PDGF对培养内皮细胞增殖的影响
作者：夏豪 李建军 李庚山 尹丽娅 王晶 李晓艳
单位：湖北医科大学附属第一医院，430060，心内科
关键词：血小板源性生长因子；内皮细胞；细胞周期；免疫组织化学；氚-亮氨酸掺入实验
心肺血管病杂志000317
摘要 观察血小板源性生长因子(PDGF)对于培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，为血管再生性治疗的靶基因选择提供线索。用流式细胞仪分析细胞周期各时相分布，氚-亮氨酸(3H-Leu)掺入实验评价蛋白质合成，免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)水平。结果不同浓度PDGF均可加速内皮细胞由G1期→S期的转换，使细胞进入G2/M期，增加培养细胞3H-Leu掺入量及PCNA水平；但PDGF浓度为5ng时与对照组相比，作用不显著。PDGF能够促进二维培养内皮细胞增生，具有促血管再生作用。
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The Effect of Platelet Derived Growth Factor on the Proliferation of Culture Endothelial Cell
Xia Hao,Li Jianjun,Li Gengshan,et al.
(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of
HuBei Medical University,Wuhan observe，430060)
Abstract Objective The aims of our studies was to disclose whether platelet derived growth factor could facilitate the proliferation of culture endothelial cell.Methods The proliferation of HUVEC under normal condition was assayed as followed:cell cycle detected by flow cytometry,protein synthesis by observed 3H-Leucine corporation,proliferating cell nuclear antigen (PCNA) by immunohistochemistry.Result HUVEC transform from G1 phase to S phase can be accelerated by PDGF,the 3H-Leucine corporation and PCNA level of HUVEC can be increased,it was showed dose dependent.The PDGF of 5ng/ml was ineffective and the effect become stronger as the dose increase.Conclusion The present can be accelerated by PDGF,series of studies suggested that HUVEC proliferation can be accelerated by PDGF.
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Key words：PDGF; Endothelial cell; Cell cycle; Lmmunohistochemistry; 3H-Leucine corporation
血管再生性手段是治疗缺血性疾病的新思路。现已证实：多种生长因子对新生血管形成有调节作用，内皮细胞的增殖是血管再生的关键环节。本研究将应用多项反映细胞增殖实验，观察血小板源性生长因子(PDGF)对于培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，为血管再生性治疗的靶基因选择提供线索。
材料与方法
1.试剂和仪器 人脐静脉内皮细胞(ECV304)株由武汉大学典型物种保存中心提供。DMEM/F12培养基、FBS为美国Gibco公司产品，胰蛋白酶为美国Difico公司产品，DMSO为美国Serva公司产品。PDGF-BB，RNA酶(RNAase)，碘化吡啶及增殖细胞核抗原(PCNA)抗血清均为美国Sigma公司产品。氚-亮氨酸(3H-Leu)为中国原子能科学研究院产品。链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒为武汉博士德生物有限公司产品。主要实验仪器包括超净工作台，CO2培养箱，液体闪烁分析仪(美国Packard公司)，全自动图像处理系统(日本IBAS型)，流式细胞分析仪(FACSort，美固BD公司)。
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2.实验方法(1)流式细胞仪分析 生长良好的HUVEC悬液(2×104个/ml)接种于50ml培养瓶，其中放置1×0.5cm2的盖玻片，加入生长培养液(90%DMEM/F12+10%FBS)，37℃，5%CO2培养至融合状态(接种后24h)，维持液(98%DMEM/F12+2%FBS)洗脱3次，培养48h使细胞趋于静止(G0/G1期)。常规、低氧或不同浓度PDGF条件继续培养，24h后收样，取出盖玻片，弃上清，胰蛋白酶消化，离心10min，PBS洗涤，70%乙醇固定，4℃过夜保存。各组细胞染色前，离心去除出固定液，PBS洗涤，加入200μl RNAase (1mg/ml)，37℃水浴30min，加入800μl磺化丙碇染色液(100μg/ml)，混匀，置于4℃下，避光染色30min～1h，流式细胞仪检测。(2)3H-Leu掺入实验 3H-Leu掺入实验参照Michiels等[1]介绍的方法。HUVEC的接种密度，G0期的调整及干预方式同上述细胞周期的研究方法。所不同的是培养细胞选用培养板，加入PDGF继续培养24h，于收样前2h每孔内加入3H-Leu(1luCi/ml)，弃去含3H-Leu悬液，PBS快速洗涤3次，除去游离的3H-Leu，加入200μl 0.1N氢氧化钠，室温静置过夜，液体闪烁分析仪上测定各样本的放射强度(cpm)。(3)PDGF对HUVEC PCNA表达的影响 从上述培养瓶中取出盖玻片，PBS洗过后，丙酮固定15min，再用PBS洗2次。免疫组织化学检查方法参照试剂盒说明书进行：TBS溶液20～37℃处理盖玻片2h，3%H2O2室温下处理5～10min，蒸馏水洗2min×3次，滴加封闭液，室温10MIN，甩去多余液体，滴加适当稀释的鼠抗PCNA抗体，作用20～37℃ 1～2 h，0.01M PBS洗2min×3次。滴加羊抗鼠抗体，作用20～37℃ 20min，0.01M PBS洗2min×3次，滴加试剂SABC，作用20～37℃ 20min，0.01M PBS洗5min×4次。DAB显色，蒸馏水洗涤。封片、照相，计算机扫描，测定平均光密度(OPTDM)。
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3.统计学处理 所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，两两样本均数比较用t检验。
结 果
1.PDGF对HUVEC细胞周期的影响 用碘化丙碇染色液染色和流式细胞仪分析细胞周期时相分布(表1)发现：低浓度的PDGF(5ng/ml)不影响HUVEC细胞周期时相分布(P>0.05)；较大浓度的PDGF(10、20ng/ml)可使停留于静止期(G0)/DNA合成前期(G1期)HUVEC细胞数减少，而进入DNA合成期(S期)及DNA合成后期(G2期)/分裂期(M期)的细胞数目增多，增殖指数(PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M))与对照组相比明显增加(P<0.001)，PDGF浓度为20ng/ml时对细胞周期时相分布的影响显著大于PDGF浓度为10ng/ml PDGF(P<0.01)。提示大剂量PDGF可加速HUVEC由G1期→S期的转换，使细胞进入G2/M期，从而促进HUVEC的增殖，小剂量无此作用。
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表1 PDGF对培养HUVEC细胞周期的影响(±s,n=5) 组别
G0/G1(%)
S(%)
G2/M(%)
PI(%)
Control
80.52±6.20
10.67±0.80
8.81±0.40
19.48±1.21
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PDGF(5ng/ml)
79.27±5.12*
10.79±0.18*
9.94±0.21*
19.48±1.21*
PDGF(10ng/ml)
70.28±0.62**
16.94±0.23**
12.78±0.13**
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29.72±1.78**
PDGF(20ng/ml)
64.04±0.45**#
20.30±0.21**#
15.66±0.18**#
35.96±0.31**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/mL,#P<0.01 2.PDGF对HUVEC 3H-Leu掺入量的影响 液体闪烁计数测定培养HUVEC 3H-Leu掺入量(表2)发现：不同浓度PDGF均可增加培养细胞3H-Leu掺入量，但PDGF浓度为5ng时与对照组相比，培养HUVEC3H-Leu掺入量无显著性差异(P>0.05)；PDGF浓度为10ng、20ng时可显著增加培养HUVEC3H-Leu掺入量(P<0.001)，剂量越大，掺入量越大(P<0.01)。3H-Leu掺入量是直接反映细胞蛋白质合成旺盛与否，间接反映细胞是否增生的指标，大剂量PDGF可显著增加细胞3H-Leu的掺入量，说明其具有促进培养HUVEC蛋白质合成，细胞增生的作用。
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表2 PDGF对培养HUVEC3H-Leu
掺入量的影响(±s,n=5) 组别
3H-Leu掺入量(cpm)
Control
3255±267
PDGF(5ng/ml)
3435±172*
PDGF(10ng/ml)
9074±678**
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PDGF(20ng/ml)
11591±896**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/ml,#P<0.01
图1A 免疫组织化学检测PCNA阳性
部位呈棕黄色，胞核为主(对照组×40)
图1B 免疫组织化学检测PCNA阳性
部位呈棕黄色，胞核为主(PDGF组×40)
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3.PDGF对HUVEC PCNA表达的影响 免疫组织化学检测的培养HUVEC PCNA阳性部位呈棕黄色，胞核为主(图1)。图像处理系统测定培养HUVEC平均光密度(表3)显示：低浓度PDGF(5ng)对培养HUVEC平均光密度值无明显影响(P>0.05)；高浓度PDGF(10ng、20ng)能显著增加培养HUVEC平均光密度值(P<0.001)，PDGF剂量越大，光密度值越大(P<0.001)。由于光密度值与培养HUVEC PCNA水平高低成正比，数值越大，代表细胞增殖越旺盛，大剂量PDGF可显著增加细胞平均光密度，说明其能促进培养HUVEC的增生。
表3 PDGF对培养HUVEC PCNA
表达的影响(±s,n=5) 组别
平均光密度(OPTDM)
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Control
0.160187±0.014693
PDGF(5ng/ml)
0.161348±0.0118551*
PDGF(10ng/ml)
0.203309±0.011643**
PDGF(20ng/ml)
0.281072±0.023743**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/ml,#P<0.001讨 论
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PDGF具有促血管再生作用，在损伤修复、AS和肿瘤形成以及中枢神经系统发育中起重要作用[1]；PDGF在培养内皮细胞增殖中的作用存在许多不一致的报道。
一般认为PDGF可以通过不同方式作用于特异的内皮细胞如微血管来源的内皮细胞，刺激其增生；对大血管来源的内皮细胞有无促增生作用意见不一[8]。如Liu及他的同事[3]报道a(b)FGF、VEGF能刺激绒毛膜毛细血管内皮细胞生长，并呈剂量依赖性，单纯PDGF(0.4～10ng/ml)，IGF(0.4～10ng/ml)及胰岛素(0.4～10mg/ml)无此效应，但在胰岛素存在下(10mg/ml)，PDGF可呈剂量依赖性刺激绒毛膜毛细血管内皮细胞生长。Bar等发现PDGF能促进牛主动脉和肺动脉微血管内皮细胞DNA合成、糖及氨基酸的摄取。Thommen等[4]研究了PDGF在能自然形成索状结构的牛主动脉内皮细胞中的作用，结果发现这种内皮细胞在PDGF的刺激下可发生增生。Doss等[5]发现PDGF不能刺激视网膜内皮增生。Yano等[6]报道脂蛋白a(Lpa)可以刺激培养HUVEC增殖，除抗FGF-2抗体外，抗PDGF及IL-1抗体对此反应均无拮抗作用，据此，作者认为PDGF不影响HUVEC增殖过程。Battegay等[7]发现PDGF-BB抗体可以抑制内皮细胞索状结构的形成(37±10%)，PDGF-AA抗体无此作用；PDGF-BB能增加索状结构内皮细胞DNA合成。
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本实验通过对培养HUVEC细胞周期各时相分布发现大剂量PDGF-BB可刺激HUVEC从G0期至G1期的转换，阻止细胞进入静止状态，使停留于G0/G1期细胞数减少，G2/M期细胞数增多。通过3H-Leu掺入量实验证实大剂量PDGF能诱导HUVEC蛋白质合成。PCNA的表达是细胞增殖的一个重要环节，各种刺激因素作用于内皮细胞时，可通过不同的途径诱导内皮细胞增殖，但必须通过PCNA的表达这一中间环节，它是细胞增殖的必经之路。本实验通过高敏感性，低背景和操作简便的SABC免疫组织化学法证实大剂量PDGF能促进HUVEC PCNA的表达。低剂量的PDGF对HUVEC细胞周期、3H-Leu掺入量及PCNA的表达均无影响。研究结果说明PDGF能刺激培养HUVEC增生，但呈现明显剂量依赖性，小剂量无作用，剂量越大，作用越明显。
依据文献报道，结合本实验发现，作者认为PDGF对培养内皮细胞有无丝裂源作用取决于内皮细胞的来源、PDGF剂量大小、同分异构体类型等综合因素。
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近年对于PDGF受体的大量研究已经发现无论是微血管内皮细胞、还是大血管内皮细胞表面均存在PDGF-α和β受体，因此具有接受PDGF刺激的功能。早在1991年Beitz等[8]对人视网膜脂肪组织微血管内皮细胞研究发现：在培养基中加入PDGF可检测到分子量为180-kDa的糖蛋白，这种糖蛋白的产生是PDGF刺激引起的酪氨酸磷酸化的结果；进一步研究证实每个微血管内皮细胞有30 000个PDGF受体。Ling等[9]报道血管瘤毛细血管内皮细胞可表达PDGF-α和β受体。Eriksson及Thommen等[4，10]报道猪主动脉内皮细胞可表达PDGF-α和β受体。Holmgren等[11]报道三期胎盘微毛细血管内皮细胞可表达PDGF-B和PDGF-β受体基因，大血管内皮表达高水平的PDGF-B，但检测不到PDGF-β受体mRNA。Battegay等[7]报道能自发形成索状结构的内皮细胞PDGF-β受体水平上升；与非血管形成内皮细胞相比，血管形成内皮细胞未表达PDGF-BB；非索状结构内皮细胞无PDGF-β受体mRNA及其蛋白的表达；索状结构和非索状结构内皮细胞均无PDGF-α受体mRNA。遗憾的是本实验未涉及有关PDGF受体的相关研究。
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湖北省九五攻关项目“冠心病的临床研究”(项目号9629110)
参考文献
1，Michieils C，Leener FD,Arnould T,et al.Hypoxia stimulates human endothelial cells to release smooth muscle cell mitogens:role of prostaglandins and bFGF.Exp Cell Res,1994,213:43～45.
2，Gajdusek C,Luo Z,Mayberg M.Basic fibroblast growth and transforming growth factor beta-1:synergistic mediators of angiogenesin in vitro.J Cellul Physiol,1993,157,133～144.
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3，Liu X,Ye X,Yanoff M,et al.Regulatory effects of soluble growth factors on choriocapillaris endothelial growth and survival.Ophthalmic Res,1998,30:302～313.
4，Thommen R,Humar R,Misevic G,et al.PDGF-BB increases endothelial migration on cord movements during angiogenesis in vitro,J Cell Biochem,1997,64:403～413.
5，Dosso AA,Brooks RA,Beltramo E,et al.A study of the effects of human blood derivatives and individual growth factors on [3H]thymidine uptake in bovine retinal pericytes and endothelial cells.Acta Diabetol,1993,30:207～213.
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6，Yano Y,Seishima M,Tokoro Y,et al.Stimulatory effects of lipoprotein(a) and low-density lipoprotein on human umbilical vein endothelial cell migration and proliferation are partially mediated by fibroblast growth factor-2.Biochim Biophys Acta,1998,1393:26～34.
7，Battegay EJ,Rupp J,lruela L,et al.PDGF-BB modulates endothelial proliferation and angiogenesis in vitro via PDGF beta-receptors.J Cell Biol,1994,125:917～928.
8，Beitz JG,Kim IS,Calabresi P,et al.Human microvascular endothelial cells express receptors for platelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88:2021～2025.
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9，Ling T,Hatva E,Kujala M,et al.Expression of growth factors and growth factor receptors in capillary hemangioblastoma.J Neuropathol Exp Neurol,1996,55:522～527.
10，Eriksson A,Siegbahn A,Westermark B,et al.PDGF alpha- and beta-receptors activate unique and common signal transduction pathways.EMBO J,1992,11:543～550.
11，Holmgren L,Glaser A,Pfeifer-Ohlsson S,et al.Angiogenesis during human extraembryonic development involves the spatiotemporal control of PDGF ligand and receptor,gene expression.Development,1991,113:749～754.
1999-07-19收稿，2000-04-12修回, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第一医院，430060，心内科
关键词：血小板源性生长因子；内皮细胞；细胞周期；免疫组织化学；氚-亮氨酸掺入实验
心肺血管病杂志000317
摘要 观察血小板源性生长因子(PDGF)对于培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，为血管再生性治疗的靶基因选择提供线索。用流式细胞仪分析细胞周期各时相分布，氚-亮氨酸(3H-Leu)掺入实验评价蛋白质合成，免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)水平。结果不同浓度PDGF均可加速内皮细胞由G1期→S期的转换，使细胞进入G2/M期，增加培养细胞3H-Leu掺入量及PCNA水平；但PDGF浓度为5ng时与对照组相比，作用不显著。PDGF能够促进二维培养内皮细胞增生，具有促血管再生作用。
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The Effect of Platelet Derived Growth Factor on the Proliferation of Culture Endothelial Cell
Xia Hao,Li Jianjun,Li Gengshan,et al.
(Department of Cardiology,The Affiliated Hospital of
HuBei Medical University,Wuhan observe，430060)
Abstract Objective The aims of our studies was to disclose whether platelet derived growth factor could facilitate the proliferation of culture endothelial cell.Methods The proliferation of HUVEC under normal condition was assayed as followed:cell cycle detected by flow cytometry,protein synthesis by observed 3H-Leucine corporation,proliferating cell nuclear antigen (PCNA) by immunohistochemistry.Result HUVEC transform from G1 phase to S phase can be accelerated by PDGF,the 3H-Leucine corporation and PCNA level of HUVEC can be increased,it was showed dose dependent.The PDGF of 5ng/ml was ineffective and the effect become stronger as the dose increase.Conclusion The present can be accelerated by PDGF,series of studies suggested that HUVEC proliferation can be accelerated by PDGF.
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Key words：PDGF; Endothelial cell; Cell cycle; Lmmunohistochemistry; 3H-Leucine corporation
血管再生性手段是治疗缺血性疾病的新思路。现已证实：多种生长因子对新生血管形成有调节作用，内皮细胞的增殖是血管再生的关键环节。本研究将应用多项反映细胞增殖实验，观察血小板源性生长因子(PDGF)对于培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响，为血管再生性治疗的靶基因选择提供线索。
材料与方法
1.试剂和仪器 人脐静脉内皮细胞(ECV304)株由武汉大学典型物种保存中心提供。DMEM/F12培养基、FBS为美国Gibco公司产品，胰蛋白酶为美国Difico公司产品，DMSO为美国Serva公司产品。PDGF-BB，RNA酶(RNAase)，碘化吡啶及增殖细胞核抗原(PCNA)抗血清均为美国Sigma公司产品。氚-亮氨酸(3H-Leu)为中国原子能科学研究院产品。链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒为武汉博士德生物有限公司产品。主要实验仪器包括超净工作台，CO2培养箱，液体闪烁分析仪(美国Packard公司)，全自动图像处理系统(日本IBAS型)，流式细胞分析仪(FACSort，美固BD公司)。
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2.实验方法(1)流式细胞仪分析 生长良好的HUVEC悬液(2×104个/ml)接种于50ml培养瓶，其中放置1×0.5cm2的盖玻片，加入生长培养液(90%DMEM/F12+10%FBS)，37℃，5%CO2培养至融合状态(接种后24h)，维持液(98%DMEM/F12+2%FBS)洗脱3次，培养48h使细胞趋于静止(G0/G1期)。常规、低氧或不同浓度PDGF条件继续培养，24h后收样，取出盖玻片，弃上清，胰蛋白酶消化，离心10min，PBS洗涤，70%乙醇固定，4℃过夜保存。各组细胞染色前，离心去除出固定液，PBS洗涤，加入200μl RNAase (1mg/ml)，37℃水浴30min，加入800μl磺化丙碇染色液(100μg/ml)，混匀，置于4℃下，避光染色30min～1h，流式细胞仪检测。(2)3H-Leu掺入实验 3H-Leu掺入实验参照Michiels等[1]介绍的方法。HUVEC的接种密度，G0期的调整及干预方式同上述细胞周期的研究方法。所不同的是培养细胞选用培养板，加入PDGF继续培养24h，于收样前2h每孔内加入3H-Leu(1luCi/ml)，弃去含3H-Leu悬液，PBS快速洗涤3次，除去游离的3H-Leu，加入200μl 0.1N氢氧化钠，室温静置过夜，液体闪烁分析仪上测定各样本的放射强度(cpm)。(3)PDGF对HUVEC PCNA表达的影响 从上述培养瓶中取出盖玻片，PBS洗过后，丙酮固定15min，再用PBS洗2次。免疫组织化学检查方法参照试剂盒说明书进行：TBS溶液20～37℃处理盖玻片2h，3%H2O2室温下处理5～10min，蒸馏水洗2min×3次，滴加封闭液，室温10MIN，甩去多余液体，滴加适当稀释的鼠抗PCNA抗体，作用20～37℃ 1～2 h，0.01M PBS洗2min×3次。滴加羊抗鼠抗体，作用20～37℃ 20min，0.01M PBS洗2min×3次，滴加试剂SABC，作用20～37℃ 20min，0.01M PBS洗5min×4次。DAB显色，蒸馏水洗涤。封片、照相，计算机扫描，测定平均光密度(OPTDM)。
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3.统计学处理 所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，两两样本均数比较用t检验。结 果
1.PDGF对HUVEC细胞周期的影响 用碘化丙碇染色液染色和流式细胞仪分析细胞周期时相分布(表1)发现：低浓度的PDGF(5ng/ml)不影响HUVEC细胞周期时相分布(P>0.05)；较大浓度的PDGF(10、20ng/ml)可使停留于静止期(G0)/DNA合成前期(G1期)HUVEC细胞数减少，而进入DNA合成期(S期)及DNA合成后期(G2期)/分裂期(M期)的细胞数目增多，增殖指数(PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M))与对照组相比明显增加(P<0.001)，PDGF浓度为20ng/ml时对细胞周期时相分布的影响显著大于PDGF浓度为10ng/ml PDGF(P<0.01)。提示大剂量PDGF可加速HUVEC由G1期→S期的转换，使细胞进入G2/M期，从而促进HUVEC的增殖，小剂量无此作用。
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表1 PDGF对培养HUVEC细胞周期的影响(
±s,n=5) 组别G0/G1(%)
S(%)
G2/M(%)
PI(%)
Control
80.52±6.20
10.67±0.80
8.81±0.40
19.48±1.21
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PDGF(5ng/ml)
79.27±5.12*
10.79±0.18*
9.94±0.21*
19.48±1.21*
PDGF(10ng/ml)
70.28±0.62**
16.94±0.23**
12.78±0.13**
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29.72±1.78**
PDGF(20ng/ml)
64.04±0.45**#
20.30±0.21**#
15.66±0.18**#
35.96±0.31**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/mL,#P<0.01 2.PDGF对HUVEC 3H-Leu掺入量的影响 液体闪烁计数测定培养HUVEC 3H-Leu掺入量(表2)发现：不同浓度PDGF均可增加培养细胞3H-Leu掺入量，但PDGF浓度为5ng时与对照组相比，培养HUVEC3H-Leu掺入量无显著性差异(P>0.05)；PDGF浓度为10ng、20ng时可显著增加培养HUVEC3H-Leu掺入量(P<0.001)，剂量越大，掺入量越大(P<0.01)。3H-Leu掺入量是直接反映细胞蛋白质合成旺盛与否，间接反映细胞是否增生的指标，大剂量PDGF可显著增加细胞3H-Leu的掺入量，说明其具有促进培养HUVEC蛋白质合成，细胞增生的作用。
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表2 PDGF对培养HUVEC3H-Leu
掺入量的影响(
±s,n=5) 组别3H-Leu掺入量(cpm)
Control
3255±267
PDGF(5ng/ml)
3435±172*
PDGF(10ng/ml)
9074±678**
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PDGF(20ng/ml)
11591±896**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/ml,#P<0.01
图1A 免疫组织化学检测PCNA阳性
部位呈棕黄色，胞核为主(对照组×40)
图1B 免疫组织化学检测PCNA阳性
部位呈棕黄色，胞核为主(PDGF组×40)
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3.PDGF对HUVEC PCNA表达的影响 免疫组织化学检测的培养HUVEC PCNA阳性部位呈棕黄色，胞核为主(图1)。图像处理系统测定培养HUVEC平均光密度(表3)显示：低浓度PDGF(5ng)对培养HUVEC平均光密度值无明显影响(P>0.05)；高浓度PDGF(10ng、20ng)能显著增加培养HUVEC平均光密度值(P<0.001)，PDGF剂量越大，光密度值越大(P<0.001)。由于光密度值与培养HUVEC PCNA水平高低成正比，数值越大，代表细胞增殖越旺盛，大剂量PDGF可显著增加细胞平均光密度，说明其能促进培养HUVEC的增生。
表3 PDGF对培养HUVEC PCNA
表达的影响(
±s,n=5) 组别平均光密度(OPTDM)
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Control
0.160187±0.014693
PDGF(5ng/ml)
0.161348±0.0118551*
PDGF(10ng/ml)
0.203309±0.011643**
PDGF(20ng/ml)
0.281072±0.023743**#
注：VS the control,*P>0.05,** P<0.001,VS PDGF 10ng/ml,#P<0.001讨 论
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PDGF具有促血管再生作用，在损伤修复、AS和肿瘤形成以及中枢神经系统发育中起重要作用[1]；PDGF在培养内皮细胞增殖中的作用存在许多不一致的报道。
一般认为PDGF可以通过不同方式作用于特异的内皮细胞如微血管来源的内皮细胞，刺激其增生；对大血管来源的内皮细胞有无促增生作用意见不一[8]。如Liu及他的同事[3]报道a(b)FGF、VEGF能刺激绒毛膜毛细血管内皮细胞生长，并呈剂量依赖性，单纯PDGF(0.4～10ng/ml)，IGF(0.4～10ng/ml)及胰岛素(0.4～10mg/ml)无此效应，但在胰岛素存在下(10mg/ml)，PDGF可呈剂量依赖性刺激绒毛膜毛细血管内皮细胞生长。Bar等发现PDGF能促进牛主动脉和肺动脉微血管内皮细胞DNA合成、糖及氨基酸的摄取。Thommen等[4]研究了PDGF在能自然形成索状结构的牛主动脉内皮细胞中的作用，结果发现这种内皮细胞在PDGF的刺激下可发生增生。Doss等[5]发现PDGF不能刺激视网膜内皮增生。Yano等[6]报道脂蛋白a(Lpa)可以刺激培养HUVEC增殖，除抗FGF-2抗体外，抗PDGF及IL-1抗体对此反应均无拮抗作用，据此，作者认为PDGF不影响HUVEC增殖过程。Battegay等[7]发现PDGF-BB抗体可以抑制内皮细胞索状结构的形成(37±10%)，PDGF-AA抗体无此作用；PDGF-BB能增加索状结构内皮细胞DNA合成。
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本实验通过对培养HUVEC细胞周期各时相分布发现大剂量PDGF-BB可刺激HUVEC从G0期至G1期的转换，阻止细胞进入静止状态，使停留于G0/G1期细胞数减少，G2/M期细胞数增多。通过3H-Leu掺入量实验证实大剂量PDGF能诱导HUVEC蛋白质合成。PCNA的表达是细胞增殖的一个重要环节，各种刺激因素作用于内皮细胞时，可通过不同的途径诱导内皮细胞增殖，但必须通过PCNA的表达这一中间环节，它是细胞增殖的必经之路。本实验通过高敏感性，低背景和操作简便的SABC免疫组织化学法证实大剂量PDGF能促进HUVEC PCNA的表达。低剂量的PDGF对HUVEC细胞周期、3H-Leu掺入量及PCNA的表达均无影响。研究结果说明PDGF能刺激培养HUVEC增生，但呈现明显剂量依赖性，小剂量无作用，剂量越大，作用越明显。
依据文献报道，结合本实验发现，作者认为PDGF对培养内皮细胞有无丝裂源作用取决于内皮细胞的来源、PDGF剂量大小、同分异构体类型等综合因素。
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近年对于PDGF受体的大量研究已经发现无论是微血管内皮细胞、还是大血管内皮细胞表面均存在PDGF-α和β受体，因此具有接受PDGF刺激的功能。早在1991年Beitz等[8]对人视网膜脂肪组织微血管内皮细胞研究发现：在培养基中加入PDGF可检测到分子量为180-kDa的糖蛋白，这种糖蛋白的产生是PDGF刺激引起的酪氨酸磷酸化的结果；进一步研究证实每个微血管内皮细胞有30 000个PDGF受体。Ling等[9]报道血管瘤毛细血管内皮细胞可表达PDGF-α和β受体。Eriksson及Thommen等[4，10]报道猪主动脉内皮细胞可表达PDGF-α和β受体。Holmgren等[11]报道三期胎盘微毛细血管内皮细胞可表达PDGF-B和PDGF-β受体基因，大血管内皮表达高水平的PDGF-B，但检测不到PDGF-β受体mRNA。Battegay等[7]报道能自发形成索状结构的内皮细胞PDGF-β受体水平上升；与非血管形成内皮细胞相比，血管形成内皮细胞未表达PDGF-BB；非索状结构内皮细胞无PDGF-β受体mRNA及其蛋白的表达；索状结构和非索状结构内皮细胞均无PDGF-α受体mRNA。遗憾的是本实验未涉及有关PDGF受体的相关研究。
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湖北省九五攻关项目“冠心病的临床研究”(项目号9629110)
参考文献
1，Michieils C，Leener FD,Arnould T,et al.Hypoxia stimulates human endothelial cells to release smooth muscle cell mitogens:role of prostaglandins and bFGF.Exp Cell Res,1994,213:43～45.
2，Gajdusek C,Luo Z,Mayberg M.Basic fibroblast growth and transforming growth factor beta-1:synergistic mediators of angiogenesin in vitro.J Cellul Physiol,1993,157,133～144.
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3，Liu X,Ye X,Yanoff M,et al.Regulatory effects of soluble growth factors on choriocapillaris endothelial growth and survival.Ophthalmic Res,1998,30:302～313.
4，Thommen R,Humar R,Misevic G,et al.PDGF-BB increases endothelial migration on cord movements during angiogenesis in vitro,J Cell Biochem,1997,64:403～413.
5，Dosso AA,Brooks RA,Beltramo E,et al.A study of the effects of human blood derivatives and individual growth factors on [3H]thymidine uptake in bovine retinal pericytes and endothelial cells.Acta Diabetol,1993,30:207～213.
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6，Yano Y,Seishima M,Tokoro Y,et al.Stimulatory effects of lipoprotein(a) and low-density lipoprotein on human umbilical vein endothelial cell migration and proliferation are partially mediated by fibroblast growth factor-2.Biochim Biophys Acta,1998,1393:26～34.
7，Battegay EJ,Rupp J,lruela L,et al.PDGF-BB modulates endothelial proliferation and angiogenesis in vitro via PDGF beta-receptors.J Cell Biol,1994,125:917～928.
8，Beitz JG,Kim IS,Calabresi P,et al.Human microvascular endothelial cells express receptors for platelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88:2021～2025.
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9，Ling T,Hatva E,Kujala M,et al.Expression of growth factors and growth factor receptors in capillary hemangioblastoma.J Neuropathol Exp Neurol,1996,55:522～527.
10，Eriksson A,Siegbahn A,Westermark B,et al.PDGF alpha- and beta-receptors activate unique and common signal transduction pathways.EMBO J,1992,11:543～550.
11，Holmgren L,Glaser A,Pfeifer-Ohlsson S,et al.Angiogenesis during human extraembryonic development involves the spatiotemporal control of PDGF ligand and receptor,gene expression.Development,1991,113:749～754.
1999-07-19收稿，2000-04-12修回, 百拇医药