻醉，分离右 侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA) ，结扎并切断ECA及其分支，由ECA残端插入已制备好的 栓线，沿ECA，CCA分叉部和ICA轻柔推进约2.0cm时到达ICA颅 内分叉部即MCA起始处，阻断流入MCA的血流。再灌注组 于缺血2h后拔除栓线。假手术组操作同上，但仅分离 右侧颈总动脉。各组手术时间均在30min内完成。术中 及缺血期间采用反馈式电热毯保持肛温(37±0.2)°C。
, 百拇医药
模型成功的标志是动物苏醒后出现手术同侧(右侧 的)Horner征和手术对侧(左侧)肢体瘫痪，表现为左 前肢不能伸出、行走时向左侧倾倒或按逆时针方向 转圈。入选动物在取材时发现有蛛网膜下腔出血的 ，则弃置不用。
动物按上述分组情况到规定时间腹腔注射戊巴比妥 钠麻醉，经左心室主动脉插管灌注生理盐水200ml，然 后用Zamboni固定液200ml灌注固定，取脑组织投入Zamboni固 定液，于4℃下继续固定20h，放入30%蔗糖溶液(用4% 多聚甲醛配制)过夜，取出标本置于恒冷切片机上 经下丘脑中央部行全脑连续冠状切片(厚20μm)。
1.3 原位杂交方法检测ICAM-1mRNA的表达
1.3.1 cDNA探针制 备鼠ICAM-1cDNA质粒由日本T.horiuchi博士惠赠，转化到大肠杆菌(JM109)中扩增，用酚氯仿进行 质粒提取和纯化，加入内切酶BamHI进行酶切，低熔点 琼脂糖凝胶法回收目的片段，随机引物法地高辛标 记(标记试剂盒购于Boehringermannheim公司)。
, http://www.100md.com
1.3.2 原位杂交操作步骤 切片经0.3%TritonX-100漂洗、蛋 白酶K消化、预杂交后，在探针浓度为5ng/μl的杂交液 中于43°C下孵育20h，1∶800的抗地高辛抗体在室温下反 应12h，经NBT/BCIP显色系统染色后得到结果。杂交前所 用器械均经过RNA酶处理。原位杂交阴性对照采用以下 3种方法：①杂交前将切片用20μg/mlRNA酶37°C下预处理 30min；②杂交液中未加探针；③未加抗地高辛抗体。 相邻切片作HE染色。
1.4 免疫组织化学方法检测ICAM-1的表达
上述冰冻切片经H2O2处理10min后，用非免疫血清封闭 15min。一抗为小鼠抗大鼠ICAM-1单克隆抗体(购于武汉 博士德公司)，工作浓度为1∶100，室温下过夜进行 抗原抗体反应。ABC试剂盒按说明书进行操作。PBS漂洗 后，DAB显色系统进行闭光显色，光镜观察。阴性对照 用PBS代替一抗进行孵育。
, 百拇医药
1.5 数据分析
在10×10光镜下，以阳性染色的单个内皮细胞或内皮 细胞簇为一个阳性血管标记，每例观察切片1张，于血管丰富区随机选取5个相互非重叠视野进行观察， 并做定量图象分析(MAS-图象分析系统，重庆大学)，测出每平方毫米组织切片的阳性微血管数，进行 统计学分析，数据以
±s表示，用t检验。光镜下观察 中性白细胞浸润及病理形态学变化。2 结果
2.1 ICAM-1mRNA阳性反应的变化
缺血2h再灌注不同时间组大鼠，其缺血区均有不同 程度ICAM-1mRNA阳性反应的血管，与缺血侧相比有显著 性差异；缺血2h再灌注2h大鼠缺血侧ICAM-1mRNA表达开 始升高，至再灌注10h达高峰，其后水平略有下降， 持续至再灌注168h仍有表达。阳性反应血管以微血管 为主，阳性染色见于微血管的内皮细胞胞浆内，呈 紫蓝色，主要分布于额顶叶皮层及尾壳核区域，这 与缺血灶的部位相一致。对照组与假手术组可见少 量的、低表达的ICAM-1mRNA阳性血管，见表1，图1。
, 百拇医药
表1 对照组、假手术组及缺血再灌注组大鼠脑组织ICAM-1mRNA阳性血管数(/mm2，n=5)
Group
Time points of ischemia-reperfusion(h)
2
4
10
24
48
96
168
Control
, 百拇医药
51.6±6.2
72.4±14.4
78.3±13.8
63.2±9.5
74.1±12.2
64.6±10.4
58.9±13.4
Sham operation
60.2±8.4
69.3±12.3
70.0±10.1
67.5±12.7
, http://www.100md.com
76.6±13.5
57.1±12.6
64.3±10.1
Ischemia-reperfusion
187.0±41.6*△
449.3±53.1*△
1108.4±80.3*△
860.5±80.3*△
708.0±79.5*△
604.3±66.1*△
, http://www.100md.com
574.8±75.3*△
*:P<0.01 vs control;△:P<0.01 vs sham operation
图1 再灌注10h脑血管内皮细胞ICAM-1mRNA的表达(NBT/BCIP× 100)
Fig1 Expression of ICAM-1 mRNA in endothelial cells of cerebral vessels 10 h after reperfusion(NBT/BCIP×100)
, 百拇医药
2.2 ICAM-1免疫染色阳性的变化
缺血2h再灌注不同时间组大鼠，其缺血区均有不同 程度ICAM-1阳性反应的血管，与缺血侧相比有显著性 差异；缺血2h再灌注2h大鼠缺血侧ICAM-1表达开始升高 ，至再灌注48h达高峰，其后水平逐渐有所下降，持 续至再灌注168h仍保持较高水平，主要分布在梗死灶 周围区域。阳性反应血管以缺血区的微血管为主， 表现为血管壁呈棕黄色深染。对照组与假手术组双 侧未见有明显的ICAM-1阳性染色血管，见图2。
图2 再灌注48h脑血管内皮细胞ICAM-1的表达(ABC×200)
, 百拇医药
Fig2 ExpressionofICAM-1inendothelialcellsofcerebralvessels48hafterreperfusion(ABC×200)
2.3 脑缺血再灌注后缺血区中性白细胞浸润及细胞形态的变化
脑缺血2h开始出现轻度的神经元缺血性改变，至再 灌注24h神经元缺血性改变和白细胞浸润改变明显；再灌注72h，缺血区神经元表现为严重的缺血性损伤，缺血周围组织与缺血区边界明显，白细胞大量聚 集在缺血梗死周围区，这一现象出现在ICAM-1表达高 峰的后面，提示ICAM-1参与了白细胞聚集和神经元损伤机制；再灌注168h坏死组织区域逐渐扩大，有的出现缺血区腔穴，这与ICAM-1的表达情况相一致。对照组和假手术组未见脑组织有白细胞浸润及神经元损伤。
3 讨论
脑缺血再灌注后快速恢复的血流是加重缺血区损伤 的重要原因，正常情况下，中性粒细胞及血管内皮 细胞表面有少量ICAM-1表达，但在脑缺血等病理情况 下，ICAM-l明显上调[1]，使得白细胞与血管内皮细胞 间粘附力增加，进而贴壁、滚动、嵌塞微血管，造 成局部血液动力学环境改变；白细胞跨过内皮细胞 间隙进入周围组织，释放大量炎性介质和细胞因子 ，造成缺血区域的脑组织损伤，并吸引更多的白细 胞进入组织，形成恶性循环。本实验中对照组及假 手术组动物双侧皮质ICAM-1mRNA呈低水平表达，ICAM-l免 疫染色未见有明显阳性反应；各组大鼠缺血对侧的 ICAM-1mRNA和ICAM-l表达较少，随再灌注时间的延长，无 明显上升趋势。缺血2h再灌注2h组动物缺血侧ICAM-l mRNA和ICAM-1表达均开始升高，再灌流10h，ICAM-lmRNA阳性 反应最强，达到高峰，其后略有下降，至再灌流168h后 仍有表达;再灌流48h,ICAM-l阳性反应达到高峰，其后逐 渐下降，至再灌流168h后仍保持较高水平，这与Zhang等[1]的研究结果相一致。
, 百拇医药
ICAM-lmRNA和ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血 侧额叶、顶叶皮质及尾状核与壳核外侧部，与缺血 灶部位相一致。除缺血部位血管内皮细胞外，某些 部位如海马CAl区、额、顶叶皮层及尾壳核内的某些神 经核团也有阳性表达。参与缺血再灌注脑损伤的粘 附分子除ICAM-l外还有E-选择素[2]、P-选择素[3]、 CDl8[4]等，这些粘附分子相互协调，共同作用，介导着 白细胞和内皮细胞间的粘附。
应用抗粘附分子抗体治疗缺血性脑血管病的尝试也 取得了令人瞩目的成绩。1993年Bowes等[5]报道在鼠大脑 中动脉缺血再灌注损伤中使用ICAM-l抗体减少了脑缺 血性损伤。1995年，Zhang等[6]发现在阻断大鼠大脑中动 脉2h再灌注1h，使用ICAM-1单克隆抗体能使缺血性损伤 面积明显缩小，而在大脑中动脉永久阻断无再灌注 时则无此作用。近来研究发现ICAM-1的单克隆抗体能 选择性地减少神经细胞凋亡，这可能是其脑保护作 用机制之一[7]。
, 百拇医药
总之，脑缺血再灌注时白细胞与内皮细胞间的粘附是导致缺血区组织损伤的主要原因，粘附分子介导 了这两种细胞间的粘附作用。有效阻断这一过程，减轻缺血性脑损伤，是目前治疗缺血性脑血管病的一条有效途径。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670268)
作者简介：周华东(1955.11)，男，安徽省蚌埠市人， 博士，副教授，主要从事缺血性脑血管疾病方面的 研究，发表论文31篇。电话：(023)68757874
参考文献
[1] Zhang R L, Chopp M, Zaloga C, et al. The temporal profiles of ICAM-1 protein and mRNA expression after transient MCA occlu-sion in the rat[J]. Brain Research, 1995, 682(1):182-186.
, http://www.100md.com
[2] Limdsberg P J, Carpen O, Paetau A, et al. Endothelial ICAM-1 expression associated with inflammatory cell response in ischemic stroke[J]. Circulation,1996,94(5):939-943.
[3] Geng J G, Bevilacoua M P, Moore K L, et al. Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated by GMP-140[J].Nature, 1990, 343(6260):757-760.
[4] Catsuo Y, Onodera H, Shiga Y, et al. Role of cell adhesion molecules in brain injury afte r transient middle cerebral artery occlusion in the rat[J]. Brain Res,1994,656(2):344-350.
, http://www.100md.com
[5] Bowes M P, Zivin J A, Rothleic R. Monoclonal antibody to the ICAM-1 adhesion site reduces neurological damage in a rabbit cerebral embolism stroke model[J]. Exp Neurol, 1993, 119(1): 215-219.
[6] Zhang R L, Chopp M, Jiang N, et al. Anti-intercellular adhesion molecule-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the Wistar rats[J]. Stoke, 1995, 26(5):1 438-1 444.
[7] Chopp M, Li Y, Jiang N, et al. Antibodies against adhesion molecules reduce apoptosis after transient middle cerebral artery occlusion in rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab,1996,16 (4):578-584.
收稿日期：1999-11-10；修回日期：1999-12-30, 百拇医药