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编号:10273673
右旋糖酐40、70对红细胞与内皮细胞粘附的影响*
http://www.100md.com 《生物医学工程学杂志》 1998年第3期
     作者:黄 勋1 陈槐卿2 王 玲2 林 毅2

    单位:1 (华西医科大学 基础医学院测试中心,成都 610041);2 (华西医科大学 生物医学工程研究室,成都 610041)

    关键词:红细胞;内皮细胞;右旋糖酐;粘附

    生物医学工程学杂志980308 内容摘要 采用流室显微观察系统,定量研究右旋糖酐40(DX40)和右旋糖酐70(DX70)对红细胞与内皮细胞动态粘附特性的影响。统计分析处理数据,得到反映切应力与细胞间动态粘附数关系的经验公式及粘附特征常数a,b值。a值反映红细胞的初始粘附数,b值反映随切应力增大,粘附数减小的速率。DX70实验组的a值大于DX40组的,而b值的情况相反。故结果显示切应力越大,粘附的红细胞越少;DX40使红细胞的粘附明显减少;DX70使红细胞粘附显著增加。由此提示不同长度的细胞桥接分子对红细胞的粘附影响不同,且临床上选用DX40作血浆扩容剂较DX70优越得多。
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    Influence of Dextran 40 and Dextran 70 on the Adhesion

    of Erythrocytes to Endothelial Cells

    Huang Xun1 Chen Huaiqing2 Wang Ling2 Lin Yi2

    1(Analytical Test Center,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)

    2(Research Unit of Biomedical Engineering,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
, 百拇医药
    Abstract Adopting the flow chamber realtime microrecordation system,we studied the dynamic effects of dextran 40(DX40) and dextran 70(DX70) on the adhesion of erythrocytes to monolayer of cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).The results demonstrated that erytherocytes pretreated with DX40 adhered to HUVEC less than the erythrocytes of the control group did,but DX70 increased the number of erythrocytes adhering to HUVEC.The higher the concentration of DX70 was,the more the erythrocytes pretreated with DX70 adhered to HUVEC.When shear stress increased,the decrease rate of the number of erythrocytes (pretreated with DX70) adhering to HUVEC declined with the increase of DX70 concentration.These indicate that DX40 as an expander of blood plasma is better than DX70.
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    Key words Erythrocyte Endothelial cell Dextran Adhesion

    Sugihara等人[1]把血管内红细胞与内皮细胞的各种粘附按其机理不同分为七种,其中第二种是红细胞与内皮细胞由非特异的桥接分子介导的粘附。如血浆中的纤维蛋白原[2]、白蛋白、凝集素[3]等介导的粘附是一种较强的粘附,易造成毛血管的阻塞[4]。但桥接分子长度,对粘附的影响,没见报道。本文作者选用分子长度不同的右旋糖酐大分子物质来研究桥接分子的长短对细胞间动态粘附的影响,也为临床上选用DX40作血浆扩容剂提供了一个理论依据。

    1 材料和方法

    1.1 实验系统

    实验系统[5]包括灌流部份(贮液瓶、输液泵及导管),流室,显微观察部份(相差显微镜,摄录像机)等。实验时,向保持37℃恒温的贮液瓶充入气体(95%O2+5%CO2),流室温度在33~37℃之间,且流室中的流动满足充分发展的二维层流的条件,通过调节精密输液泵来得到需要的流室壁切应力。在显微摄录像系统上计数每个视野下粘附的红细胞。
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    1.2 胎儿脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养和鉴定

    按文献[6]的方法培养和鉴定内皮细胞。选用4~9代的内皮细胞做实验。内皮细胞鉴定法:相差显微镜下细胞呈多边形,隐约见椭圆形核和细胞边界;透射电镜下观察,胞浆内有Weibel-Palade小体。

    1.3 实验步骤

    1.3.1 DX40对红细胞与内皮细胞动态粘附数的影响 从10名健康人肘前静脉各抽取空腹血,分别注入有EDTA抗凝剂的10支试管中,1500 rpm离心30 min,吸出血浆等。分离出的红细胞再用生理盐水反复洗涤三次。最后用生理盐水配成HCT 1%的红细胞悬液备用,pH为7.4。

    从备用的10个健康人的红细胞悬液(每个血样作为单独实验样品)各取2 ml置于2支试管中,再加入含有DX40的营养液,DX40的最终浓度为10 g/L、20 g/L,HCT为0.5%。在无菌条件下将长满单层HUVEC的半块盖玻片放入流室底部凹槽,装好流室,再缓慢地向流室注入含有10 g/L或20 g/L DX40,HCT 0.5%的红细胞悬液,随即把流室放入37℃ CO2孵箱中静置30 min,取出流室,固定在显微镜载物台上。
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    贮液瓶内灌流液配方为1640营养液(内含5%小牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素,pH7.4),实验前须滤菌消毒向灌流液中加入DX40使其终浓度为10 g/L。

    先用τ=0.05 Pa的切应力作用15 min,去除未粘附的红细胞。然后依次用τ=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0单位均为Pa的切应力作用于粘附的红细胞,每次2 min;每次剪切之间间隔2 min,以便摄取每种切应力下10个随机视野里的粘附图像,再对每幅图像上的粘附红细胞进行计数。

    对照组红细胞不用右旋糖酐处理,且灌注液不加DX40,其余操作步骤同上。

    1.3.2 DX70对红细胞与内皮细胞动态粘附数的影响 实验步骤和方法完全类同于DX40实验组,只是把DX40换成DX70,且DX70的浓度系列为10、20、40 g/L。故DX70实验组共分为10 g/L组、20 g/L组、40 g/L组等三个实验组。
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    2 实验结果

    2.1 DX40使红细胞与内皮细胞粘附减少

    本文共取得10个健康人的红细胞动态粘附数(视野里的平均粘附数)和DX40(两种浓度)影响下的红细胞动态粘附数(见表1)。

    由表1可知:各实验组的红细胞粘附数随切应力增大迅速减少,所以切应力是决定红细胞粘附数的最重要的因素;在同一切应力下DX40二个浓度组的红细胞粘附数显著减少,且DX40浓度较大组的红细胞粘附数最少,可见DX40使红细胞粘附显著减少(P<0.05)。

    2.2 DX70使红细胞与内皮细胞粘附极显著增加

    10个健康人的红细胞在DX70(三种浓度影响下的红细胞动态粘附数列于表1。由表1可知:各DX70实验组的红细胞粘附数随切应增大迅速减少;在同一切应力下DX70三个浓度组的红细胞粘附数都极显著增加(P<0.01),且DX70浓度最大组的红细胞粘附数最多,故DX70使红细胞粘附极显著增加。
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    2.3 在各切应力下,红细胞与EC的粘附

    把表1各实验组数据及联线绘于图1上。

    表1 DX40、DX70对红细胞与内皮细胞粘附的动态影响

    Table 1 The dynamic effects of DX40,DX70 on the adherence of RBCs to HUVEC (n=10,x±s,unit:pieces/field of vision) Group

    Number of RBCs adherence at various shear stress

    0.1Pa

    0.2Pa

    0.3Pa
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    0.4Pa

    0.5Pa

    1.0Pa

    1.5Pa

    2.0Pa

    DX40

    20(g/L)

    4.5

    ±2.1

    3.5

    ±1.8

    3.0

    ±1.6
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    1.9

    ±1.5

    0.9

    ±1.1

    0.5

    ±0.7

    0.1

    ±0.3

    0.1

    ±0.3

    10(g/L)

    6.0

    ±1.6
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    4.2

    ±1.3

    3.3

    ±1.4

    2.5

    ±1.4

    1.5

    ±1.0

    0.9

    ±0.8

    0.4

    ±0.7

    0.1
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    ±0.3

    Control

    (normal)

    9.6

    ±2.8

    7.3

    ±2.5

    5.8

    ±1.4

    3.5

    ±1.1

    1.9

    ±1.8
, 百拇医药
    1.2

    ±1.1

    0.8

    ±0.9

    0.4

    ±0.7

    DX70

    10(g/L)

    19.6

    ±8.5

    15.5

    ±5.4

    11.5
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    ±3.0

    8.9

    ±2.0

    6.4

    ±2.0

    3.2

    ±0.9

    2.1

    ±0.9

    1.0

    ±0.8

    20(g/L)

    36.2
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    ±12.4

    30.2

    ±10.3

    26.6

    ±7.8

    19.5

    ±5.5

    14.4

    ±4.4

    10.6

    ±6.6

    8.1

    ±1.4
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    2.3

    ±0.8

    40(g/L)

    79.3

    ±18.1

    70.3

    ±13.6

    63.4

    ±11.5

    52.6

    ±6.6

    42.7

    ±4.8
, 百拇医药
    29

    ±2.8

    21.3

    ±2.7

    14.5

    ±4.0

    图1 DX70、DX40 对红细胞与内皮细胞动态粘附的影响

    Fig 1 The dynamic effets of DX70,DX40 on the number of RBCs adhering to HUVEC

    由图1,可直观的看出在0.1 Pa切应力(可视为极低切应力)下,40 g/L DX70组红细胞粘附最多,20 g/L DX40组红细胞粘附最少;在其它各切应力下,也是40 g/L DX70组粘附最多,20 g/L DX40组粘附最少,呈依次减少状;而红细胞粘附个数随切应力增大,40 g/L DX70组减少最多,20 g/L DX40组减少最少,呈依次减少状。
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    把表1的所有各实验组的数据进行以e为底的指数曲线拟合,得红细胞与血管内皮细胞动态粘附经验公式:

    N=exp(a-bx)(1)

    式中:N为显微镜视野里粘附的红细胞数;x为流室壁上的切应力(单位是Pa);a和b分别为红细胞粘附特征常数。a,b及各个动态粘附经验公式的R2值见表2。从表2可见,从左到右a值逐渐增大,而b值逐渐减少,故a值与b值呈负相关。

    表2 被DX40、DX70 处理过的红细胞的动态粘附特征曲线的特征常数

    Table 2 The dynamic curves effective character numbers of DX40,DX70 on RBCs adhesion to EC
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    3 讨 论

    右旋糖酐是一种中性多糖类的大分子物质,其分子量越大,分子就越长,如DX40分子长度为36 nm,DX70分子长度53 nm。它们能沉积在红细胞膜上,使红细胞聚集[7]。我们的实验显示,DX70也能使红细胞的粘附显著增加(P<0.01)。这可能是因为流室中的DX70分子两端分别与红细胞和内皮细胞连结起来,使红细胞与EC间的粘附力增强;又因DX70分子较长而增加粘附细胞间的距离,导致胞间的静电排斥能指数样下降[7]。这两个因素共同作用,使红细胞与内皮细胞间的净粘附力急剧增大,所以红细胞的粘附极显著增加。随DX70浓度增大,红细胞与内皮细胞间的桥接分子增多,红细胞的粘附数显著增加。但细胞间桥接分子增加到何种程度时,红细胞的粘附数不再增加,甚至减少,还有待进一步研究。

    灌流液中加入DX40时,DX40也能沉积到红细胞与内皮细胞间。我们的实验显示,DX40却使红细胞的粘附数显著减少。这可能是因为,与DX40介导红细胞聚集情况类似,DX40分子短,胞间距离小,胞间静电排斥能指数样增加,DX40又使细胞表面电位能升高,导致胞间静电排斥能增大[7]。这样细胞间的净粘附力反而减弱。在切应力的作用下,红细胞的粘附数更少。当DX40浓度增加时,细胞的表面电位能持续升高,所以在同样的切应力下,粘附的红细胞更少。实验结果提示,从红细胞粘附方面来看,在临床上使用DX40作血浆扩容剂较DX70要好得多。
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    由粘附经验公式(1)和表2可知,粘附特征参数a值与初始粘附数有关,b值表征红细胞粘附数随切应力增大而减少的速率。由DX介导粘附时,a值和b值呈负相关——初始粘附越多,在切应力增大时,红细胞粘附数减少的速率越慢。这个粘附特性说明,在低切应力下粘附数大时,红细胞整体的平均粘附力就越大。切应力增大时,剪切下的红细胞数的比例越小。我们仅得出a和b的实验值,而a和b的理论表达式,还有待进一步研究。要注意的是DX和纤维蛋白原,凝集素,白蛋白等桥接分子介导粘附的键能是否一样,还有待研究。

    * 国家自然科学基金资助课题,并得到纽约中华医学基金会部分资助

    参 考 文 献

    1 Sugihara K, Hebble RP.Multiple mechanism of sickle erythrocyte adherence to vascular endothelial cells.Clin Hemorheol,1992;12∶185
, 百拇医药
    2 Wauter JL,Pintigny D,Wautier BP et al.Fibrinogen a modulator of erythrocyte adhesion to vascular endothelium.J Lab Clin Med,1983;101∶911

    3 Rehfeld SJ.The interaction of albumin and concanaval in A with normal and sickle human erythrocytes.Biochem Biophy Res Immun,1975;66∶586

    4 Hebble RP,Boogaerts MAB,Eaton JW et al.Erythrocyte adherence to endothelium in sickle-cell anemia.A possible determinant of disease severity.New Engle J Med,1980;302∶992
, http://www.100md.com
    5 陈槐卿,丁肇华,王 玲等.切应力作用下脐静脉内皮细胞的变形特性.华西医科大学学报,1995;26(1)∶181

    6 Jaffe EA,Nachman RL.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins:Identification by morphologic and immunologic criteria.J Clin Invest,1973;52∶2745

    7 陈槐卿著.血液流变学及其临床应用.成都:四川教育出版社,1989∶120

    (收稿:1997-04-07), http://www.100md.com(黄 勋1 陈槐卿2 王 玲2 林 毅2)