60Coγ射线对K562细胞及其耐热亚群杀伤作用的研究*
作者：张军宁 许昌韶
单位：苏州医学院附属第一医院放疗科，苏州，215006
关键词：耐热细胞；人红白血病细胞株；5-氟脲嘧啶；放射敏感性
苏州医学院学报991206 摘要 目的 研究60Coγ射线对K562细胞及其耐热亚群的杀伤作用。方法 先诱导产生K562细胞耐热亚群，然后应用不同剂量60Coγ射线照射和5-Fu对K562细胞株及其耐热亚群的放射敏感性进行测定。结果 K562细胞耐热亚群对射线照射和5-Fu具有一定程度的耐受性;5-Fu联合不同剂量的照射有部分的相加作用。结论 K562细胞热耐受性、耐药性及放射抗性之间有一定的必然联系。提示在临床热疗工作中，必须采用合理的序贯和递降加温以设法避开或减弱肿瘤的热耐受期。
, 百拇医药
中图法分类 R730.5
The Response of K562 and Its Thermotolerant Cells to 60Coγ-Ray Irradiation
Zhang Junning，Xu Changshao
(The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,21 5006)
Abstract Objective To study the relationship between thermoto lerance and radiosensitivity of K562 Cells. Methods K 562 thermotolerant cells were induced at first,then the radiosensitivity of K 562 thermotolerant cells were measured.Results The radio sensitivity of K562 thermotolerant cells as well as its drug cytot oxicity was lower than that of K562 cells;and there were additional effect s of 5-Fu on radiosensitivity.Conclusion Correlation exists among thermotolerance,radioresistance and drug-resistance .The work demonstrates that it is essential to avoid thermotolerance stages in clinical practice.
, 百拇医药
Key words thermotolerant cells； K562 cell； 5-Fu； radiosensitivity
肿瘤患者在热疗过程中，肿瘤细胞常产生耐热性，但耐热肿瘤细胞对放射的敏感性是否也相应地发生变化，目前有关报道不多。我们利用本科诱导的K562细胞耐热亚群，测定其耐热与非耐热细胞的放射敏感性。
1 材料和方法
1.1 细胞系：K562(人红白血病细胞株)引自本院微生物学教研室；耐热亚群的诱导：将含有1×105/mlK562细胞的培养瓶放置41℃水浴箱中30min，再放回37℃CO2培养箱中8h，然后再置于45℃水浴箱中20min。
1.2 试剂：5-Fu，0.025g/ml,山东济宁制药厂产品。RPMI1640和小牛血清均为华美公司产品。
, 百拇医药
1.3 细胞培养：取对数生长期的细胞，配成1×105/ml细胞悬液，4.5ml/培养瓶，半贴壁培养。培养液为含20%小牛血清的RPMI1640，在37℃饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。
1.4 照射：取上述细胞悬液，用60Coγ射线均匀照射，球靶距离70cm,照射剂量分别为0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0Gy,剂量率为90.3cGy/min，每组1瓶。照射后与未照射对照组立即将细胞转入16孔培养板，每组4孔，每孔1.0ml,含1×105/ml细胞,继续培养48h,0.02%胰酶消化后计数活细胞。
1.5 5-Fu及5-Fu加照射对K562(非耐热细胞)、K562耐热亚群生长的影响：取对数生长期的K562和K562耐热亚群,细胞浓度为1×105/ml,培养液中含5-Fu0.025g/ml,分为空白对照组、5-Fu组、5-Fu加照射组(照射剂量分别为0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0Gy),照射后培养与计数条件同前。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 K562和K562耐热亚群的放射敏感性：见表1。由表1可见，K562和K562耐热亚群对γ射线照射有明显的剂量依赖性。
表1 60Coγ射线照射对K562及K562耐热亚群存活率的影响(
±s) 照射剂量
(Gy)
K562
K562耐热亚群
细胞数×105
, 百拇医药
存活率(%)
细胞数×105
存活率(%)
对照组
5.685±0.256
100.0
1.950±0.149
100.0
0.5
4.500±0.513
79.2
1.725±0.111
, 百拇医药
88.5
1.0
3.875±0.366**
68.2
1.713±0.103
87.8
3.0
2.838±0.293**
49.9
1.663±0.018
85.5
6.0
, 百拇医药
1.988±0.157**
35.0
1.338±0.075**
68.6
9.0
1.667±0.080**
29.3
1.088±0.035**
55.8
**与对照组相比，P<0.01
2.2 5-Fu及5-Fu加照射对K562、K562耐热亚群生长的影响：单独用5-Fu时,K562细胞存活率为正常对照组的62.87%,细胞数为(3.725±0.155)×105；5-Fu联合不同剂量照射组与表1各照射组相比,细胞存活率的下降呈现有部分的相加现象(见表2)。单独用5-Fu时，K562耐热亚群存活率与正常对照组相比无明显差异,细胞数为(1.575±0.197)×105(P>0.05)；5-Fu联合照射对K562耐热亚群的影响,与表1各照射组相比,其存活率与对照组无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表2 照射和5-Fu对K562及K562耐热细胞存活率的影响(±s) 照射剂量
(Gy)
5-Fu
(mg)
K562
K562耐热亚群
细胞数×105
存活率(%)
细胞数×105
, 百拇医药
存活率(%)
对照组
0.000
5.925±0.536
100.0
1.825±0.216
100.0
0.00
0.025
3.725±0.155**
62.9
1.575±0.197
, 百拇医药
86.3
0.25
0.025
3.950±0.105*
66.7
1.575±0.131
86.3
0.50
0.025
3.500±0.082**
59.1
1.525±0.025*
, http://www.100md.com
83.6
1.00
0.025
2.600±0.216*
43.9
1.450±0.087*
79.5
3.00
0.025
1.950±0.171**
32.9
, http://www.100md.com 1.400±0.135
76.7
6.00
0.025
1.525±0.185**
25.7
1.075±0.048**
58.9
9.00
0.025
0.450±0.184**
, 百拇医药 7.6
0.725±0.160**
39.7
与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
加热疗法是恶性肿瘤的重要治疗手段之一。但热应激能诱导热休克蛋白(HSP)的合成，它一方面能提高细胞对高温应激的能力，另一方面可促使细胞热损伤的修复，因而产生耐热细胞和热耐受现象[1,2]。热耐受是近几年热生物学的研究重点之一，它不仅降低肿瘤细胞对再次加热的敏感性而影响热疗效果，而且影响到分次放疗和化疗的敏感性[3,4]。Overgaard[5]发现，先给小鼠耳部预热后再加热和放射，TER(热增比)值显著低于直接加热和放射所引起的损伤。这意味着加热的放射增敏作用降低。以前多认为这可能是生理学改变的结果，而非细胞自身抗拒的特异性[6]。本研究亦表明，加热诱导产生的耐热细胞的放射敏感性远低于非耐热的K562细胞株。说明肿瘤患者在热疗期间，一旦产生耐热性，病灶对放射线的敏感性也可能下降。提示热耐受引起的放射敏感性改变可能是加热诱导产生的耐热亚群的特性所致，而耐热细胞抗拒放射的机制尚不明了。细胞的热耐受性和耐药性间的关系，随药物种类而异。细胞对烷化剂和热疗不显示交叉耐受性，而对阿霉素呈单向交叉耐受性[7]。Li等观察到耐阿霉素细胞对放射和加热不显示交叉耐受性，而热耐受细胞都对阿霉素有交叉耐药性。本研究发现，耐热细胞对5-Fu的敏感性亦下降。故热耐受、耐药性及放射抗性的关系有待进一步探讨。
, 百拇医药
许多文献报道5-Fu联合放疗对肿瘤的杀伤具有协同作用。本实验结果表明，5-Fu联合不同剂量的照射确有部分相加作用。但5-Fu联合照射对K562耐热细胞的影响,与单纯照射组相比，其存活率与正常对照组相比无明显差异。这可能与耐热细胞的耐药性及放射抗性有关。为此，Field建议，对待热耐受的最好办法是避免它。因而临床热疗中，必须采用合理的序贯和递降加温以设法避开或减弱肿瘤的热耐受期[8]。有别于其它细胞，耐热细胞核质与胞浆中均存在HSP，它能保护性地抑制蛋白质的变性。Mitomycin、Benzal dehyde及Hydralazine能阻断或抑制HSP的合成进而抑制热耐受的发生和发展，并已开始试用于临床。故这些抑制剂也可能会提高加热化疗和放疗对恶性肿瘤的疗效。
*苏州医学院附属第一医院科研基金资助课题
参考文献
1 Welch WJ,Mizzen LA. Characterization of the thermotolerant cells Ⅱ:Effect on the intracellular distribution of heat shock protein. J Cell Biol, 1988,106∶1117
, 百拇医药
2 Chang WS. Effect of local hyperthemia on blood flow and microenvirome nt. Int J Radiation Oncol Biol, Phys, 1994,30∶133
3 Lyons JC,Griffin RS. Enhancement of hyperthemia effect in vivo by ami loride and DIDS. Cancer Res, 1993,53∶1599
4 Kim LM. Cell cycle-dependent association of HSP 70 with specific cell ular proteins. J Cell Biol,1989,108∶413
5 Overgaard J. Fractionated radiation and hyperthemia:experimental and clinical studies. Cancer,1981,48∶1116
, 百拇医药
6 林世寅,李瑞英，主编. 现代肿瘤热疗学.北京∶学苑出版社,1996∶55～64
7 Nishiue T. Studies on combination of hyperthemia and chemotherapy for cancer.In∶Sagahara T,Saito M,eds. Hyperthermia Oncology.Tucson∶Arizona Board of Regent,1989∶204～206
8 Field SB,Franconi C. Physics and Technology of Hyperthermia. Martinus ∶Nijhoff Publishers,1987:19～21
(1999年7月7日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院附属第一医院放疗科，苏州，215006
关键词：耐热细胞；人红白血病细胞株；5-氟脲嘧啶；放射敏感性
苏州医学院学报991206 摘要 目的 研究60Coγ射线对K562细胞及其耐热亚群的杀伤作用。方法 先诱导产生K562细胞耐热亚群，然后应用不同剂量60Coγ射线照射和5-Fu对K562细胞株及其耐热亚群的放射敏感性进行测定。结果 K562细胞耐热亚群对射线照射和5-Fu具有一定程度的耐受性;5-Fu联合不同剂量的照射有部分的相加作用。结论 K562细胞热耐受性、耐药性及放射抗性之间有一定的必然联系。提示在临床热疗工作中，必须采用合理的序贯和递降加温以设法避开或减弱肿瘤的热耐受期。
, 百拇医药
中图法分类 R730.5
The Response of K562 and Its Thermotolerant Cells to 60Coγ-Ray Irradiation
Zhang Junning，Xu Changshao
(The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou,21 5006)
Abstract Objective To study the relationship between thermoto lerance and radiosensitivity of K562 Cells. Methods K 562 thermotolerant cells were induced at first,then the radiosensitivity of K 562 thermotolerant cells were measured.Results The radio sensitivity of K562 thermotolerant cells as well as its drug cytot oxicity was lower than that of K562 cells;and there were additional effect s of 5-Fu on radiosensitivity.Conclusion Correlation exists among thermotolerance,radioresistance and drug-resistance .The work demonstrates that it is essential to avoid thermotolerance stages in clinical practice.
, 百拇医药
Key words thermotolerant cells； K562 cell； 5-Fu； radiosensitivity
肿瘤患者在热疗过程中，肿瘤细胞常产生耐热性，但耐热肿瘤细胞对放射的敏感性是否也相应地发生变化，目前有关报道不多。我们利用本科诱导的K562细胞耐热亚群，测定其耐热与非耐热细胞的放射敏感性。
1 材料和方法
1.1 细胞系：K562(人红白血病细胞株)引自本院微生物学教研室；耐热亚群的诱导：将含有1×105/mlK562细胞的培养瓶放置41℃水浴箱中30min，再放回37℃CO2培养箱中8h，然后再置于45℃水浴箱中20min。
1.2 试剂：5-Fu，0.025g/ml,山东济宁制药厂产品。RPMI1640和小牛血清均为华美公司产品。
, 百拇医药
1.3 细胞培养：取对数生长期的细胞，配成1×105/ml细胞悬液，4.5ml/培养瓶，半贴壁培养。培养液为含20%小牛血清的RPMI1640，在37℃饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。
1.4 照射：取上述细胞悬液，用60Coγ射线均匀照射，球靶距离70cm,照射剂量分别为0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0Gy,剂量率为90.3cGy/min，每组1瓶。照射后与未照射对照组立即将细胞转入16孔培养板，每组4孔，每孔1.0ml,含1×105/ml细胞,继续培养48h,0.02%胰酶消化后计数活细胞。
1.5 5-Fu及5-Fu加照射对K562(非耐热细胞)、K562耐热亚群生长的影响：取对数生长期的K562和K562耐热亚群,细胞浓度为1×105/ml,培养液中含5-Fu0.025g/ml,分为空白对照组、5-Fu组、5-Fu加照射组(照射剂量分别为0.25、0.5、1.0、3.0、6.0、9.0Gy),照射后培养与计数条件同前。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 K562和K562耐热亚群的放射敏感性：见表1。由表1可见，K562和K562耐热亚群对γ射线照射有明显的剂量依赖性。
表1 60Coγ射线照射对K562及K562耐热亚群存活率的影响(
±s) 照射剂量(Gy)
K562
K562耐热亚群
细胞数×105
, 百拇医药
存活率(%)
细胞数×105
存活率(%)
对照组
5.685±0.256
100.0
1.950±0.149
100.0
0.5
4.500±0.513
79.2
1.725±0.111
, 百拇医药
88.5
1.0
3.875±0.366**
68.2
1.713±0.103
87.8
3.0
2.838±0.293**
49.9
1.663±0.018
85.5
6.0
, 百拇医药
1.988±0.157**
35.0
1.338±0.075**
68.6
9.0
1.667±0.080**
29.3
1.088±0.035**
55.8
**与对照组相比，P<0.01
2.2 5-Fu及5-Fu加照射对K562、K562耐热亚群生长的影响：单独用5-Fu时,K562细胞存活率为正常对照组的62.87%,细胞数为(3.725±0.155)×105；5-Fu联合不同剂量照射组与表1各照射组相比,细胞存活率的下降呈现有部分的相加现象(见表2)。单独用5-Fu时，K562耐热亚群存活率与正常对照组相比无明显差异,细胞数为(1.575±0.197)×105(P>0.05)；5-Fu联合照射对K562耐热亚群的影响,与表1各照射组相比,其存活率与对照组无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表2 照射和5-Fu对K562及K562耐热细胞存活率的影响(
±s) 照射剂量(Gy)
5-Fu
(mg)
K562
K562耐热亚群
细胞数×105
存活率(%)
细胞数×105
, 百拇医药
存活率(%)
对照组
0.000
5.925±0.536
100.0
1.825±0.216
100.0
0.00
0.025
3.725±0.155**
62.9
1.575±0.197
, 百拇医药
86.3
0.25
0.025
3.950±0.105*
66.7
1.575±0.131
86.3
0.50
0.025
3.500±0.082**
59.1
1.525±0.025*
, http://www.100md.com
83.6
1.00
0.025
2.600±0.216*
43.9
1.450±0.087*
79.5
3.00
0.025
1.950±0.171**
32.9
, http://www.100md.com 1.400±0.135
76.7
6.00
0.025
1.525±0.185**
25.7
1.075±0.048**
58.9
9.00
0.025
0.450±0.184**
, 百拇医药 7.6
0.725±0.160**
39.7
与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
3 讨论
加热疗法是恶性肿瘤的重要治疗手段之一。但热应激能诱导热休克蛋白(HSP)的合成，它一方面能提高细胞对高温应激的能力，另一方面可促使细胞热损伤的修复，因而产生耐热细胞和热耐受现象[1,2]。热耐受是近几年热生物学的研究重点之一，它不仅降低肿瘤细胞对再次加热的敏感性而影响热疗效果，而且影响到分次放疗和化疗的敏感性[3,4]。Overgaard[5]发现，先给小鼠耳部预热后再加热和放射，TER(热增比)值显著低于直接加热和放射所引起的损伤。这意味着加热的放射增敏作用降低。以前多认为这可能是生理学改变的结果，而非细胞自身抗拒的特异性[6]。本研究亦表明，加热诱导产生的耐热细胞的放射敏感性远低于非耐热的K562细胞株。说明肿瘤患者在热疗期间，一旦产生耐热性，病灶对放射线的敏感性也可能下降。提示热耐受引起的放射敏感性改变可能是加热诱导产生的耐热亚群的特性所致，而耐热细胞抗拒放射的机制尚不明了。细胞的热耐受性和耐药性间的关系，随药物种类而异。细胞对烷化剂和热疗不显示交叉耐受性，而对阿霉素呈单向交叉耐受性[7]。Li等观察到耐阿霉素细胞对放射和加热不显示交叉耐受性，而热耐受细胞都对阿霉素有交叉耐药性。本研究发现，耐热细胞对5-Fu的敏感性亦下降。故热耐受、耐药性及放射抗性的关系有待进一步探讨。
, 百拇医药
许多文献报道5-Fu联合放疗对肿瘤的杀伤具有协同作用。本实验结果表明，5-Fu联合不同剂量的照射确有部分相加作用。但5-Fu联合照射对K562耐热细胞的影响,与单纯照射组相比，其存活率与正常对照组相比无明显差异。这可能与耐热细胞的耐药性及放射抗性有关。为此，Field建议，对待热耐受的最好办法是避免它。因而临床热疗中，必须采用合理的序贯和递降加温以设法避开或减弱肿瘤的热耐受期[8]。有别于其它细胞，耐热细胞核质与胞浆中均存在HSP，它能保护性地抑制蛋白质的变性。Mitomycin、Benzal dehyde及Hydralazine能阻断或抑制HSP的合成进而抑制热耐受的发生和发展，并已开始试用于临床。故这些抑制剂也可能会提高加热化疗和放疗对恶性肿瘤的疗效。
*苏州医学院附属第一医院科研基金资助课题
参考文献
1 Welch WJ,Mizzen LA. Characterization of the thermotolerant cells Ⅱ:Effect on the intracellular distribution of heat shock protein. J Cell Biol, 1988,106∶1117
, 百拇医药
2 Chang WS. Effect of local hyperthemia on blood flow and microenvirome nt. Int J Radiation Oncol Biol, Phys, 1994,30∶133
3 Lyons JC,Griffin RS. Enhancement of hyperthemia effect in vivo by ami loride and DIDS. Cancer Res, 1993,53∶1599
4 Kim LM. Cell cycle-dependent association of HSP 70 with specific cell ular proteins. J Cell Biol,1989,108∶413
5 Overgaard J. Fractionated radiation and hyperthemia:experimental and clinical studies. Cancer,1981,48∶1116
, 百拇医药
6 林世寅,李瑞英，主编. 现代肿瘤热疗学.北京∶学苑出版社,1996∶55～64
7 Nishiue T. Studies on combination of hyperthemia and chemotherapy for cancer.In∶Sagahara T,Saito M,eds. Hyperthermia Oncology.Tucson∶Arizona Board of Regent,1989∶204～206
8 Field SB,Franconi C. Physics and Technology of Hyperthermia. Martinus ∶Nijhoff Publishers,1987:19～21
(1999年7月7日收稿), 百拇医药