PLC-ESI/MS法分析大豆胚芽中的异黄酮--大豆异黄酮和皂苷的研究(Ⅲ)
作者：谷利伟 谷文英 陶冠军 秦昉
单位：谷利伟 谷文英(无锡轻工业大学食品学院 214036)；陶冠军 秦昉(无锡轻工业大学分析中心)
关键词：大豆；异黄酮；HPLC-ESI/MS
中草药001110摘 要 以HPLC-ESI/MS对大豆胚芽中的异黄酮进行 了定量和定性分析，表明ESI/MS能够灵敏而准确地反应色谱峰成分的结构特征，解决了HPLC 分析过程微量和不稳定的异黄酮的色谱峰的定性难题，以少数的标样即可对所有结构的异 黄酮进行定量。
HPLC-ESI/MS Analysis of Isoflavones from Soy Hypocotyl (Ⅲ)[ WT
Gu Liwei and Gu Wenying
, http://www.100md.com
(School of Food, Wuxi University of Light Industry Wuxi 214036)
Tao Guanjun and Qin Fang
(Analytical Center, Wuxi University of Light Industry)
Abstract Various isoflavones from soybean hypocotyl were ana lyzed quantitatively and qualitatively by HPLC-ESI/MS. It revealed that ESI/MS could identify the unstable and minor isoflavone isomer peaks with high sensitiv ity and accuracy. All isoflavones could be quantitatively analyzed with the aid of ESI/MS. The components of isoflavone in different parts of soybean and its d i fference caused by treatments were analyzed and compared by means of this method .
, 百拇医药
Key words soybean isoflavones HPLC-ESI/MS
大豆异黄酮能降低乳腺癌、前列腺癌等的发病率；缓解更年期因雌激素分泌减少而引起的更 年 期障碍和骨质疏松症；是大豆食品使血液胆固醇下降的关键物质[1]，对大豆食品 中异黄酮的准确定性定量分析是研究异黄酮生理作用的基础。
以常规的反相HPLC结合260 nm紫外检测的方法测定大豆中的异黄酮有一定的难度。大豆中的 异黄酮有12 种，其中约68%以丙二酰化的糖苷形式存在，但这种形式极不稳定，5 ℃贮存5 d即自动水解为糖苷[2]。丙二酰糖苷干热处理后分解得到天然大豆中不存在的乙酰 化的糖苷。以上异黄酮成分或不稳定或含量极少，不易得到标样进行定性。大豆中异黄酮 的组成成分因品种、加工方法的差异变化极大，以紫外吸收检测时存在酚酸等化合物的干扰 ，使紫外检测不易对微量的或不稳定异黄酮的色谱峰作准确定性，可能使分析出现较大的误 差。液质联用技术解决了色谱峰的定性问题。电喷雾电离(ESI)是一种新的液质联用接口技 术，色谱流动相通过一个带电荷的毛细管喷入质谱的入口锥孔处，同向吹入的氮气流将挥发 的溶剂带走，带电荷的液滴在静电力的作用下最终分散成单个分子进入质谱的下一级入口锥 孔中。ESI是一种温和的“冷”电离方式，适合分析热不稳定的化合物[3]。
, http://www.100md.com
大豆胚芽是大豆的生殖器官，占大豆总重量的2%～2.5%，组成成分独特，其中异黄酮的含 量 是子叶中的8～10 倍，其中glycitin和soyasaponin A仅分布于大豆的胚芽中[4]。 本文以ESI/MS做HPLC色谱峰的定性鉴定，对大豆胚芽中的异黄酮进行定量分析。
1 实验方法与材料
1.1 标样配制：daidzin，genistin,glycitin,daidzein和genistein为Sigma公司产品。 取标样溶于适量的95% 乙醇中，取少量的标样溶液稀释到吸光度0.3～0.8之间，标样的浓度按最大吸收波长处的 摩 耳消光系数计算(daidzein & daidzin λmax=254 nm ε=104.45；glycitin λmax=260 nm ε=104.42；genisten & genistin λmax=260 nm ε=1 04.51)，标样的纯度以各自最大吸收波长处的HPLC峰面积除以总峰面积得到，标样 的 最终浓度根据其纯度校正。丙二酰及乙二酰基异黄酮糖苷以相应的糖苷为标样定量，以分子 量差异校正峰面积的响应因子[5]。
, 百拇医药
1.2 样品提取：单一品种东北大豆的胚芽粉碎后过80 目筛，准确称取胚芽约250 mg 3 份 。第一份放入25 mL容量瓶中，加80%乙醇到接近刻度，80 ℃保温热浸6 h；第二份直接放入 25 mL容量瓶中超声波发生器中冷浸6 h；第三份胚芽样品120 ℃烘2 h后放入25 mL容量瓶中 超声提取6 h。全部3 份样品提取后，冷到室温定容，静置过夜，取上清液以0.45 μm膜过 滤后做HPLC分析。来自同一品种大豆的子叶、豆皮的提取方法同胚芽的冷浸法。
1.3 仪器与方法：分离单元为Waters 2690 separation module。Supelcosil C18 色谱柱25 cm×4.6 mm，30%～60%的甲醇直线梯度(流动相中含乙酸0.5%)洗脱，分析时间4 0 m in，进样量20 μL。使用Waters 996 二极管阵列检测器，扫描波长200～450 nm。Micromas s电喷雾质谱仪作柱后检测，分流三通分流比1/10。ESI/MS :capillary voltage 4.05 kV , cone 110 V, extractor 5 V, source block temperature 120 ℃, desolvation temper ature 250 ℃。 ESI-/MS: capillary voltage 3.7 kV, cone 90 V。分析系统：Masslyn x chromatography analytic system on Digital personal workstation。
, 百拇医药
2 结果与讨论
2.1 异黄酮的HPLC分离与ESI/MS特征：大豆子叶与胚芽中异黄酮以260 nm紫外检测的HPLC 分离结果如图-1A，B所示，冷浸大豆子叶的异黄酮组成比较简单，而胚芽的异黄酮组成相 对复杂。胚芽HPLC谱中保留时间最长的3 个微量组分是3 种异黄酮的苷元。异黄酮的糖苷、 丙二酰化及乙酰化糖苷的极性相当，比例受样品处理方法的影响大，微量的乙酰化异黄酮糖 苷的色谱峰常混杂在丙二酰化异黄酮之间，在没有糖苷标样或标样种类有限的情况下很难对 它们的色谱峰进行定性。冷浸大豆胚芽异黄酮的总离子流色谱图(图-1C)与260 nm检测的HP LC图相似，以ESI/MS的m/z 255.3为选择离子检测色谱峰中以daidzein(分子量为254.3) 为 苷元的异黄酮色谱峰位置，得到4 个色谱峰(图1-D)。图2是图1-D中前3个非苷元异黄酮色 谱峰相对应的ESI/MS图谱，这三种组分的[M+H]+的准分子离子峰分别 为m/z 417.2，503.2和450.2，很容易地判断其结构是daidzin，6″-malonyldaidzin和 6″ -acetyldaidzin。二极管阵列检测显示它们的紫外吸收光谱相同，最大吸收为254 nm，与d aidzein的标样相同。它们的分子式与结构变化关系如图3。以上3 种糖苷型异黄酮组分的ES I/MS都以苷元daidzein的[M+H]+离子m/z 255.3 为基峰，表明异黄酮苷的糖苷键键能 较低，在电场中被加速和电离的过程中容易发生断裂，而断裂得到的苷元很稳定，形成基峰 。在质谱中未观察到6″-malonyldaidzin脱羧形成的[M-44]+峰，表明在电喷雾电离 过程中样品受热不明显，未发生脱羟反应。以m/z 285.3和271.3为选择离子可以鉴别出以 glycitein和genistein为苷元的异黄酮的色谱峰，它们的乙酰化糖苷含量少，在本实验中未 检出。
, 百拇医药
A-冷浸大豆子叶异黄酮 B-冷浸胚芽异黄酮 C-冷浸胚芽异黄酮ESI/MS总离子流谱 D- 冷浸胚芽异黄酮的m/z 255.3的选择离子谱 峰a、b、c、d、e、f、g、h、i、j见表1
图1 样品检测图谱
A为daidzin B为6″-malony1daidzin C为6″-acetyl-daidzin图2 以daidzin为苷元的3 种糖苷型异黄酮的 ESI/MS图
异黄酮的紫外吸收是由苷元部分决定的，受糖苷的影响不大，所以在能确定各个异黄酮色谱 峰的位置后，可以以容易分离的3 种异黄酮苷元为标样对所有结构的异黄酮进行定量。
2.2 不同处理方法对胚芽中异黄酮组成的影响：大豆子叶与胚芽的异黄酮组成差异明显， 子叶中不含以glycitein为苷元的异黄酮(表1)，主要组分以daidzein和genistein计算的比 例约为35∶65。胚芽中异黄酮的含量达3.33%，是子叶含量的6 倍，主要成分以daidzein， glycitein和genistein计算的比例约为55∶30∶15，Kudou(1991)报道3 种成分的比例为4∶ 5∶1，这种差异可能是由于所分析的大豆的品种不同[4]。豆皮的提取物中未检出 异黄酮的存在。
, 百拇医药
图3 以daidze in为苷元的4 种异黄酮的结构变化
表1 不同处理方式对胚芽中异黄酮组成的影响
(单位 mg/100 g)
成分
冷浸胚芽[ 〗热浸胚芽
干热处
理胚芽
冷浸大
豆子叶
daidzin(a)
368
1210
, 百拇医药
239
43.1
glycitin(b)
249
656
252
-
genistin(c)
154
201
256
63.8
malonyldaidzin(d)
, 百拇医药
145
280
452
121
malonylglycitin(e)
534
430
194
-
acetyldaidzin(f)
82.4
278
941
, 百拇医药
-
malonylgenisitin(g)
475
228
516
237
daidzein(h)
59.5
31.0
65.2
4.8
glycitein(i)
, 百拇医药 10.4
11.5
24.1
-
genistein(j)
0.6
14.6
30.6
-
Total
3331
3341
2971
, 百拇医药
469
冷浸的大豆胚芽中丙二酰型异黄酮的含量为73%，乙酰型糖苷和苷元的含量仅为2.5%和0.5 % 。胚芽以溶剂热浸后丙二酰糖苷型异黄酮的比例下降到28%，而相应糖苷的含量由23%升高到 62%，表明丙二酰糖苷型异黄酮是天然异黄酮的主要存在形式，在溶剂中受热后分解成糖苷 。胚芽干热处理后丙二酰糖苷型异黄酮的含量下降34%，乙酰化糖苷的量上升28%，显然乙酰 糖苷型异黄酮是由丙二酰干热处理后脱羧的产物。
大豆异黄酮结构的变化使不同豆类食品中的异黄酮的组成差异较大，豆浆和醇法浓缩大豆蛋 白中以异黄酮糖苷为主，在膨化大豆制品和烘烤的小食品中乙酰化糖苷的比例较大，发酵大 豆食品中的异黄酮几乎全部是苷元[2]。这种组成的差异可能会影响到食品的风味 [6]及异黄酮的生物利用度[7]。
Address： Gu Liwei, School of Food, Wuxi University of Light Industry, Wuxi
, 百拇医药
谷利伟 男，1972年生，博士研究生，研究方向为中草药与功能食品。参加一项国家自然科 学基金研究(抗氧化中草药的筛选与成分研究)，目前的研究题目是大豆异黄酮和皂苷，已在 国内外发表论文10余篇。
参 考 文 献
1，Kenneth P R. Am J Clin Nutr, 1998,68(suppl):1338s
2，Wang H J, Murphy P A. J Agric Food Chem, 1994, 42:1666
3，Barnes S. Proc Soc Exper Bion Med, 1998,2 17:254
4，Shigemitsu Kudo，Fleury Y, Weltle D, et al. Agric Bio l Chem, 1991,55(9):2227
5，Song T T， Murphy P A. Am J Clin Nutr,1998,68(suppl):1711s
6，Seo A， Morr C V. J Agric Food Chem,1984,32:530
7，Xu X, Wang H J, Murphy P A,et al. J Nutr,1994,124:825
8，大久保一良，吉城由美子，吉越昌树，等.食品开发(日)，1991，18：16
(1999-12-29收稿), http://www.100md.com
单位：谷利伟 谷文英(无锡轻工业大学食品学院 214036)；陶冠军 秦昉(无锡轻工业大学分析中心)
关键词：大豆；异黄酮；HPLC-ESI/MS
中草药001110摘 要 以HPLC-ESI/MS对大豆胚芽中的异黄酮进行 了定量和定性分析，表明ESI/MS能够灵敏而准确地反应色谱峰成分的结构特征，解决了HPLC 分析过程微量和不稳定的异黄酮的色谱峰的定性难题，以少数的标样即可对所有结构的异 黄酮进行定量。
HPLC-ESI/MS Analysis of Isoflavones from Soy Hypocotyl (Ⅲ)[ WT
Gu Liwei and Gu Wenying
, http://www.100md.com
(School of Food, Wuxi University of Light Industry Wuxi 214036)
Tao Guanjun and Qin Fang
(Analytical Center, Wuxi University of Light Industry)
Abstract Various isoflavones from soybean hypocotyl were ana lyzed quantitatively and qualitatively by HPLC-ESI/MS. It revealed that ESI/MS could identify the unstable and minor isoflavone isomer peaks with high sensitiv ity and accuracy. All isoflavones could be quantitatively analyzed with the aid of ESI/MS. The components of isoflavone in different parts of soybean and its d i fference caused by treatments were analyzed and compared by means of this method .
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Key words soybean isoflavones HPLC-ESI/MS
大豆异黄酮能降低乳腺癌、前列腺癌等的发病率；缓解更年期因雌激素分泌减少而引起的更 年 期障碍和骨质疏松症；是大豆食品使血液胆固醇下降的关键物质[1]，对大豆食品 中异黄酮的准确定性定量分析是研究异黄酮生理作用的基础。
以常规的反相HPLC结合260 nm紫外检测的方法测定大豆中的异黄酮有一定的难度。大豆中的 异黄酮有12 种，其中约68%以丙二酰化的糖苷形式存在，但这种形式极不稳定，5 ℃贮存5 d即自动水解为糖苷[2]。丙二酰糖苷干热处理后分解得到天然大豆中不存在的乙酰 化的糖苷。以上异黄酮成分或不稳定或含量极少，不易得到标样进行定性。大豆中异黄酮 的组成成分因品种、加工方法的差异变化极大，以紫外吸收检测时存在酚酸等化合物的干扰 ，使紫外检测不易对微量的或不稳定异黄酮的色谱峰作准确定性，可能使分析出现较大的误 差。液质联用技术解决了色谱峰的定性问题。电喷雾电离(ESI)是一种新的液质联用接口技 术，色谱流动相通过一个带电荷的毛细管喷入质谱的入口锥孔处，同向吹入的氮气流将挥发 的溶剂带走，带电荷的液滴在静电力的作用下最终分散成单个分子进入质谱的下一级入口锥 孔中。ESI是一种温和的“冷”电离方式，适合分析热不稳定的化合物[3]。
, http://www.100md.com
大豆胚芽是大豆的生殖器官，占大豆总重量的2%～2.5%，组成成分独特，其中异黄酮的含 量 是子叶中的8～10 倍，其中glycitin和soyasaponin A仅分布于大豆的胚芽中[4]。 本文以ESI/MS做HPLC色谱峰的定性鉴定，对大豆胚芽中的异黄酮进行定量分析。
1 实验方法与材料
1.1 标样配制：daidzin，genistin,glycitin,daidzein和genistein为Sigma公司产品。 取标样溶于适量的95% 乙醇中，取少量的标样溶液稀释到吸光度0.3～0.8之间，标样的浓度按最大吸收波长处的 摩 耳消光系数计算(daidzein & daidzin λmax=254 nm ε=104.45；glycitin λmax=260 nm ε=104.42；genisten & genistin λmax=260 nm ε=1 04.51)，标样的纯度以各自最大吸收波长处的HPLC峰面积除以总峰面积得到，标样 的 最终浓度根据其纯度校正。丙二酰及乙二酰基异黄酮糖苷以相应的糖苷为标样定量，以分子 量差异校正峰面积的响应因子[5]。
, 百拇医药
1.2 样品提取：单一品种东北大豆的胚芽粉碎后过80 目筛，准确称取胚芽约250 mg 3 份 。第一份放入25 mL容量瓶中，加80%乙醇到接近刻度，80 ℃保温热浸6 h；第二份直接放入 25 mL容量瓶中超声波发生器中冷浸6 h；第三份胚芽样品120 ℃烘2 h后放入25 mL容量瓶中 超声提取6 h。全部3 份样品提取后，冷到室温定容，静置过夜，取上清液以0.45 μm膜过 滤后做HPLC分析。来自同一品种大豆的子叶、豆皮的提取方法同胚芽的冷浸法。
1.3 仪器与方法：分离单元为Waters 2690 separation module。Supelcosil C18 色谱柱25 cm×4.6 mm，30%～60%的甲醇直线梯度(流动相中含乙酸0.5%)洗脱，分析时间4 0 m in，进样量20 μL。使用Waters 996 二极管阵列检测器，扫描波长200～450 nm。Micromas s电喷雾质谱仪作柱后检测，分流三通分流比1/10。ESI/MS :capillary voltage 4.05 kV , cone 110 V, extractor 5 V, source block temperature 120 ℃, desolvation temper ature 250 ℃。 ESI-/MS: capillary voltage 3.7 kV, cone 90 V。分析系统：Masslyn x chromatography analytic system on Digital personal workstation。
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2 结果与讨论
2.1 异黄酮的HPLC分离与ESI/MS特征：大豆子叶与胚芽中异黄酮以260 nm紫外检测的HPLC 分离结果如图-1A，B所示，冷浸大豆子叶的异黄酮组成比较简单，而胚芽的异黄酮组成相 对复杂。胚芽HPLC谱中保留时间最长的3 个微量组分是3 种异黄酮的苷元。异黄酮的糖苷、 丙二酰化及乙酰化糖苷的极性相当，比例受样品处理方法的影响大，微量的乙酰化异黄酮糖 苷的色谱峰常混杂在丙二酰化异黄酮之间，在没有糖苷标样或标样种类有限的情况下很难对 它们的色谱峰进行定性。冷浸大豆胚芽异黄酮的总离子流色谱图(图-1C)与260 nm检测的HP LC图相似，以ESI/MS的m/z 255.3为选择离子检测色谱峰中以daidzein(分子量为254.3) 为 苷元的异黄酮色谱峰位置，得到4 个色谱峰(图1-D)。图2是图1-D中前3个非苷元异黄酮色 谱峰相对应的ESI/MS图谱，这三种组分的[M+H]+的准分子离子峰分别 为m/z 417.2，503.2和450.2，很容易地判断其结构是daidzin，6″-malonyldaidzin和 6″ -acetyldaidzin。二极管阵列检测显示它们的紫外吸收光谱相同，最大吸收为254 nm，与d aidzein的标样相同。它们的分子式与结构变化关系如图3。以上3 种糖苷型异黄酮组分的ES I/MS都以苷元daidzein的[M+H]+离子m/z 255.3 为基峰，表明异黄酮苷的糖苷键键能 较低，在电场中被加速和电离的过程中容易发生断裂，而断裂得到的苷元很稳定，形成基峰 。在质谱中未观察到6″-malonyldaidzin脱羧形成的[M-44]+峰，表明在电喷雾电离 过程中样品受热不明显，未发生脱羟反应。以m/z 285.3和271.3为选择离子可以鉴别出以 glycitein和genistein为苷元的异黄酮的色谱峰，它们的乙酰化糖苷含量少，在本实验中未 检出。
, 百拇医药
A-冷浸大豆子叶异黄酮 B-冷浸胚芽异黄酮 C-冷浸胚芽异黄酮ESI/MS总离子流谱 D- 冷浸胚芽异黄酮的m/z 255.3的选择离子谱 峰a、b、c、d、e、f、g、h、i、j见表1
图1 样品检测图谱
A为daidzin B为6″-malony1daidzin C为6″-acetyl-daidzin图2 以daidzin为苷元的3 种糖苷型异黄酮的 ESI/MS图
异黄酮的紫外吸收是由苷元部分决定的，受糖苷的影响不大，所以在能确定各个异黄酮色谱 峰的位置后，可以以容易分离的3 种异黄酮苷元为标样对所有结构的异黄酮进行定量。
2.2 不同处理方法对胚芽中异黄酮组成的影响：大豆子叶与胚芽的异黄酮组成差异明显， 子叶中不含以glycitein为苷元的异黄酮(表1)，主要组分以daidzein和genistein计算的比 例约为35∶65。胚芽中异黄酮的含量达3.33%，是子叶含量的6 倍，主要成分以daidzein， glycitein和genistein计算的比例约为55∶30∶15，Kudou(1991)报道3 种成分的比例为4∶ 5∶1，这种差异可能是由于所分析的大豆的品种不同[4]。豆皮的提取物中未检出 异黄酮的存在。
, 百拇医药
图3 以daidze in为苷元的4 种异黄酮的结构变化
表1 不同处理方式对胚芽中异黄酮组成的影响
(单位 mg/100 g)
成分
冷浸胚芽[ 〗热浸胚芽
干热处
理胚芽
冷浸大
豆子叶
daidzin(a)
368
1210
, 百拇医药
239
43.1
glycitin(b)
249
656
252
-
genistin(c)
154
201
256
63.8
malonyldaidzin(d)
, 百拇医药
145
280
452
121
malonylglycitin(e)
534
430
194
-
acetyldaidzin(f)
82.4
278
941
, 百拇医药
-
malonylgenisitin(g)
475
228
516
237
daidzein(h)
59.5
31.0
65.2
4.8
glycitein(i)
, 百拇医药 10.4
11.5
24.1
-
genistein(j)
0.6
14.6
30.6
-
Total
3331
3341
2971
, 百拇医药
469
冷浸的大豆胚芽中丙二酰型异黄酮的含量为73%，乙酰型糖苷和苷元的含量仅为2.5%和0.5 % 。胚芽以溶剂热浸后丙二酰糖苷型异黄酮的比例下降到28%，而相应糖苷的含量由23%升高到 62%，表明丙二酰糖苷型异黄酮是天然异黄酮的主要存在形式，在溶剂中受热后分解成糖苷 。胚芽干热处理后丙二酰糖苷型异黄酮的含量下降34%，乙酰化糖苷的量上升28%，显然乙酰 糖苷型异黄酮是由丙二酰干热处理后脱羧的产物。
大豆异黄酮结构的变化使不同豆类食品中的异黄酮的组成差异较大，豆浆和醇法浓缩大豆蛋 白中以异黄酮糖苷为主，在膨化大豆制品和烘烤的小食品中乙酰化糖苷的比例较大，发酵大 豆食品中的异黄酮几乎全部是苷元[2]。这种组成的差异可能会影响到食品的风味 [6]及异黄酮的生物利用度[7]。
Address： Gu Liwei, School of Food, Wuxi University of Light Industry, Wuxi
, 百拇医药
谷利伟 男，1972年生，博士研究生，研究方向为中草药与功能食品。参加一项国家自然科 学基金研究(抗氧化中草药的筛选与成分研究)，目前的研究题目是大豆异黄酮和皂苷，已在 国内外发表论文10余篇。
参 考 文 献
1，Kenneth P R. Am J Clin Nutr, 1998,68(suppl):1338s
2，Wang H J, Murphy P A. J Agric Food Chem, 1994, 42:1666
3，Barnes S. Proc Soc Exper Bion Med, 1998,2 17:254
4，Shigemitsu Kudo，Fleury Y, Weltle D, et al. Agric Bio l Chem, 1991,55(9):2227
5，Song T T， Murphy P A. Am J Clin Nutr,1998,68(suppl):1711s
6，Seo A， Morr C V. J Agric Food Chem,1984,32:530
7，Xu X, Wang H J, Murphy P A,et al. J Nutr,1994,124:825
8，大久保一良，吉城由美子，吉越昌树，等.食品开发(日)，1991，18：16
(1999-12-29收稿), http://www.100md.com