眼组织的透射电镜制样方法
作者：杨 果 唐小佳 干德全
单位：华西医科大学 电子显微镜室，成都 610041
关键词：眼组织；透射电子显微镜；电镜样品制备
生物医学工程学杂志990227 摘要 介绍一种眼组织透射电子显微镜标本制备方法。组织先用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液预固定，1%四氧化锇固定液后固定，丙酮逐级脱水，延长Epon812包埋液的浸透时间并包埋，用玻璃刀或钻石刀作超薄切片，醋酸铀及枸椽酸铅双重染色，H600-Ⅳ型透射电子显微镜观察。此方法的优点在于眼组织各层超微结构保存良好，没有损伤及变性，我们对该方法的操作要点作了讨论。
A Method of Preparing the Section of Eye Tissue for
Transmission Electron Microscopy
, http://www.100md.com
Tang Guo Tang Xiaojia Gan Dequan
Electron Microscopy Laboractory, West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041
Abstract A method of preparing the section of eye tissue for transmission electron microscopy (TEM) is recommended. The tissue was prefixed with a mixed solution of 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde and followed by softening in 3% EDTA solution for 20 minutes, then the tissue was fixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in series acetone, infiltrated in Epox 812 for a longer, and embeded.Ultrathin sections were cut with glass knives or diamond knife, stained with uranyl acetate and lead citrate and examined with H600-Ⅳ. The advantage of this method is that the ultrastructures of tissues are well preserved without any damage and distortion. The main points of the procedure of preparation have been discussed.
, 百拇医药
Key words Eye tissue Transmission electron microscopy Preparation of specimen for TEM
1 前 言
眼组织结构复杂，眼球外形近似球体，外层巩膜为致密的结缔组织而内层又是较柔软的视网膜，易扭曲或剥离，角膜含大量纤维组织，眼球腔内有胶状玻璃体。根据眼球的特点，其制样难度极大，经过多年的探索，作者参考了国内外文献[1～4]，在制样过程中采取了相应的方法，获得了满意的结果，现报道如下：
2 材料和方法
2.1 材料
将大白鼠麻醉或断头后，立即摘去眼球，并保留视神经，其过程在2 min之内完成。
, 百拇医药
2.2 方法
2.2.1 取材与预固定 将摘出的眼球用0.1 M磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)洗净表面的血液，立即浸入4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液中，用4号针头沿赤道部将眼球打一小孔，将针头轻轻退出约1 mm，用空针缓缓推入预固定液，在预固定12 h后，沿赤道部将眼球割成二半，分别取出各种组织，组织切成1 mm3大小，继续固定2 h，然后用3%EDTA-Na2软化20 min。
2.2.2 清洗 0.1M磷酸缓冲液反复清洗5次，每次10～20 min，并浸泡过夜。
2.2.3 后固定 1%四氧化锇固定液固定2 h(4 ℃)。
2.2.4 脱水 用30%、50%、70%的丙酮各脱水5～10 min(4℃)，90%的丙酮脱水10～15 min(室温)，100%丙酮脱水40 min(换三次)。
, 百拇医药
2.2.5 浸透 用Epon812包埋液+丙酮(3∶1)浸泡45 min(35 ℃)；纯Epon812包埋液浸泡2 h(45 ℃)。
2.2.6 包埋 将经以上步骤处理的样品，放置定向包埋模具中，方向应为保持所需眼组织的全层结构为准。加入新鲜的Epon812包埋液，使组织完全浸泡于包埋液中。
2.2.7 聚合 在45 ℃下聚合10 h，在60 ℃下聚合12 h。
2.2.8 修块、半薄切片、超薄切片、染色 按常规进行，H600-Ⅳ型透射电镜观察。
3 结果与结论
3.1 结果
用该方法制备的样品，包埋块硬度适当，无过硬过脆现象，在切片过程中，切片韧性较好，切片厚度可达500～600 nm，切片颜色为浅黄色，无散片现象，包埋液浸透良好。
, http://www.100md.com
超薄切片在电镜下观察，各种组织的超微结构清晰可见，如视网膜中的各层组织，角膜上皮组织，虹膜组织等。在视网膜色素上皮细胞中可见，细胞核、色素颗粒、线粒体。角膜上皮细胞中可见细胞核、核仁、粗面内质网、线粒体、微丝等，胞间可见桥粒。其超微结构保存良好(图1、2)。
图1 透射电镜下示视网膜色素上皮细胞，细胞中线粒体(Mi)、内质网(ER)、细胞核(N)及色素颗粒(↑)等细胞器清晰可见。EM×8000
Fig 1 Retinal pigmented epithelial cell，The mitochondria (Mi),endoplasmic reticulum (ER)，nucleus(N),melanosome(↑) and other organells in the cell are clearly shown.EM×8000
, http://www.100md.com
图2 透射电镜下示角膜上皮细胞，细胞中可见细胞核(N)、内质网(ER)、线粒体(Mi)及微丝(MF)等细胞器，细胞间可见桥粒(De)。EM×12,000
Fig 2 Corneal epithelium，There are distinet nucleus(N),endoplasmic reticulum(ER),mitochondria(Mi),microfilament(MF),intercellular desmosome(De) and other organells.Em×12,000
3.2 讨论
取材与预固定是眼组织透射电镜制样的关键，我们采用的沿赤道部位打孔的方法，可使内腔的压力降低，可以使预固定液充满眼球内腔，使内层组织固定充分，又可防止视网膜组织的卷曲或脱落。取材时不应将视神经保留，这样对二次取材确定组织的方位有所帮助。操作时应注意取材时应尽快将其浸入固定液，以防止出现细胞自溶现象，整个操作应动作轻，切忌损伤视网膜。对含有大量纤维的角膜可采取3%EDTA-Na2软化，对切片质量及组织反差都有所提高。固定液应采用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液，该固定液的穿透力较单纯戊二醛固定液强，特别对有致密的结缔组织固定较好。脱水应根据不同的组织而定时间，如视网膜组织脱水时间应相应缩短，以防止过度脱水，组织扭曲变形变脆，如角膜组织含有大量纤维组织，其脱水时间应适当延长，以保证脱水充分。包埋液浸透应适当延长浸透时间，勤搅动，用以保证浸透充分。
, 百拇医药
参考文献
1 罗清礼.视网膜色素变性的色素上皮细胞光镜和电镜观察.眼底病，1991；7∶150
2 Itoi M, Kodama R, Tokayama S. Ultrastructural observation of typical gap junctions in human foetal lens nucleus. Curr Eye Res，1991; 10∶1
3 Vinuesa MJ， Hernandez-Galiea E, Barahona JM. Ultrastracture study of Schlemm's canal-trabecular mashwork in traumatic galucoma. Chibret Int J Ophthalmol, 1990; 7(2)∶17
4 Tousimis AJ， Fine BS. Ultrastructure of the iris: an electron microscopic study. Am J Opthalmol, 1959; 48∶397
收稿：1998-04-10, http://www.100md.com
单位：华西医科大学 电子显微镜室，成都 610041
关键词：眼组织；透射电子显微镜；电镜样品制备
生物医学工程学杂志990227 摘要 介绍一种眼组织透射电子显微镜标本制备方法。组织先用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液预固定，1%四氧化锇固定液后固定，丙酮逐级脱水，延长Epon812包埋液的浸透时间并包埋，用玻璃刀或钻石刀作超薄切片，醋酸铀及枸椽酸铅双重染色，H600-Ⅳ型透射电子显微镜观察。此方法的优点在于眼组织各层超微结构保存良好，没有损伤及变性，我们对该方法的操作要点作了讨论。
A Method of Preparing the Section of Eye Tissue for
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Tang Guo Tang Xiaojia Gan Dequan
Electron Microscopy Laboractory, West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041
Abstract A method of preparing the section of eye tissue for transmission electron microscopy (TEM) is recommended. The tissue was prefixed with a mixed solution of 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde and followed by softening in 3% EDTA solution for 20 minutes, then the tissue was fixed in 1% osmium tetroxide, dehydrated in series acetone, infiltrated in Epox 812 for a longer, and embeded.Ultrathin sections were cut with glass knives or diamond knife, stained with uranyl acetate and lead citrate and examined with H600-Ⅳ. The advantage of this method is that the ultrastructures of tissues are well preserved without any damage and distortion. The main points of the procedure of preparation have been discussed.
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Key words Eye tissue Transmission electron microscopy Preparation of specimen for TEM
1 前 言
眼组织结构复杂，眼球外形近似球体，外层巩膜为致密的结缔组织而内层又是较柔软的视网膜，易扭曲或剥离，角膜含大量纤维组织，眼球腔内有胶状玻璃体。根据眼球的特点，其制样难度极大，经过多年的探索，作者参考了国内外文献[1～4]，在制样过程中采取了相应的方法，获得了满意的结果，现报道如下：
2 材料和方法
2.1 材料
将大白鼠麻醉或断头后，立即摘去眼球，并保留视神经，其过程在2 min之内完成。
, 百拇医药
2.2 方法
2.2.1 取材与预固定 将摘出的眼球用0.1 M磷酸缓冲液(pH7.2～7.4)洗净表面的血液，立即浸入4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液中，用4号针头沿赤道部将眼球打一小孔，将针头轻轻退出约1 mm，用空针缓缓推入预固定液，在预固定12 h后，沿赤道部将眼球割成二半，分别取出各种组织，组织切成1 mm3大小，继续固定2 h，然后用3%EDTA-Na2软化20 min。
2.2.2 清洗 0.1M磷酸缓冲液反复清洗5次，每次10～20 min，并浸泡过夜。
2.2.3 后固定 1%四氧化锇固定液固定2 h(4 ℃)。
2.2.4 脱水 用30%、50%、70%的丙酮各脱水5～10 min(4℃)，90%的丙酮脱水10～15 min(室温)，100%丙酮脱水40 min(换三次)。
, 百拇医药
2.2.5 浸透 用Epon812包埋液+丙酮(3∶1)浸泡45 min(35 ℃)；纯Epon812包埋液浸泡2 h(45 ℃)。
2.2.6 包埋 将经以上步骤处理的样品，放置定向包埋模具中，方向应为保持所需眼组织的全层结构为准。加入新鲜的Epon812包埋液，使组织完全浸泡于包埋液中。
2.2.7 聚合 在45 ℃下聚合10 h，在60 ℃下聚合12 h。
2.2.8 修块、半薄切片、超薄切片、染色 按常规进行，H600-Ⅳ型透射电镜观察。
3 结果与结论
3.1 结果
用该方法制备的样品，包埋块硬度适当，无过硬过脆现象，在切片过程中，切片韧性较好，切片厚度可达500～600 nm，切片颜色为浅黄色，无散片现象，包埋液浸透良好。
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超薄切片在电镜下观察，各种组织的超微结构清晰可见，如视网膜中的各层组织，角膜上皮组织，虹膜组织等。在视网膜色素上皮细胞中可见，细胞核、色素颗粒、线粒体。角膜上皮细胞中可见细胞核、核仁、粗面内质网、线粒体、微丝等，胞间可见桥粒。其超微结构保存良好(图1、2)。
图1 透射电镜下示视网膜色素上皮细胞，细胞中线粒体(Mi)、内质网(ER)、细胞核(N)及色素颗粒(↑)等细胞器清晰可见。EM×8000
Fig 1 Retinal pigmented epithelial cell，The mitochondria (Mi),endoplasmic reticulum (ER)，nucleus(N),melanosome(↑) and other organells in the cell are clearly shown.EM×8000
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图2 透射电镜下示角膜上皮细胞，细胞中可见细胞核(N)、内质网(ER)、线粒体(Mi)及微丝(MF)等细胞器，细胞间可见桥粒(De)。EM×12,000
Fig 2 Corneal epithelium，There are distinet nucleus(N),endoplasmic reticulum(ER),mitochondria(Mi),microfilament(MF),intercellular desmosome(De) and other organells.Em×12,000
3.2 讨论
取材与预固定是眼组织透射电镜制样的关键，我们采用的沿赤道部位打孔的方法，可使内腔的压力降低，可以使预固定液充满眼球内腔，使内层组织固定充分，又可防止视网膜组织的卷曲或脱落。取材时不应将视神经保留，这样对二次取材确定组织的方位有所帮助。操作时应注意取材时应尽快将其浸入固定液，以防止出现细胞自溶现象，整个操作应动作轻，切忌损伤视网膜。对含有大量纤维的角膜可采取3%EDTA-Na2软化，对切片质量及组织反差都有所提高。固定液应采用4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液，该固定液的穿透力较单纯戊二醛固定液强，特别对有致密的结缔组织固定较好。脱水应根据不同的组织而定时间，如视网膜组织脱水时间应相应缩短，以防止过度脱水，组织扭曲变形变脆，如角膜组织含有大量纤维组织，其脱水时间应适当延长，以保证脱水充分。包埋液浸透应适当延长浸透时间，勤搅动，用以保证浸透充分。
, 百拇医药
参考文献
1 罗清礼.视网膜色素变性的色素上皮细胞光镜和电镜观察.眼底病，1991；7∶150
2 Itoi M, Kodama R, Tokayama S. Ultrastructural observation of typical gap junctions in human foetal lens nucleus. Curr Eye Res，1991; 10∶1
3 Vinuesa MJ， Hernandez-Galiea E, Barahona JM. Ultrastracture study of Schlemm's canal-trabecular mashwork in traumatic galucoma. Chibret Int J Ophthalmol, 1990; 7(2)∶17
4 Tousimis AJ， Fine BS. Ultrastructure of the iris: an electron microscopic study. Am J Opthalmol, 1959; 48∶397
收稿：1998-04-10, http://www.100md.com