Hodgkin病单个H/R-S细胞Ig基因重排的研究
作者：邓飞 李甘地 杨光华 吕广能
单位：
关键词：霍奇金病；基因重排；聚合酶链反应；Hodgkin/Reed-Sternberg细胞
中华病理学杂志980407 【摘要】 目的 探讨Hodgkin病(HD)Hodgkin/Reed-Sternberg(H/R-S)细胞的性质和来源。方法 从8例HD冰冻切片上共提取H/R-S细胞68个，用IgH通用引物FRⅢa/JH和κ、λ轻链家族性特异性引物行PCR检测。结果 1例淋巴细胞为主型(LP)HD的H/R-S细胞重复出现IgH和Vκ4家族重排；2例结节硬化型HD(NSHD)中，1例H/R-S细胞有单次的IgH、Vκ4和Vλ3重排；1例有重复的Vκ4重排，单次的IgH和Vκ2、4重排；5例混合细胞型(MC)HD中，1例有重复的IgH重排，单次的Vκ3和Vλ4重排；1例有重复的Vκ4重排，单次的Vλ3和IgH重排；2例有重复的IgH重排和单次的IgH重排；1例有重复的IgH和Vκ3重排，单次的Vλ2、4重排。结论 (1) LPHD的H/R-S细胞具有克隆性IgH和Vκ4基因重排，支持LPHD为B细胞克隆性增生的结论；(2) IgH和κ、λ基因重排的出现，提示NSHD和MCHD的H/R-S细胞来源于不同分化阶段的B细胞，可能为单克隆性，也有可能为寡克隆性增生。本研究的新颖之处在于：(1) 改进后的单个细胞PCR方法和Kppers等人的原方法相比较，能大幅度减少PCR的次数，节约试剂和时间；(2) 首次发现单个H/R-S细胞具有λ轻链基因重排。
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Hodgkin′s disease: Ig gene rearrangements in single H/R-s cells Deng Fei, Li Gandi, Yand Guang hua, et al. Department of Pathology, West China University of Medical Sciences, Chengdo 610041
【Abstract】 Objective To investigate the origin and cell lineage of Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S) cells from various subtypes of Hodgkin′s disease (HD). Methods 68 single H/R-S cells were taken from frozen section of 8 cases of HD. The DNA from these single cells was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with immunoglobulin heavy chain gene FRⅢa/JH primers and light chain family-specific primers. Results (1) IgH and Vκ4 rearrangements were repeatedly found in H/R-S cells from one case of lymphocytic predominant HD (LPHD). (2) Repeated and unique IgH and Vκ2,4 rearrangements were observed in 1 case of nodular sclerosing HD (NSHD) and unique IgH, Vλ3/Vκ4 rearrangements in another case of NSHD. (3) Repeated IgH/Vλ3 and unique Vλ2,4 rearrangements, repeated Vκ4 and unique IgH/Vκ3 rearrangements, plus repeated IgH and unique Vκ3/Vλ4 rearrangements were detected respectively in 3 cases of mixed cellularity HD (MCHD). Repeated and unique rearrangements were found respectively in 2 cases of MCHD. Conclusions The H/R-S cells isolated from LPHD had monoclonal Igh and Vκ4 gene rearrangements, which supports the conclusion that LPHD is a monoclonal proliferation of B cells. The appearance of IgH and κ,λ gene rearrangement suggest that the H/R-S cells isolated from classical HD (MCHD and NSHD) originate from B lineage cells at various stages of differentiation.
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【Key words】 Hodgkin′s disease Gene rearrangement Polymerase chain reaction Hodgkin/Reed-Sternberg cell
长期以来，Hodgkin病(HD)的肿瘤性成分Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S)细胞就一直引起病理学家的极大兴趣，但其性质和来源至今未有定论。造成这种情况的主要原因是H/R-S细胞在肿瘤组织中含量极少，H/R-S细胞识别标准难以统一，各种研究方法本身具有局限性。1994年，德国Kppers等[1]直接从组织切片上提取单个H/R-S细胞并发现有IgH和Vκ基因重排，提示这些细胞来源于B细胞，为阐明H/R-S细胞的性质作出了重要贡献。但他们没有进行λ轻链基因重排的研究。目前尚未看到有关H/R-细胞λ轻链基因重排的报道，也未见到HD的研究为何多涉及κ轻链而不涉及λ轻链的详细解释[2]。由于κ轻链和λ轻链基因重排在判断B细胞分化程度上有同等的重要性，所以，在目前无法了解经典HD(混合细胞型和结节硬化型，即MCHD和NSHD)的H/R-S细胞胞浆中为何能同时存在两种轻链蛋白的情况下，研究H/R-S细胞κ和λ轻链基因重排有相当的意义。我们以曾经建立的方法为基础[3]，除采用IgH通用引物和κ轻链家族性特异性引物外，还采用了Kppers等人没有采用过的λ轻链家族性特异性引物，对提取的单个细胞进行IgH和κ、λ基因重排的研究，以进一步明确H/R-S细胞的性质和来源。
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材料和方法
一 、材料
选自华西医科大学附属第一医院病理科1989年～1997年间诊断的HD淋巴结冰冻组织8例。其中，MCHD 5例，NSHD2 例，淋巴细胞为主型(LP)HD 1例。B细胞中心母细胞性淋巴瘤石蜡包埋组织1例作为阳性对照。
二、方法
1.单个H/R-S细胞的提取：详见参考文献[3]。
2.免疫组化：除CD30外，每一例石蜡切片均作κ及λ单克隆抗体(Dako公司)ABC法染色。
3.引物：(1) 重链基因引物[4]由中国科学院上海细胞生物研究所合成。扩增片段长度约80～120 bp。(2) κ、λ轻链基因家族性特异性引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成[5，6]。Vκ和Vλ家族性特异性引物和相应J区引物扩增片段长度约350 bp[5，6]。其中，Vκ5和Vκ6、Vλ3a和Vλ3b、Vλ7和Vλ8分别按1∶1的比例混合使用；3′Jκ1、2、4，3′Jκ3和3′Jκ5按3∶1∶1的比例使用；Jλ1，Jλ2、3和Jλ6、7按1∶2∶1的比例使用，以减少反应次数。对Vλ5、6、10、11和Vλ12家族目前未设计出相应引物。
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4.聚合酶链反应(PCR)：(1) 单个细胞IgH扩增：在PE480 DNA热循环仪上进行。半巢式扩增。首轮循环体积25 μl(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.4，0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl2，dNTPs各200 μmol/L，FRⅢa/LJH各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶(上海复旦生物所)，热启动。95 ℃ 5分钟，61 ℃5分钟，72 ℃5分钟，后接40个循环，95 ℃1分钟，61℃ 30秒，72 ℃30秒。首轮循环产物不释释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，引物FRⅢa/VLJH各2.8 nmol/L。30个循环，95 ℃ 1分钟，62 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，其余同首轮循环。。除将后接40个循环改为后接30个循环外，其余步骤同首轮循环。(2) 单个细胞κ、λ基因扩增：首轮循环体积25 μl(50 mmol/l KCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH8.4, 0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl2，dNTPs各200 μmol/L, β-珠蛋白基因引物[3]和Vκ/Vλ混合引物以及3′Jκ混合引物或Jλ混合引物各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶)，热启动。首轮循环95 ℃ 5分钟，59 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，59 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒。首轮产物不稀释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，每种KJκ或VJλ引物和5′Jκ混合引物各2.8 nmol/L。其余同首轮循环。95 ℃2分钟，61 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，61 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒，最后延伸10分钟结束。
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5.对照：B细胞中心母细胞型淋巴瘤石蜡包埋组织，常规提取DNA并行PCR(条件同IgH扩增)。首轮产物稀释1 000倍作为第二轮扩增的模板。阴性对照不加DNA。κ、λ基因扩增取首轮产物10 μl点样，如果单个细胞DNA提取成功及β-珠蛋白基因扩增成功，则会出现268 bp阳性条带。无阳性条带者不作第二轮扩增。
6.结果观察：取10 μl产物作8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，110V，3～4小时，EB染色，紫外线观察仪观察并照相记录。
7.κ、λ家族性特异性引物对慢性淋巴结炎的检验性扩增：为检验引物的可靠性，以1例石蜡包埋的慢性淋巴结炎常规提取DNA作一次性PCR，条件同单细胞κ、λ轻链扩增的第二轮。每种Vκ和Vλ引物的扩增产物各取10 μl点样观察。
结果
1.对照：B细胞性中心母细胞型淋巴瘤DNA经FRⅢa/JH扩增后，在80～120 bp处出现宽度<2 mm的清晰条带。>124 bp处的条带为非特异性扩增产物[7]。阴性对照未出现任何条带。
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2.慢性淋巴结炎PCR结果：Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4，Vκ5，6均出现350 bp的特异性条带；Vλ3，Vλ4，Vλ7、8，Vλ9亦出现相同大小的特异带。
3.免疫组化结果：各例MCHD和NSHD的H/R-S细胞均表达κ、λ轻链以及CD30。LPHD的H/R-S细胞表达κ和λ轻链，不表达CD30。
4.单个H/R-S细胞重链通用引物PCR结果：总计提取H/R-S细胞78个，其中28个细胞扩增出80～120 bp特异带，阳性率35.8%(图1，附表)
5.单个H/R-S细胞κ、λ家族性特异性引物PCR结果：总计提取细胞67个，有24个扩增成功，阳性率35.8%(图2，3附表)。例1(LPHD)H/R-S细胞显示出Vκ4家族重排；例2(NSHD)有Vκ4和Vλ3家族重排，因细胞较少难以肯定是否是克隆性重排；例3(NSHD)有克隆性Vκ4家族重排和Vκ2、4家族重排；例4(MCHD)有Vκ3、Vλ4重排；例5(MCHD)有克隆性Vκ4重排及Vλ3重排；例6(MCHD)无Vκ重排，Vλ未做；例7(MCHD)有克隆性Vκ3重排及Vλ2、4重排；例8(MCHD)未能提取到用于轻链扩增的细胞。
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附表 8例HD单个H/R-S细胞IgVH、Vκ和Vλ基因重排结果 病分
例型
提取
细胞
数(个)
β-珠蛋白
引物阳性
扩增数(个)
重链通用引物和轻链
家族性引物扩增结果
重复
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单次
无产物
1LP
14
4
2×IgH,2×Vκ4
2×IgH,2
×Vλ
2NS
14
3
1×IgH,1×Vκ4，1×Vλ3
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3×IgH,1×Vκ
3NS
14
4
2×Vκ4
1×IgH，1×Vκ2、Vκ4
3×IgH,1×Vλ
4MC
28
5
6×IgH
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1×Vκ3，1×Vλ4
10×IgH，1×Vκ，2×Vλ
5MC
14
3
2×Vκ4
1×IgH，1×Vλ3
3×IgH
6MC
9
1
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2×IgH
2×IgH,1×Vκ
7MC
48
4
14×IgH，2×Vκ3
1×Vλ2、Vλ4
24×IgH，1×Vλ
8MC
4
1×IgH
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3×IgH
注：乘号前数字表示细胞个数，如6×IgH：表示有6个H/R-S细胞出现IgH基因重排，其余以此类推
M：分子量标记PBR 322/HaeⅢ(下同)，P：阳性对照，中心母细胞型淋巴瘤，具有80 bp特异性条带，1～4道为单细胞样本，其中1，4道出现80 bp特异性条带，N：阴性对照(下同)图1 例6(MCHD) IgH引物对单个H/R-S细胞行PCR的电泳结果
β：β-珠蛋白基因首轮扩增阳性条带(268 bp)，Vκ4出现350 bp左右的特异性条带图2 例1(LPHD)单个H/R-S细胞Vκ家族性引物PCR电泳结果
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β-珠蛋白基因首轮扩增阳性条带(268 bp)，Vλ4和Vλ2出现350 bp左右的特异性条带图3 例7(MCHD)单个H/R-S细胞Vλ家族性引物PCR电泳结果
讨论
一、单个H/R-S细胞重链引物扩增阳性率
本研究所用引物FRⅢa、VLJH和LJH对B细胞肿瘤IgH基因克隆性增生的检测率为80%左右[8]。我们从8例HD冰冻切片上共提取H/R-S细胞78个，有28个细胞扩增成功，表示这些H/R-S细胞存在IgH基因重排，阳性扩增率为35.8%。阳性扩增率不高，除细胞大小等因素外，FRⅢa不能检测FRⅠ、FRⅡ以及bcl-2/JH重排也是一个重要原因[4]。
二、轻链家族性特异性引物进行单细胞PCR的方法学
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从慢性淋巴结炎扩增结果来看，每个Vκ家族和大部分Vλ家族都出现了特异性条带，表明样本中B细胞增生是多克隆性的。阴性对照没有出现任何产物，表明本实验方法和条件正确，所用引物能反映出样本中B细胞轻链基因重排的克隆性。
本方法和Kppers等人的相比较，最大改进是在首轮循环中加入β-珠蛋白基因引物作混合扩增，根据产物中是否出现β-珠蛋白基因特异性产物来判断单个细胞DNA提取及扩增是否成功，并由此决定有无必要进行第二轮扩增，从而减少了扩增次数，节约了试剂和时间。
从结果看出，并非所有β-珠蛋白基因呈阳性扩增的H/R-S细胞都能得到相应的轻链扩增结果。其原因可能是：(1) 相应的轻链基因未发生重排，处于原始构型状态；(2) 所用家族性特异性引物，不能覆盖所有V区片段；(3) 染色体突变(如易位)引起基因发生缺失。
三、LPHD的H/R-S细胞基因重排
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此例有2个H/R-S细胞出现IgH重排，2个H/R-S细胞发生Vκ4重排，说明两两分别具有相同的重排方式，可能来源于一个B细胞克隆。另2个细胞未检测到Vλ基因重排，最可能的原因是Vκ基因重排成功，Vλ未发生重排。所以，此例H/R-S细胞的B细胞性质是十分清楚的，并处于B细胞分化的中期阶段[9]。
由于LPHD特殊的临床生物学行为，以及H/R-S细胞特殊的免疫表型和基因表型，最近被认为是一种克隆性增生的B细胞肿瘤，而从传统HD中分出。我们的实验结果支持这一观点。
四、NSHD的H/R-S细胞基因重排
例2有1个H/R-S细胞出现IgH重排，2个细胞分别出现Vκ4和Vλ3家族重排，故此例HD的H/R-S细胞性质可以肯定，并处于B细胞分化的中晚期[9]。例3有1个细胞发生IgH重排，有2个细胞出现Vκ4重排，这2个细胞来自同一B细胞克隆的可能性较大。另有1个细胞同时出现Vκ2和Vκ4家族的重排，即κ基因等位重排。由于等位排斥(allelic exclusion)原理，Vκ2和Vκ4必有一个为非功能性重排，若Vκ4重排具有功能性，则这例HDNS的3个H/R-S细胞就有可能来自相同的B细胞克隆。此例H/R-S细胞未能检测出λ基因重排，其原因很可能是λ位点处于原始构型状态。
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和Kppers等人的结果相比，我们不但发现NSHD的H/R-S细胞有κ基因重排，而且首次发现有λ基因重排。所以，此例H/R-S细胞的B细胞性质可以肯定，并处于B细胞分化的中晚期阶段，有可能来自同一B细胞克隆。
五、MCHD的H/R-S细胞基因重排
例4有6个细胞出现IgH重排，故来自同一B细胞克隆的可能性较大。另有2个细胞分别出现Vκ3家族重排和Vλ4家族重排。Vλ4为假基因，为非功能性重排。例5有2个细胞出现Vκ4重排，各有1个细胞出现IgH和Vλ3重排。例6未能获得Vκ重排产物，最大的可能性是κ基因位点未发生重排。例7有14个细胞出现克隆性IgH重排，2个细胞有Vκ3家族重排；1个细胞同时出现Vλ2和Vλ4等位基因重排，其中Vλ4为假基因非功能性重排，如果Vκ3是非功能性重排，则此例3个H/R-S细胞来自相同B细胞克隆的可能性极大。
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和Kppers等人的材料相比较，例4、5、7不但有Vκ基因重排，同时还有Vλ重排，这是首次发现Igλ基因重排在MCHD的H/R-S细胞中出现。这些H/R-S细胞有可能来源于分化中期的同一B细胞克隆，特别是例7。
本实验尚不够完善，尚需进一步进行PCR产物的DNA测序，增加检测例数和细胞数，作同一个H/R-S细胞的κ、λ mRNA原位检测及同一个细胞多种Ig引物的共同扩增。
参考文献
1Kppers R, Rajewsky K, Zhao-M, et al. Hodgkin′s Disease: Hodgkin and Reed-Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived B cells at various stages of development. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91：10962-10966.
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2Drexler HG. Recent result on the biology of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. I. Biopsy material. Leuk Lymphoma, 1992, 8：283-304.
3邓飞，吕广能，李甘地，等.从组织切片中提取单个细胞DNA进行PCR的方法.中华病理学杂志, 1997，26：52-53.
4Diss TC, Peng HZ, Watherspoon AC, et al. Detection of monoclonality in low-grade B-cell lymphoma using the polymerase chain reaction is dependent on primer selection and lymphoma type. J Pathol, 1993, 169：291-295.
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5Kppers R，Willenbrock K, Rajewsky K, et al. Detection fo clonal light chain gene rearrange ment in frozen and paraffin embedded tissue by polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1995, 147：806-814.
6Kppers R, Zhao-M, Rajewsky K, et al. Detction of clonal B cell population in paraffin-embedded tissues by polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1993, 143：230-239.
7Trainor KJ, Brisco MJ, Story CT, et al. Monoclonality in B Lymphoproliferative disorders detected at DNA level. Blood, 1990, 76：2220-2222.
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8Deane M, Norton JD. Immunoglobulin heavy chain variable region family usage is indepent of tumor cell phenotype in human B Lineage leukemias. Eur J Immunol, 1990, 20：2209-2211.
9Felix CA, Poplack DG. Characterization of acute lymphoblastic leukemia of childhood by immunoglobulin and T-cell receptor gene patterns. Leukemia, 1991, 5：1015-1018.
(收稿：1997-09-16 修回：1998-06-08), http://www.100md.com
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关键词：霍奇金病；基因重排；聚合酶链反应；Hodgkin/Reed-Sternberg细胞
中华病理学杂志980407 【摘要】 目的 探讨Hodgkin病(HD)Hodgkin/Reed-Sternberg(H/R-S)细胞的性质和来源。方法 从8例HD冰冻切片上共提取H/R-S细胞68个，用IgH通用引物FRⅢa/JH和κ、λ轻链家族性特异性引物行PCR检测。结果 1例淋巴细胞为主型(LP)HD的H/R-S细胞重复出现IgH和Vκ4家族重排；2例结节硬化型HD(NSHD)中，1例H/R-S细胞有单次的IgH、Vκ4和Vλ3重排；1例有重复的Vκ4重排，单次的IgH和Vκ2、4重排；5例混合细胞型(MC)HD中，1例有重复的IgH重排，单次的Vκ3和Vλ4重排；1例有重复的Vκ4重排，单次的Vλ3和IgH重排；2例有重复的IgH重排和单次的IgH重排；1例有重复的IgH和Vκ3重排，单次的Vλ2、4重排。结论 (1) LPHD的H/R-S细胞具有克隆性IgH和Vκ4基因重排，支持LPHD为B细胞克隆性增生的结论；(2) IgH和κ、λ基因重排的出现，提示NSHD和MCHD的H/R-S细胞来源于不同分化阶段的B细胞，可能为单克隆性，也有可能为寡克隆性增生。本研究的新颖之处在于：(1) 改进后的单个细胞PCR方法和Kppers等人的原方法相比较，能大幅度减少PCR的次数，节约试剂和时间；(2) 首次发现单个H/R-S细胞具有λ轻链基因重排。
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Hodgkin′s disease: Ig gene rearrangements in single H/R-s cells Deng Fei, Li Gandi, Yand Guang hua, et al. Department of Pathology, West China University of Medical Sciences, Chengdo 610041
【Abstract】 Objective To investigate the origin and cell lineage of Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S) cells from various subtypes of Hodgkin′s disease (HD). Methods 68 single H/R-S cells were taken from frozen section of 8 cases of HD. The DNA from these single cells was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with immunoglobulin heavy chain gene FRⅢa/JH primers and light chain family-specific primers. Results (1) IgH and Vκ4 rearrangements were repeatedly found in H/R-S cells from one case of lymphocytic predominant HD (LPHD). (2) Repeated and unique IgH and Vκ2,4 rearrangements were observed in 1 case of nodular sclerosing HD (NSHD) and unique IgH, Vλ3/Vκ4 rearrangements in another case of NSHD. (3) Repeated IgH/Vλ3 and unique Vλ2,4 rearrangements, repeated Vκ4 and unique IgH/Vκ3 rearrangements, plus repeated IgH and unique Vκ3/Vλ4 rearrangements were detected respectively in 3 cases of mixed cellularity HD (MCHD). Repeated and unique rearrangements were found respectively in 2 cases of MCHD. Conclusions The H/R-S cells isolated from LPHD had monoclonal Igh and Vκ4 gene rearrangements, which supports the conclusion that LPHD is a monoclonal proliferation of B cells. The appearance of IgH and κ,λ gene rearrangement suggest that the H/R-S cells isolated from classical HD (MCHD and NSHD) originate from B lineage cells at various stages of differentiation.
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【Key words】 Hodgkin′s disease Gene rearrangement Polymerase chain reaction Hodgkin/Reed-Sternberg cell
长期以来，Hodgkin病(HD)的肿瘤性成分Hodgkin/Reed-Sternberg (H/R-S)细胞就一直引起病理学家的极大兴趣，但其性质和来源至今未有定论。造成这种情况的主要原因是H/R-S细胞在肿瘤组织中含量极少，H/R-S细胞识别标准难以统一，各种研究方法本身具有局限性。1994年，德国Kppers等[1]直接从组织切片上提取单个H/R-S细胞并发现有IgH和Vκ基因重排，提示这些细胞来源于B细胞，为阐明H/R-S细胞的性质作出了重要贡献。但他们没有进行λ轻链基因重排的研究。目前尚未看到有关H/R-细胞λ轻链基因重排的报道，也未见到HD的研究为何多涉及κ轻链而不涉及λ轻链的详细解释[2]。由于κ轻链和λ轻链基因重排在判断B细胞分化程度上有同等的重要性，所以，在目前无法了解经典HD(混合细胞型和结节硬化型，即MCHD和NSHD)的H/R-S细胞胞浆中为何能同时存在两种轻链蛋白的情况下，研究H/R-S细胞κ和λ轻链基因重排有相当的意义。我们以曾经建立的方法为基础[3]，除采用IgH通用引物和κ轻链家族性特异性引物外，还采用了Kppers等人没有采用过的λ轻链家族性特异性引物，对提取的单个细胞进行IgH和κ、λ基因重排的研究，以进一步明确H/R-S细胞的性质和来源。
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材料和方法
一 、材料
选自华西医科大学附属第一医院病理科1989年～1997年间诊断的HD淋巴结冰冻组织8例。其中，MCHD 5例，NSHD2 例，淋巴细胞为主型(LP)HD 1例。B细胞中心母细胞性淋巴瘤石蜡包埋组织1例作为阳性对照。
二、方法
1.单个H/R-S细胞的提取：详见参考文献[3]。
2.免疫组化：除CD30外，每一例石蜡切片均作κ及λ单克隆抗体(Dako公司)ABC法染色。
3.引物：(1) 重链基因引物[4]由中国科学院上海细胞生物研究所合成。扩增片段长度约80～120 bp。(2) κ、λ轻链基因家族性特异性引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成[5，6]。Vκ和Vλ家族性特异性引物和相应J区引物扩增片段长度约350 bp[5，6]。其中，Vκ5和Vκ6、Vλ3a和Vλ3b、Vλ7和Vλ8分别按1∶1的比例混合使用；3′Jκ1、2、4，3′Jκ3和3′Jκ5按3∶1∶1的比例使用；Jλ1，Jλ2、3和Jλ6、7按1∶2∶1的比例使用，以减少反应次数。对Vλ5、6、10、11和Vλ12家族目前未设计出相应引物。
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4.聚合酶链反应(PCR)：(1) 单个细胞IgH扩增：在PE480 DNA热循环仪上进行。半巢式扩增。首轮循环体积25 μl(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.4，0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl2，dNTPs各200 μmol/L，FRⅢa/LJH各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶(上海复旦生物所)，热启动。95 ℃ 5分钟，61 ℃5分钟，72 ℃5分钟，后接40个循环，95 ℃1分钟，61℃ 30秒，72 ℃30秒。首轮循环产物不释释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，引物FRⅢa/VLJH各2.8 nmol/L。30个循环，95 ℃ 1分钟，62 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，其余同首轮循环。。除将后接40个循环改为后接30个循环外，其余步骤同首轮循环。(2) 单个细胞κ、λ基因扩增：首轮循环体积25 μl(50 mmol/l KCl, 10 mmol/L Tris-HCl pH8.4, 0.01%明胶，2.5 mmol/L MgCl2，dNTPs各200 μmol/L, β-珠蛋白基因引物[3]和Vκ/Vλ混合引物以及3′Jκ混合引物或Jλ混合引物各2.8 nmol/L，1U Taq聚合酶)，热启动。首轮循环95 ℃ 5分钟，59 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，59 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒。首轮产物不稀释，取5 μl作为第二轮循环的模板。第二轮循环中，每种KJκ或VJλ引物和5′Jκ混合引物各2.8 nmol/L。其余同首轮循环。95 ℃2分钟，61 ℃ 4分钟，72 ℃ 80秒，后接40个循环，95 ℃ 90秒，61 ℃ 30秒，72 ℃ 80秒，最后延伸10分钟结束。
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5.对照：B细胞中心母细胞型淋巴瘤石蜡包埋组织，常规提取DNA并行PCR(条件同IgH扩增)。首轮产物稀释1 000倍作为第二轮扩增的模板。阴性对照不加DNA。κ、λ基因扩增取首轮产物10 μl点样，如果单个细胞DNA提取成功及β-珠蛋白基因扩增成功，则会出现268 bp阳性条带。无阳性条带者不作第二轮扩增。
6.结果观察：取10 μl产物作8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，110V，3～4小时，EB染色，紫外线观察仪观察并照相记录。
7.κ、λ家族性特异性引物对慢性淋巴结炎的检验性扩增：为检验引物的可靠性，以1例石蜡包埋的慢性淋巴结炎常规提取DNA作一次性PCR，条件同单细胞κ、λ轻链扩增的第二轮。每种Vκ和Vλ引物的扩增产物各取10 μl点样观察。
结果
1.对照：B细胞性中心母细胞型淋巴瘤DNA经FRⅢa/JH扩增后，在80～120 bp处出现宽度<2 mm的清晰条带。>124 bp处的条带为非特异性扩增产物[7]。阴性对照未出现任何条带。
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2.慢性淋巴结炎PCR结果：Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4，Vκ5，6均出现350 bp的特异性条带；Vλ3，Vλ4，Vλ7、8，Vλ9亦出现相同大小的特异带。
3.免疫组化结果：各例MCHD和NSHD的H/R-S细胞均表达κ、λ轻链以及CD30。LPHD的H/R-S细胞表达κ和λ轻链，不表达CD30。
4.单个H/R-S细胞重链通用引物PCR结果：总计提取H/R-S细胞78个，其中28个细胞扩增出80～120 bp特异带，阳性率35.8%(图1，附表)
5.单个H/R-S细胞κ、λ家族性特异性引物PCR结果：总计提取细胞67个，有24个扩增成功，阳性率35.8%(图2，3附表)。例1(LPHD)H/R-S细胞显示出Vκ4家族重排；例2(NSHD)有Vκ4和Vλ3家族重排，因细胞较少难以肯定是否是克隆性重排；例3(NSHD)有克隆性Vκ4家族重排和Vκ2、4家族重排；例4(MCHD)有Vκ3、Vλ4重排；例5(MCHD)有克隆性Vκ4重排及Vλ3重排；例6(MCHD)无Vκ重排，Vλ未做；例7(MCHD)有克隆性Vκ3重排及Vλ2、4重排；例8(MCHD)未能提取到用于轻链扩增的细胞。
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附表 8例HD单个H/R-S细胞IgVH、Vκ和Vλ基因重排结果 病分
例型
提取
细胞
数(个)
β-珠蛋白
引物阳性
扩增数(个)
重链通用引物和轻链
家族性引物扩增结果
重复
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单次
无产物
1LP
14
4
2×IgH,2×Vκ4
2×IgH,2
×Vλ
2NS
14
3
1×IgH,1×Vκ4，1×Vλ3
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3×IgH,1×Vκ
3NS
14
4
2×Vκ4
1×IgH，1×Vκ2、Vκ4
3×IgH,1×Vλ
4MC
28
5
6×IgH
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1×Vκ3，1×Vλ4
10×IgH，1×Vκ，2×Vλ
5MC
14
3
2×Vκ4
1×IgH，1×Vλ3
3×IgH
6MC
9
1
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2×IgH
2×IgH,1×Vκ
7MC
48
4
14×IgH，2×Vκ3
1×Vλ2、Vλ4
24×IgH，1×Vλ
8MC
4
1×IgH
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3×IgH
注：乘号前数字表示细胞个数，如6×IgH：表示有6个H/R-S细胞出现IgH基因重排，其余以此类推
M：分子量标记PBR 322/HaeⅢ(下同)，P：阳性对照，中心母细胞型淋巴瘤，具有80 bp特异性条带，1～4道为单细胞样本，其中1，4道出现80 bp特异性条带，N：阴性对照(下同)图1 例6(MCHD) IgH引物对单个H/R-S细胞行PCR的电泳结果
β：β-珠蛋白基因首轮扩增阳性条带(268 bp)，Vκ4出现350 bp左右的特异性条带图2 例1(LPHD)单个H/R-S细胞Vκ家族性引物PCR电泳结果
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β-珠蛋白基因首轮扩增阳性条带(268 bp)，Vλ4和Vλ2出现350 bp左右的特异性条带图3 例7(MCHD)单个H/R-S细胞Vλ家族性引物PCR电泳结果
讨论
一、单个H/R-S细胞重链引物扩增阳性率
本研究所用引物FRⅢa、VLJH和LJH对B细胞肿瘤IgH基因克隆性增生的检测率为80%左右[8]。我们从8例HD冰冻切片上共提取H/R-S细胞78个，有28个细胞扩增成功，表示这些H/R-S细胞存在IgH基因重排，阳性扩增率为35.8%。阳性扩增率不高，除细胞大小等因素外，FRⅢa不能检测FRⅠ、FRⅡ以及bcl-2/JH重排也是一个重要原因[4]。
二、轻链家族性特异性引物进行单细胞PCR的方法学
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从慢性淋巴结炎扩增结果来看，每个Vκ家族和大部分Vλ家族都出现了特异性条带，表明样本中B细胞增生是多克隆性的。阴性对照没有出现任何产物，表明本实验方法和条件正确，所用引物能反映出样本中B细胞轻链基因重排的克隆性。
本方法和Kppers等人的相比较，最大改进是在首轮循环中加入β-珠蛋白基因引物作混合扩增，根据产物中是否出现β-珠蛋白基因特异性产物来判断单个细胞DNA提取及扩增是否成功，并由此决定有无必要进行第二轮扩增，从而减少了扩增次数，节约了试剂和时间。
从结果看出，并非所有β-珠蛋白基因呈阳性扩增的H/R-S细胞都能得到相应的轻链扩增结果。其原因可能是：(1) 相应的轻链基因未发生重排，处于原始构型状态；(2) 所用家族性特异性引物，不能覆盖所有V区片段；(3) 染色体突变(如易位)引起基因发生缺失。
三、LPHD的H/R-S细胞基因重排
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此例有2个H/R-S细胞出现IgH重排，2个H/R-S细胞发生Vκ4重排，说明两两分别具有相同的重排方式，可能来源于一个B细胞克隆。另2个细胞未检测到Vλ基因重排，最可能的原因是Vκ基因重排成功，Vλ未发生重排。所以，此例H/R-S细胞的B细胞性质是十分清楚的，并处于B细胞分化的中期阶段[9]。
由于LPHD特殊的临床生物学行为，以及H/R-S细胞特殊的免疫表型和基因表型，最近被认为是一种克隆性增生的B细胞肿瘤，而从传统HD中分出。我们的实验结果支持这一观点。
四、NSHD的H/R-S细胞基因重排
例2有1个H/R-S细胞出现IgH重排，2个细胞分别出现Vκ4和Vλ3家族重排，故此例HD的H/R-S细胞性质可以肯定，并处于B细胞分化的中晚期[9]。例3有1个细胞发生IgH重排，有2个细胞出现Vκ4重排，这2个细胞来自同一B细胞克隆的可能性较大。另有1个细胞同时出现Vκ2和Vκ4家族的重排，即κ基因等位重排。由于等位排斥(allelic exclusion)原理，Vκ2和Vκ4必有一个为非功能性重排，若Vκ4重排具有功能性，则这例HDNS的3个H/R-S细胞就有可能来自相同的B细胞克隆。此例H/R-S细胞未能检测出λ基因重排，其原因很可能是λ位点处于原始构型状态。
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和Kppers等人的结果相比，我们不但发现NSHD的H/R-S细胞有κ基因重排，而且首次发现有λ基因重排。所以，此例H/R-S细胞的B细胞性质可以肯定，并处于B细胞分化的中晚期阶段，有可能来自同一B细胞克隆。
五、MCHD的H/R-S细胞基因重排
例4有6个细胞出现IgH重排，故来自同一B细胞克隆的可能性较大。另有2个细胞分别出现Vκ3家族重排和Vλ4家族重排。Vλ4为假基因，为非功能性重排。例5有2个细胞出现Vκ4重排，各有1个细胞出现IgH和Vλ3重排。例6未能获得Vκ重排产物，最大的可能性是κ基因位点未发生重排。例7有14个细胞出现克隆性IgH重排，2个细胞有Vκ3家族重排；1个细胞同时出现Vλ2和Vλ4等位基因重排，其中Vλ4为假基因非功能性重排，如果Vκ3是非功能性重排，则此例3个H/R-S细胞来自相同B细胞克隆的可能性极大。
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和Kppers等人的材料相比较，例4、5、7不但有Vκ基因重排，同时还有Vλ重排，这是首次发现Igλ基因重排在MCHD的H/R-S细胞中出现。这些H/R-S细胞有可能来源于分化中期的同一B细胞克隆，特别是例7。
本实验尚不够完善，尚需进一步进行PCR产物的DNA测序，增加检测例数和细胞数，作同一个H/R-S细胞的κ、λ mRNA原位检测及同一个细胞多种Ig引物的共同扩增。
参考文献
1Kppers R, Rajewsky K, Zhao-M, et al. Hodgkin′s Disease: Hodgkin and Reed-Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived B cells at various stages of development. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91：10962-10966.
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2Drexler HG. Recent result on the biology of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. I. Biopsy material. Leuk Lymphoma, 1992, 8：283-304.
3邓飞，吕广能，李甘地，等.从组织切片中提取单个细胞DNA进行PCR的方法.中华病理学杂志, 1997，26：52-53.
4Diss TC, Peng HZ, Watherspoon AC, et al. Detection of monoclonality in low-grade B-cell lymphoma using the polymerase chain reaction is dependent on primer selection and lymphoma type. J Pathol, 1993, 169：291-295.
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5Kppers R，Willenbrock K, Rajewsky K, et al. Detection fo clonal light chain gene rearrange ment in frozen and paraffin embedded tissue by polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1995, 147：806-814.
6Kppers R, Zhao-M, Rajewsky K, et al. Detction of clonal B cell population in paraffin-embedded tissues by polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1993, 143：230-239.
7Trainor KJ, Brisco MJ, Story CT, et al. Monoclonality in B Lymphoproliferative disorders detected at DNA level. Blood, 1990, 76：2220-2222.
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8Deane M, Norton JD. Immunoglobulin heavy chain variable region family usage is indepent of tumor cell phenotype in human B Lineage leukemias. Eur J Immunol, 1990, 20：2209-2211.
9Felix CA, Poplack DG. Characterization of acute lymphoblastic leukemia of childhood by immunoglobulin and T-cell receptor gene patterns. Leukemia, 1991, 5：1015-1018.
(收稿：1997-09-16 修回：1998-06-08), http://www.100md.com