HBV感染者肝细胞凋亡与乙型肝炎表面抗原双染色研究
作者：赵西平 杨东亮 唐振亚 沈汉馨 郝连杰
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院
关键词：肝炎，乙型；凋亡；乙型肝炎表面抗原
中华传染病杂志980105 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎肝细胞凋亡与病毒感染的关系。方法 应用原位末端标记技术和免疫组化方法对一组乙肝患者肝细胞凋亡和乙肝表面抗原(HBsAg)表达状况同时进行了检测。结 果 受检的8例乙型肝炎患者肝组织中均可检出凋亡细胞，阳性信号位于细胞核以及肝窦内之凋亡小体中；阳性细胞在肝细胞索多散在分布，在肝细胞坏死灶中亦可检出凋亡细胞；凋亡多发生于病毒抗原弱表达细胞，而大多数抗原阳性细胞未检测到凋亡信号，此外，少数凋亡细胞HBsAg呈阴性。结 论 乙型肝炎患者感染和未感染病毒的肝细胞均可发生凋亡，但凋亡只在少数细胞发生。
Double labelling detection of apoptosis and hepatitis B surface antigen in liver tissue of patients with hepatitis B Zhao Xiping, Yang Dongliang, Hao Lianjie, et al. Clinical Immunology Research Unit, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective In order to investigate the apoptosis of hepatocytes and its relationship with viral infection. Methods Apoptosis and hepatitis B surface antigen (HBsAg) were detected in the liver tissue of patients with hepatitis B virus (HBV) infection using in situ end-labeling and immunohistochemical method, respectively. Results The results showed that apoptosis could be detected in the liver tissue of all the 8 cases with hepatitis B and the positive signal located in the nucleus of hepatocyte as well as in the apoptotic bodies which existed in sinosoid. The apoptotic cells were usually scattered in hepatic cords, which could be also identified in the necroinf lammatory areas. With the double labelling detection of apoptosis and HBsAg, it was found that apoptosis usually occured in cells with relatively weak expression of viral antigen, most of the HBsAg positive cells did not undergo apoptosis. On the other hand, apoptosis could also occur in HBsAg negative hepatocytes. Conclusion These results indicated that both in the viral infected and uninfected liver cells apoptosis could occur, but only in a minority of liver cells.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Apoptosis HBsAg
程序性细胞死亡或称凋亡(apoptosis)是细胞自主死亡的过程，在组织发生、免疫系统克隆选择、机体内环境稳定等诸多方面有着广泛的生物学意义[1]。在某些疾病，如肿瘤、艾滋病等发病机制中也具有重要意义[2，3]。早已发现，病毒性肝炎患者肝细胞较常发生凋亡，但肝细胞凋亡发生机制不详。本研究采用原位末端标记和免疫组织化学技术对一组乙型肝炎患者肝细胞凋亡及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)表达状况进行了研究，以探讨细胞凋亡与病毒感染的关系。
材料与方法
一、标本来源
8例HBV感染者，包括慢性肝炎2例，肝炎肝硬化6例，为本院传染科和外科1994年5～12月住院患者。男5例，女3例，平均年龄45.4±8.8(21～54)岁，其血清HBsAg阳性，HCV标志阴性。肝组织为穿刺(肝炎患者)或手术中(肝硬化患者)取材，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后制成4μm连续切片各4张，片1常规HE染色作病理诊断，片2和3分别检测HBsAg和凋亡细胞，片4进行HBsAg和凋亡的双染色研究。
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二、方法
HBsAg采用PAP法检测，鼠抗HBsAg购自Dako公司；凋亡细胞采用原位末端标记方法以Onco公司生产的Apop Tag试剂检测，具体操作为：切片常规脱蜡水化，蛋白酶K(1mg/ml，PBS配制)室温消化15分钟(浓度和时间需根据组织固定时间调整)，水洗，2%H2O2室温阻断内源酶15分钟，PBS洗后加1×平衡缓冲液室温平衡1分钟，加反应缓冲液(含TdT酶和dig-dUTP)，37℃，1小时，入中止缓冲液10分钟，PBS洗后加HRP标记的抗dig抗体，室温30分钟，以0.02%H2O2，0.05%DAB显色，水洗，苏木素衬染，脱水，中性树胶封片后观察。以反应缓冲液中不加TdT酶作阴性对照。
挑选3张凋亡细胞较多的切片进行凋亡和HBsAg双染色。操作过程是：按上述流程检测凋亡细胞，DAB显色后(阳性信号显棕黄色)浸入5%H2O2甲醇，室温下作用20分钟阻断残余酶活性，PBS洗后加鼠抗HBsAg，4℃过夜或37℃，30分钟，加羊抗鼠IgG,37℃，30分钟，再加鼠PAP反应，37℃30分钟；以4-氯萘酚显色(阳性信号显灰蓝色)。经核固红衬染细胞核，缓冲甘油封片观察。
, 百拇医药
结 果
一、肝组织中凋亡细胞及HBsAg检测结果
8例肝病患者肝组织中均可检出凋亡阳性细胞，阳性信号位于细胞核；阳性细胞分布于肝细胞索、中央静脉周围、小叶内坏死和小叶周边碎屑坏死处及肝窦内凋亡小体中。大多数组织中阳性细胞散布在肝小叶内，有时可见较多阳性细胞围绕中央静脉；偶尔可观察到小叶灶状或碎屑坏死部位凋亡现象较严重，可见较多阳性细胞呈灶状分布；绝大多数阳性细胞体积较小，胞浆收缩，核固缩。肝窦内阳性信号可位于枯否细胞中(图1)。
图1 凋亡细胞散布于肝小叶中，阳性信号位于胞核，苏木素衬染，400×
挑选3张凋亡细胞较多的切片在操作过程中省略TdT酶，阳性信号均消失。
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8例患者肝组织中HBsAg均为阳性，阳性信号呈胞浆或浆膜型，阳性细胞弥漫分布于肝实质中。
二、凋亡与病毒表达的关系
连续切片染色，发现大多数凋亡细胞位于病毒抗原阳性部位或其附近，少数组织中二者间无明显解剖学关系；双染色后观察，凋亡可发生于病毒抗原阳性细胞，亦可发生在抗原阴性细胞。在病毒抗原阳性部位，凋亡较多发生于抗原表达相对较弱的细胞中；大多数病毒抗原阳性细胞凋亡检测呈阴性(图2)。
图2 凋亡细胞位于HBsAg阳性部位，凋亡阳性细胞病毒抗原表达多较弱，核固红衬染，400×讨 论
本研究中，我们采用原位末端标记方法对一组乙肝患者肝细胞凋亡状况进行检测，发现阳性信号位于细胞核内，阳性细胞多呈现细胞较小、胞浆及核浓缩的形态学特点；另外，检测过程中去掉TdT酶后阳性信号消失，表明检测结果具有良好特异性。
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虽然早已注意到肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，但对细胞凋亡的意义很少给予足够重视。我们发现凋亡细胞除在肝细胞索中散在分布外，在肝细胞点、灶状及碎屑坏死灶中均可检测到，偶尔在灶状或碎屑坏死部位可检测到较多凋亡细胞。文献报道重症肝炎患者肝细胞可大量发生凋亡[4]；在慢性乙肝患者，肝细胞凋亡与肝纤维化程度呈正相关[5]。这些报道和我们的研究表明，细胞凋亡与病毒性肝炎患者肝组织病理损伤程度有一定关系。
病毒性肝炎肝细胞凋亡与病毒的关系尚不清楚。Manabe等[5]报道在肝组织嗜酸小体中可检出HBV核心抗原。本研究中，我们采用连续切片观察，发现大多数凋亡细胞位于病毒抗原阳性部位或其附近，少数组织中二者相隔较远；双染色研究进一步表明，凋亡可发生于病毒抗原阳性细胞，亦可发生在抗原阴性细胞。这些现象提示HBV可能主要通过间接途径向感染和非感染肝细胞传递死亡信号。
另一方面，许多病毒如EB病毒、腺病毒等可以抑制宿主细胞凋亡而使其更有效的复制与繁殖[6]。本研究中，我们发现凋亡细胞多系病毒抗原表达相对较弱者，而大多数抗原阳性细胞不发生凋亡，反映出HBV与宿主细胞相互作用关系的复杂性，HBV亦可能具有抑制宿主细胞凋亡的能力。已经发现HBV pX可使p53失活，而p53可介导细胞凋亡，这一机制在HBV相关性肝癌发生中具有重要意义[7]。病毒感染时肝细胞凋亡发生机制与意义有待于深入研究。
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本课题获卫生部重点学科建设基金资助
参考文献
1 Williams GT.Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis. Cell,1991,65:1097-1099.
2 季伟，斯崇文.细胞凋亡在艾滋病发病中的作用.国外医学流行病学传染病学分册，1996，23：75-77.
3 Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
4 Ryo K,Kamogawa Y,Ikeda I, et al. Fas and Fas ligand strongly expressed in liver of fulminant hepatitis patients. Hepatology,1995,22pt.2:230A.
, http://www.100md.com
5 Manabe N, Suzuki T, Kuramitsu K,et al. Apoptosis of hepatocytes highly correlates with liver fibrosis in chronic hepatitis B. Hepatology,1995;22pt.2:267A.
6 Vaux DL, Haecker G, Strasser A. An evolutionary perspective on apoptosis. Cell,1994,76:777-779.
7 Chirillo P, Natoli G, Falco M, et al. p53 status, pX induced hepatocytes transformation. Hepatology, 1995,22pt.2:157A., http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院
关键词：肝炎，乙型；凋亡；乙型肝炎表面抗原
中华传染病杂志980105 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎肝细胞凋亡与病毒感染的关系。方法 应用原位末端标记技术和免疫组化方法对一组乙肝患者肝细胞凋亡和乙肝表面抗原(HBsAg)表达状况同时进行了检测。结 果 受检的8例乙型肝炎患者肝组织中均可检出凋亡细胞，阳性信号位于细胞核以及肝窦内之凋亡小体中；阳性细胞在肝细胞索多散在分布，在肝细胞坏死灶中亦可检出凋亡细胞；凋亡多发生于病毒抗原弱表达细胞，而大多数抗原阳性细胞未检测到凋亡信号，此外，少数凋亡细胞HBsAg呈阴性。结 论 乙型肝炎患者感染和未感染病毒的肝细胞均可发生凋亡，但凋亡只在少数细胞发生。
Double labelling detection of apoptosis and hepatitis B surface antigen in liver tissue of patients with hepatitis B Zhao Xiping, Yang Dongliang, Hao Lianjie, et al. Clinical Immunology Research Unit, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
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【Abstract】 Objective In order to investigate the apoptosis of hepatocytes and its relationship with viral infection. Methods Apoptosis and hepatitis B surface antigen (HBsAg) were detected in the liver tissue of patients with hepatitis B virus (HBV) infection using in situ end-labeling and immunohistochemical method, respectively. Results The results showed that apoptosis could be detected in the liver tissue of all the 8 cases with hepatitis B and the positive signal located in the nucleus of hepatocyte as well as in the apoptotic bodies which existed in sinosoid. The apoptotic cells were usually scattered in hepatic cords, which could be also identified in the necroinf lammatory areas. With the double labelling detection of apoptosis and HBsAg, it was found that apoptosis usually occured in cells with relatively weak expression of viral antigen, most of the HBsAg positive cells did not undergo apoptosis. On the other hand, apoptosis could also occur in HBsAg negative hepatocytes. Conclusion These results indicated that both in the viral infected and uninfected liver cells apoptosis could occur, but only in a minority of liver cells.
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【Key words】 Hepatitis B Apoptosis HBsAg
程序性细胞死亡或称凋亡(apoptosis)是细胞自主死亡的过程，在组织发生、免疫系统克隆选择、机体内环境稳定等诸多方面有着广泛的生物学意义[1]。在某些疾病，如肿瘤、艾滋病等发病机制中也具有重要意义[2，3]。早已发现，病毒性肝炎患者肝细胞较常发生凋亡，但肝细胞凋亡发生机制不详。本研究采用原位末端标记和免疫组织化学技术对一组乙型肝炎患者肝细胞凋亡及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)表达状况进行了研究，以探讨细胞凋亡与病毒感染的关系。
材料与方法
一、标本来源
8例HBV感染者，包括慢性肝炎2例，肝炎肝硬化6例，为本院传染科和外科1994年5～12月住院患者。男5例，女3例，平均年龄45.4±8.8(21～54)岁，其血清HBsAg阳性，HCV标志阴性。肝组织为穿刺(肝炎患者)或手术中(肝硬化患者)取材，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后制成4μm连续切片各4张，片1常规HE染色作病理诊断，片2和3分别检测HBsAg和凋亡细胞，片4进行HBsAg和凋亡的双染色研究。
, http://www.100md.com
二、方法
HBsAg采用PAP法检测，鼠抗HBsAg购自Dako公司；凋亡细胞采用原位末端标记方法以Onco公司生产的Apop Tag试剂检测，具体操作为：切片常规脱蜡水化，蛋白酶K(1mg/ml，PBS配制)室温消化15分钟(浓度和时间需根据组织固定时间调整)，水洗，2%H2O2室温阻断内源酶15分钟，PBS洗后加1×平衡缓冲液室温平衡1分钟，加反应缓冲液(含TdT酶和dig-dUTP)，37℃，1小时，入中止缓冲液10分钟，PBS洗后加HRP标记的抗dig抗体，室温30分钟，以0.02%H2O2，0.05%DAB显色，水洗，苏木素衬染，脱水，中性树胶封片后观察。以反应缓冲液中不加TdT酶作阴性对照。
挑选3张凋亡细胞较多的切片进行凋亡和HBsAg双染色。操作过程是：按上述流程检测凋亡细胞，DAB显色后(阳性信号显棕黄色)浸入5%H2O2甲醇，室温下作用20分钟阻断残余酶活性，PBS洗后加鼠抗HBsAg，4℃过夜或37℃，30分钟，加羊抗鼠IgG,37℃，30分钟，再加鼠PAP反应，37℃30分钟；以4-氯萘酚显色(阳性信号显灰蓝色)。经核固红衬染细胞核，缓冲甘油封片观察。
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结 果
一、肝组织中凋亡细胞及HBsAg检测结果
8例肝病患者肝组织中均可检出凋亡阳性细胞，阳性信号位于细胞核；阳性细胞分布于肝细胞索、中央静脉周围、小叶内坏死和小叶周边碎屑坏死处及肝窦内凋亡小体中。大多数组织中阳性细胞散布在肝小叶内，有时可见较多阳性细胞围绕中央静脉；偶尔可观察到小叶灶状或碎屑坏死部位凋亡现象较严重，可见较多阳性细胞呈灶状分布；绝大多数阳性细胞体积较小，胞浆收缩，核固缩。肝窦内阳性信号可位于枯否细胞中(图1)。
图1 凋亡细胞散布于肝小叶中，阳性信号位于胞核，苏木素衬染，400×
挑选3张凋亡细胞较多的切片在操作过程中省略TdT酶，阳性信号均消失。
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8例患者肝组织中HBsAg均为阳性，阳性信号呈胞浆或浆膜型，阳性细胞弥漫分布于肝实质中。
二、凋亡与病毒表达的关系
连续切片染色，发现大多数凋亡细胞位于病毒抗原阳性部位或其附近，少数组织中二者间无明显解剖学关系；双染色后观察，凋亡可发生于病毒抗原阳性细胞，亦可发生在抗原阴性细胞。在病毒抗原阳性部位，凋亡较多发生于抗原表达相对较弱的细胞中；大多数病毒抗原阳性细胞凋亡检测呈阴性(图2)。
图2 凋亡细胞位于HBsAg阳性部位，凋亡阳性细胞病毒抗原表达多较弱，核固红衬染，400×讨 论
本研究中，我们采用原位末端标记方法对一组乙肝患者肝细胞凋亡状况进行检测，发现阳性信号位于细胞核内，阳性细胞多呈现细胞较小、胞浆及核浓缩的形态学特点；另外，检测过程中去掉TdT酶后阳性信号消失，表明检测结果具有良好特异性。
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虽然早已注意到肝细胞凋亡是病毒性肝炎较常见的病理改变，但对细胞凋亡的意义很少给予足够重视。我们发现凋亡细胞除在肝细胞索中散在分布外，在肝细胞点、灶状及碎屑坏死灶中均可检测到，偶尔在灶状或碎屑坏死部位可检测到较多凋亡细胞。文献报道重症肝炎患者肝细胞可大量发生凋亡[4]；在慢性乙肝患者，肝细胞凋亡与肝纤维化程度呈正相关[5]。这些报道和我们的研究表明，细胞凋亡与病毒性肝炎患者肝组织病理损伤程度有一定关系。
病毒性肝炎肝细胞凋亡与病毒的关系尚不清楚。Manabe等[5]报道在肝组织嗜酸小体中可检出HBV核心抗原。本研究中，我们采用连续切片观察，发现大多数凋亡细胞位于病毒抗原阳性部位或其附近，少数组织中二者相隔较远；双染色研究进一步表明，凋亡可发生于病毒抗原阳性细胞，亦可发生在抗原阴性细胞。这些现象提示HBV可能主要通过间接途径向感染和非感染肝细胞传递死亡信号。
另一方面，许多病毒如EB病毒、腺病毒等可以抑制宿主细胞凋亡而使其更有效的复制与繁殖[6]。本研究中，我们发现凋亡细胞多系病毒抗原表达相对较弱者，而大多数抗原阳性细胞不发生凋亡，反映出HBV与宿主细胞相互作用关系的复杂性，HBV亦可能具有抑制宿主细胞凋亡的能力。已经发现HBV pX可使p53失活，而p53可介导细胞凋亡，这一机制在HBV相关性肝癌发生中具有重要意义[7]。病毒感染时肝细胞凋亡发生机制与意义有待于深入研究。
, http://www.100md.com
本课题获卫生部重点学科建设基金资助
参考文献
1 Williams GT.Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis. Cell,1991,65:1097-1099.
2 季伟，斯崇文.细胞凋亡在艾滋病发病中的作用.国外医学流行病学传染病学分册，1996，23：75-77.
3 Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
4 Ryo K,Kamogawa Y,Ikeda I, et al. Fas and Fas ligand strongly expressed in liver of fulminant hepatitis patients. Hepatology,1995,22pt.2:230A.
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5 Manabe N, Suzuki T, Kuramitsu K,et al. Apoptosis of hepatocytes highly correlates with liver fibrosis in chronic hepatitis B. Hepatology,1995;22pt.2:267A.
6 Vaux DL, Haecker G, Strasser A. An evolutionary perspective on apoptosis. Cell,1994,76:777-779.
7 Chirillo P, Natoli G, Falco M, et al. p53 status, pX induced hepatocytes transformation. Hepatology, 1995,22pt.2:157A., http://www.100md.com