灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响
作者：李明春 梁东升 许自明 雷林生 杨淑琴 孙莉莎
单位：李明春 梁东升 许自明(中国人民解放军401医院药剂科 青岛 266071)；雷林生 杨淑琴 孙莉莎(第一军医大学药理教研室)
关键词：灵芝；灵芝多糖；巨噬细胞；蛋白激酶A
中草药000518 摘 要 为观察灵芝多糖(GLB7)体外对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)蛋白激酶A(PKA)活性的影响，采用反相离子对高效液相色谱法测定MΦ中RKA活力。结果表明GLB7(40 mg/L)能引起小鼠腹腔MΦ中PKA活性明显升高，10 min达峰值，30 min恢复到基础水平。提示灵芝多糖的免疫增强作用与其增强MΦ中PKA活性有关。
Effects of Ganoderma (Ganoderma lucidum) Polysaccharide on PKA Activity of
, 百拇医药
Murine Peritoneal Macrophages
Li Mingchun, Liang Dongsheng and Xu Ziming
(Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA Qingdao 266071)
Lei Linsheng, Yang Shuqin and Sun Lisha
(Department of Pharmacology, the First Military Medical University)
Abstract To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLB7) on protein kinase A (PKA) activity of murine peritoneal macrophages. A new ionpair RP-HPLC method was used to determine the activty of PKA in cells. The results showed that GLB7 (40 mg/L) activated the PKA of murine peritoneal macrophages, to a peak value within 10 min, and then recovered to its basic level after 30 min. This result indicated that GLB7 may act as an immunopoteniator of PKA in murine peritoneal macrophages.
, http://www.100md.com
Key words Ganoderma lucidum (Leyee.ex Fr.) Karst Ganoderma lucidum polysaccharide macrophage protein kinase A (PKA)
灵芝多糖是灵芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst的主要活性成分。以往实验证明灵芝多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用，它能增强小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)的吞噬功能，促进混合淋巴细胞培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性以及促进白细胞介素2的分泌等[1～4]。但灵芝多糖的免疫作用机制尤其是对免疫细胞的信号转导过程有何影响尚不清楚。本文利用反相离子对高效液相色谱测定技术，观察灵芝多糖对小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶A(PKA)的影响，以探讨灵芝多糖的免疫调节作用机制。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 药品与试剂：灵芝多糖(GLB7)，按文献方法提取[5，6]，化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖，糖苷键连接方式以β(1→4)为主，稍多α(1→6)，分子量9 000。RPMI-1640培养基，为Gibco产品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程材料研究所产品。Sucrose、DTT、Leupetin、Histone (Ⅲ-s)、PM-SF、ATP、ADP、AMP、cAMP均为Sigma产品。甲醇、PiCA，皆为国产色谱纯。
1.2 动物：BALB/c纯系小鼠，♀不限，8周龄，体重18～22 g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞的培养：按文献方法[7]无菌取小鼠腹腔MΦ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为109～1010/L，接种于多孔培养板中，置于含5%CO2、95%空气孵箱中，37 ℃孵育24 h。对照组皆以RPMI-1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
, 百拇医药
1.4 RKA活性测定[8]
1.4.1 PKA的制备：于培养的细胞体系中加入200 μL PKA提取液，内含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, DTT 2 mmol/L, Leupetin 5 mg/L, PMSF 1 mmol/L, Sucrose 200 mmol/L, CaCl2 1 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L。冰浴下超声粉碎。900×g离心5 min，去除碎片和胞核，得上清即为胞浆组分和膜性组分，以此用于测定PKA总活力。以上操作皆于4 ℃以下进行。
1.4.2 PKA活性测定：用反相离子对高效液相色谱法测定[8]。色谱条件：C18柱；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液(20∶80，pH7.0，内含5 mmol/L PiCA)；流速：1 mL/min；检测波长：259 nm；柱温：室温；0.01AUFS、进样量20 μL。PKA反应体系中包括PKA反应液，内含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, MgCl2 5 mmol/L,组蛋白(Histone,Ⅲ-s) 1 g/L, DTT 2 mmol/L, ATP 0.5 mmol/L, cAMP 2 μmol/L和适量酶液(按蛋白含量计)，反应总体积为1 mL。先将除酶液以外的其它溶液混匀，30 ℃预热5 min，再加入酶液起始反应。反应开始后于30 ℃水浴摇床中准确保温10 min，立即置于沸水浴中1 min终止反应；冷却后离心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 mL氯仿-甲醇(2∶1)混合物，振荡1 min，抽提脂溶性物质，200×g离心5 min；小心吸出水层，其中含ATP、ADP和AMP。重复前步骤处理1次，合并提取液，低温冻存待测。
, http://www.100md.com
1.4.3 蛋白含量测定：按Lowry法测定。
1.4.4 PKA活力定义：一个酶活力单位相当于每分钟使Histone (Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。
2 结果
2.1 反相离子对HPLC法测定PKA：在上述色谱条件下，ATP、ADP和AMP三种物质可呈现良好的分离，在样品测定中，杂质峰不影响ATP的测定(图1)。
A-标准品 B-样品
图1 反相离子对HPLC法测定MΦ中PKA色谱图
2.2 GLB7对小鼠MΦ中PKA活性的影响：以40 mg/L GLB7与MΦ一起孵育不同时间后，测定PKA总活力。结果显示：GLB7可明显增强小鼠腹腔MΦ中PKA总活力，10 min达到峰值，至30 min恢复到基础水平(图2)。在10 min时GLB7与PKA的量效关系具有一定浓度依赖性(r=0.878 9，表1)，实验测得PKA的基础总活力为(80.93±4.52) nmol/(min.mg)(n=6，
±s)。
, 百拇医药
A-实验组； B-对照组； GLB7浓度为40mg/L
图2 GLB7对小鼠腹腔MΦ PKA活性的影响时程
表1 GLB7对小鼠MΦ PKA活性的影响(n=6，±s) GLB7
(mg/L)
PKA总活性(nmol/min.mg)
实验组
对照组
10
, 百拇医药
288.14±11.81
81.32±7.45
20
377.19±13.38
80.07±5.47
40
442.71±13.45
80.84±9.41
80
489.25±19.28
79.89±11.26
, 百拇医药
160
537.74±21.25
87.04±10.37
与对照组比较：P<0.01
3 讨论
关于蛋白激酶的测定方法，目前国内外一般采用32P-γ-ATP磷酸化组蛋白法测定PKA活力。虽然同位素法灵敏度高，但存在放射性污染，加之条件要求高，不易进行。以HPLC法测定PKA的活性，不仅避免了同位素污染，而且方法简便、重现性好(RSD=0.18%)、准确性及灵敏度高(回收率99.63%)。其测定原理是：ATP在PKA反应体系中作为提供磷酸的物质，使底物磷酸化，同时降解为ADP和(或)AMP，其中ATP的消耗量与PKA之活力成正比。
, http://www.100md.com
蛋白激酶是催化体内蛋白磷酸化的酶类，而蛋白磷酸化则是体内各种生物反应最终起作用的通路。PKA是一类cAMP依赖性蛋白激酶，是整个cAMP作用的分子基础，在真核细胞内几乎所有cAMP的作用都是通过活化PKA，从而使底物蛋白发生磷酸化而实现。本实验证明灵芝多糖可引起小鼠腹腔巨噬细胞PKA活性明显升高，提示其免疫增强作用可能与活化PKA有关。但其活化途径仍需进一步研究。
Add ress: Li Mingchun, Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingda o
国家自然科学基金资助项目 No/39400165
李明春 男，副主任药师。1987年毕业于第二军医大学药学系，获学士学位：1998年毕业于 第一军医大学，获药理学硕士学位，研究方向为免疫药理。近年来在国内外期刊上发表论文 10余篇，获军队科技成果奖6项。现主要从事临床药理学研究工作。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，林志彬.北京医科大学学报，1992，24(4)：271
2，雷林生，等.基础与临床，1992，12(2)：59
3，Lei L S, et al. Acta Pharmaceutical Sinica, 1992,27(5):331
4，Lei L S, et al. J Beijing Med Univ, 1991, 23(4):329
5，李荣芷，等.北京医科大学学报，1991，23(6)：473
6，何庆云，等.北京医科大学学报，1989，21(3)：225
7，鄂 征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1993：185
8，李明春，等.中国生化药物杂志，1999，20(5)：233
收稿1999-09-20, 百拇医药
单位：李明春 梁东升 许自明(中国人民解放军401医院药剂科 青岛 266071)；雷林生 杨淑琴 孙莉莎(第一军医大学药理教研室)
关键词：灵芝；灵芝多糖；巨噬细胞；蛋白激酶A
中草药000518 摘 要 为观察灵芝多糖(GLB7)体外对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)蛋白激酶A(PKA)活性的影响，采用反相离子对高效液相色谱法测定MΦ中RKA活力。结果表明GLB7(40 mg/L)能引起小鼠腹腔MΦ中PKA活性明显升高，10 min达峰值，30 min恢复到基础水平。提示灵芝多糖的免疫增强作用与其增强MΦ中PKA活性有关。
Effects of Ganoderma (Ganoderma lucidum) Polysaccharide on PKA Activity of
, 百拇医药
Murine Peritoneal Macrophages
Li Mingchun, Liang Dongsheng and Xu Ziming
(Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA Qingdao 266071)
Lei Linsheng, Yang Shuqin and Sun Lisha
(Department of Pharmacology, the First Military Medical University)
Abstract To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharide (GLB7) on protein kinase A (PKA) activity of murine peritoneal macrophages. A new ionpair RP-HPLC method was used to determine the activty of PKA in cells. The results showed that GLB7 (40 mg/L) activated the PKA of murine peritoneal macrophages, to a peak value within 10 min, and then recovered to its basic level after 30 min. This result indicated that GLB7 may act as an immunopoteniator of PKA in murine peritoneal macrophages.
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Key words Ganoderma lucidum (Leyee.ex Fr.) Karst Ganoderma lucidum polysaccharide macrophage protein kinase A (PKA)
灵芝多糖是灵芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst的主要活性成分。以往实验证明灵芝多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用，它能增强小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)的吞噬功能，促进混合淋巴细胞培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性以及促进白细胞介素2的分泌等[1～4]。但灵芝多糖的免疫作用机制尤其是对免疫细胞的信号转导过程有何影响尚不清楚。本文利用反相离子对高效液相色谱测定技术，观察灵芝多糖对小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶A(PKA)的影响，以探讨灵芝多糖的免疫调节作用机制。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 药品与试剂：灵芝多糖(GLB7)，按文献方法提取[5，6]，化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖，糖苷键连接方式以β(1→4)为主，稍多α(1→6)，分子量9 000。RPMI-1640培养基，为Gibco产品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程材料研究所产品。Sucrose、DTT、Leupetin、Histone (Ⅲ-s)、PM-SF、ATP、ADP、AMP、cAMP均为Sigma产品。甲醇、PiCA，皆为国产色谱纯。
1.2 动物：BALB/c纯系小鼠，♀不限，8周龄，体重18～22 g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞的培养：按文献方法[7]无菌取小鼠腹腔MΦ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为109～1010/L，接种于多孔培养板中，置于含5%CO2、95%空气孵箱中，37 ℃孵育24 h。对照组皆以RPMI-1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
, 百拇医药
1.4 RKA活性测定[8]
1.4.1 PKA的制备：于培养的细胞体系中加入200 μL PKA提取液，内含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, DTT 2 mmol/L, Leupetin 5 mg/L, PMSF 1 mmol/L, Sucrose 200 mmol/L, CaCl2 1 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L。冰浴下超声粉碎。900×g离心5 min，去除碎片和胞核，得上清即为胞浆组分和膜性组分，以此用于测定PKA总活力。以上操作皆于4 ℃以下进行。
1.4.2 PKA活性测定：用反相离子对高效液相色谱法测定[8]。色谱条件：C18柱；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液(20∶80，pH7.0，内含5 mmol/L PiCA)；流速：1 mL/min；检测波长：259 nm；柱温：室温；0.01AUFS、进样量20 μL。PKA反应体系中包括PKA反应液，内含：Tris-HCl (pH7.4) 20 mmol/L, MgCl2 5 mmol/L,组蛋白(Histone,Ⅲ-s) 1 g/L, DTT 2 mmol/L, ATP 0.5 mmol/L, cAMP 2 μmol/L和适量酶液(按蛋白含量计)，反应总体积为1 mL。先将除酶液以外的其它溶液混匀，30 ℃预热5 min，再加入酶液起始反应。反应开始后于30 ℃水浴摇床中准确保温10 min，立即置于沸水浴中1 min终止反应；冷却后离心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 mL氯仿-甲醇(2∶1)混合物，振荡1 min，抽提脂溶性物质，200×g离心5 min；小心吸出水层，其中含ATP、ADP和AMP。重复前步骤处理1次，合并提取液，低温冻存待测。
, http://www.100md.com
1.4.3 蛋白含量测定：按Lowry法测定。
1.4.4 PKA活力定义：一个酶活力单位相当于每分钟使Histone (Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。
2 结果
2.1 反相离子对HPLC法测定PKA：在上述色谱条件下，ATP、ADP和AMP三种物质可呈现良好的分离，在样品测定中，杂质峰不影响ATP的测定(图1)。
A-标准品 B-样品
图1 反相离子对HPLC法测定MΦ中PKA色谱图
2.2 GLB7对小鼠MΦ中PKA活性的影响：以40 mg/L GLB7与MΦ一起孵育不同时间后，测定PKA总活力。结果显示：GLB7可明显增强小鼠腹腔MΦ中PKA总活力，10 min达到峰值，至30 min恢复到基础水平(图2)。在10 min时GLB7与PKA的量效关系具有一定浓度依赖性(r=0.878 9，表1)，实验测得PKA的基础总活力为(80.93±4.52) nmol/(min.mg)(n=6，
±s)。, 百拇医药
A-实验组； B-对照组； GLB7浓度为40mg/L
图2 GLB7对小鼠腹腔MΦ PKA活性的影响时程
表1 GLB7对小鼠MΦ PKA活性的影响(n=6，
±s) GLB7(mg/L)
PKA总活性(nmol/min.mg)
实验组
对照组
10
, 百拇医药
288.14±11.81
81.32±7.45
20
377.19±13.38
80.07±5.47
40
442.71±13.45
80.84±9.41
80
489.25±19.28
79.89±11.26
, 百拇医药
160
537.74±21.25
87.04±10.37
与对照组比较：P<0.01
3 讨论
关于蛋白激酶的测定方法，目前国内外一般采用32P-γ-ATP磷酸化组蛋白法测定PKA活力。虽然同位素法灵敏度高，但存在放射性污染，加之条件要求高，不易进行。以HPLC法测定PKA的活性，不仅避免了同位素污染，而且方法简便、重现性好(RSD=0.18%)、准确性及灵敏度高(回收率99.63%)。其测定原理是：ATP在PKA反应体系中作为提供磷酸的物质，使底物磷酸化，同时降解为ADP和(或)AMP，其中ATP的消耗量与PKA之活力成正比。
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蛋白激酶是催化体内蛋白磷酸化的酶类，而蛋白磷酸化则是体内各种生物反应最终起作用的通路。PKA是一类cAMP依赖性蛋白激酶，是整个cAMP作用的分子基础，在真核细胞内几乎所有cAMP的作用都是通过活化PKA，从而使底物蛋白发生磷酸化而实现。本实验证明灵芝多糖可引起小鼠腹腔巨噬细胞PKA活性明显升高，提示其免疫增强作用可能与活化PKA有关。但其活化途径仍需进一步研究。
Add ress: Li Mingchun, Department of Pharmacy, No.401 Hospital of PLA, Qingda o
国家自然科学基金资助项目 No/39400165
李明春 男，副主任药师。1987年毕业于第二军医大学药学系，获学士学位：1998年毕业于 第一军医大学，获药理学硕士学位，研究方向为免疫药理。近年来在国内外期刊上发表论文 10余篇，获军队科技成果奖6项。现主要从事临床药理学研究工作。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，林志彬.北京医科大学学报，1992，24(4)：271
2，雷林生，等.基础与临床，1992，12(2)：59
3，Lei L S, et al. Acta Pharmaceutical Sinica, 1992,27(5):331
4，Lei L S, et al. J Beijing Med Univ, 1991, 23(4):329
5，李荣芷，等.北京医科大学学报，1991，23(6)：473
6，何庆云，等.北京医科大学学报，1989，21(3)：225
7，鄂 征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1993：185
8，李明春，等.中国生化药物杂志，1999，20(5)：233
收稿1999-09-20, 百拇医药