转化人胚腱细胞在PLA和PLGA表面上的粘附特性研究
作者：秦廷武 解慧琪 杨志明 秦 建 蔡绍皙 徐世荣
单位：(秦廷武 解慧琪 杨志明)华西医科大学 附属第一医院 骨科，成都 610041(秦 建 蔡绍皙 徐世荣)重庆大学 生物工程学院，重庆 400044
关键词：转化人胚腱细胞；聚乳酸；聚乳酸与羟基乙酸共聚物；粘附
生物医学工程学杂志990208 摘要 为了定量研究转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA 85/15)表面上的粘附特性，我们采用微管吸吮技术测定了单个THETC与PLA膜(平均厚度18.6 μm)和PLGA85/15膜(平均厚度17.3 μm)表面的粘附力学特性。结果显示，THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面的粘附率和粘附力明显大于膜表面裱衬牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)实验组，同时小于膜表面裱衬聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL)实验组，而且PLGA85/15膜更易于THETC粘附。表明BSA能抑制THETC在聚合物膜表面的粘附，而PDL能增强其粘附。提示PLGA85/15预涂PDL是一种新型的THETC贴附基。
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A Study on Adhesive Properties of Transformed Human
Embryonic Tendon Cells to PLA and PLGA
Qin Tingwu Xie Huiqi Yang Zhiming Qin Jian Cai Shaoxi Xu Shirong
Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044
, 百拇医药
Abstract To study the adhesive properties of transformed human embryonic tendon cells (THETCs) to polylactic acid(PLA) and polylactic-co-glycolic acid 85/15 (PLGA 85/15), the adhesive mechanical properties of single THETCs to PLA films (average thickness 18.6 μm) and PLGA 85/15 films (average thickness 17.3 μm) were measured by means of micropipet aspirating technique. The rsults showed that the attachment rate and adhesive force for two polymer groups(PLA precoated with bovine serum albumin (BSA) and PLGA 85/15 precoated with BSA) were significantly lower than those for two control groups(PLA and PLGA 85/15), respectively, while the attachment rate and adhesive force for other two polymer groups (PLA precoated with poly-D-lysine (PDL) and PLGA 85/15 precoated with PDL) were significantly higher than those for two control groups, respectively, and that the adhesive properties of THETCs to PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 coated with PDL may be used as a new type attachment substrate for THETCs.
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Key words Transformed human embryonic tendon cells Polylactic acid Polylactic-co-glycolic acid Adhesion
1 前 言
肌腱组织工程研究是近年来肌腱损伤修复研究的一个热点。肌腱细胞外基质支架的研究是构建组织工程化肌腱，并最终用于临床的关键[1]。细胞外基质支架研究的重要问题是筛选出适于肌腱细胞锚着，易于肌腱细胞粘附的材料。纵观这一领域，肌腱细胞对材料的粘附性，或称肌腱细胞对材料的选择性的研究[2]已经展示出诱人的前景，但很少作定量的粘附力学特性研究。人工合成的生物可降解高分子聚合物聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚羟基乙酸(Polyglycolic acid, PGA)是美国食品和药品管理局认可的体内植入材料，目前已广泛用作组织工程化组织的胞外基质支架[3]。但PLA强度较差而PGA柔韧性欠佳，不适于作肌腱细胞外基质支架，因此本文选择了PLA及其与PGA的无规共聚物—聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA85/15)，采用微管吸吮技术(Micropipet aspirating technique)，探讨了转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在PLA和PLGA85/15材料表面上的粘附力学特性，试图阐明THETC与PLA和PLGA的表面相容性。
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2 材料与方法
2.1 试剂与器材
丙酮(分析纯，重庆东方试剂厂)。聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL, Sigma Co.)和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA, BOEHRI-
NGER MANNHEIM Co.)分别制成2 μg/ml和50 μg/ml溶液。聚乳酸(Poly-DL-Lactide, Sigma Co.)、聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Poly-DL-Lactide-co-Glycolide 85/15, Sigma Co.)。微管吸吮技术实验系统包括微管拉制器(Sutter Instrument Co.)、显微操作系统(Opton Co.)、数据处理系统(Vidas 21, Kontron Co.)。小腔室(Chamber,自制)，电感测微仪(Tronic TTD60,Switzer Land)等。
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2.2 细胞培养及细胞悬液制备
细胞采用本研究室已经建立的THETCs，这种细胞是采用带有潮霉素(Hygromycin B)筛选标记的SV40温度依赖性质粒ptsA58H，经电穿孔法将其导入肌腱细胞并进行潮霉素B筛选，获得阳性克隆后进行扩增得到。复苏冷冻保存的第41～49代THETCs，用含10%小牛血清(Gibco Co.)的F-12培养基(Sigma Co.)加入青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，制成pH值为7.2的完全培养液，在37℃、5%CO2条件下培养。待细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶液消化，使细胞悬浮分布均匀，按1∶2分瓶传代培养。取对数生长期的细胞(一般4～6 d)，消化离心，用不含小牛血清的F-12培养基制成1×104/ml细胞悬液，作为接种细胞待用。
2.3 聚合物薄膜的制备及其膜厚测量
分别将PLA和PLGA85/15各0.25 g溶于8 ml丙酮制成聚合物溶液。将载玻片(长76.2 mm，宽25.4 mm，厚1.1 mm)浸酸，洗净，浸于75%乙醇中消毒备用。在载玻片上制作直径约25 mm的小腔室(用20 ml一次性使用注射器外筒割制)。在离心机转头顶部放置小腔室，开动离心机(300 rpm)，在小腔室中心滴入0.3 ml聚合物溶液。溶液因离心作用而在小腔室底部载玻片上均匀铺展，形成聚合物薄膜。待有机溶剂充分挥发后，在紫外线下照射灭菌备用。用分辨率为1 μm的电感测微仪，机座用比长仪作运动导轨，对制作的聚合物薄膜进行膜厚测量。
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2.4 细胞与聚合物薄膜粘附力学测量方法
将细胞悬液接种到小腔室中的聚合物薄膜上，待细胞与材料作用15 min后，将小腔室置于显微镜载物台上。用微管拉制器将玻璃毛细管(直径1.0 mm，国产)拉成管口直径为3～8 μm的微管，充入培养液(无小牛血清)后架于微操纵器上。微管尖端插入细胞培养室中，另一端与压力系统相连。在显微镜下移动微操纵器使微管尖端靠近粘附于材料薄膜上的细胞。通过调节压力使细胞吸附于微管尖端。然后沿水平方向移动微管，开始细胞将发生变形，随着微管的移动，细胞变形增大，施加于细胞与材料接触部的力也增大。当此力等于细胞与材料间粘附力时，细胞从材料表面分开，见图1所示。细胞与材料间的切向粘附力由下式给出[4]：Fa=πR2pΔPsinθpcosθ，式中Rp为微管尖端内径，ΔP为微管内负压，θp为细胞与材料分开瞬间细胞在微管入口处细胞膜的切线方向与微管管口平面的夹角，θ为微管与材料表面的夹角。将实验过程录像并记录下压力值，整个实验过程在90 min内完成，然后通过数据处理系统回放录相带，测定Rp及θp，最后计算出细胞与膜材料的粘附力Fa。细胞粘附率定义为粘附细胞占测量细胞数的百分比，微管尖端靠近细胞时微小正压(约2mmH2O)使细胞脱离时认为此细胞为未粘附细胞。实验分三组进行，第一组实验将细胞接种于PLA膜和PLGA85/15膜上(作为对照组)；第二组实验将细胞接种于裱衬有50 μg/ml BSA的PLA膜和PLGA85/15膜上；第三组实验将细胞接种于裱衬有2 μg/ml PDL的PLA膜和PLGA85/15膜上。统计学处理用t检验。
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图1 实验过程与装置
Fig 1 Schematic diagram of the in vitro experimental process
3 结 果
(1)聚合物薄膜厚度的测定结果显示，PLA膜和PLGA85/15膜的平均厚度分别为18.6 μm和17.4 μm，PLA膜厚最大值和最小值分别为24 μm和9 μm，PLGA85/15膜厚度最大值和最小值分别为29 μm和6 μm。按本文方法获得的聚合物薄膜均匀度较好，在倒置显微镜下具有良好的透光性，便于采用微管实验系统测定细胞与薄膜的粘附特性，同时保证细胞是与材料作用，而不是与其衬底玻璃作用；
(2)THETC在PLA和PLG85/15膜上的粘附力及粘附率测定结果见表1、表2；
(3)THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附力学特性比较的统计结果见图2。
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表1 THETC在PLA薄膜上的粘附特性测定
Table 1 The adhesive properties of THETCs onto PLA films Treatment
n
Adhesive force*
(×10-8N)
Attachment
rate(%)
P
PLA(Control)
52
, 百拇医药
0.98±0.42
86%
PLA with BSA
40
0.12±0.06
50%
<0.05
PLA with PDL
28
1.50±0.61
95%
<0.05
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* x±s表2 THETC在PLGA 85/15薄膜上的粘附特性测定
Table 2 The adhesive properties of THETCs onto PLGA 85/15 films Treatment
n
Adhesive force*
(×10-8N)
Attachment
rate(%)
P
PLGA85/15(Control)
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36
1.57±0.61
89%
PLGA85/15 with BSA
36
0.10±0.04
55%
<0.05
PLGA85/15 with PDL
43
3.40±1.24
97%
, 百拇医药
<0.05
* ±s
图2 THETC与PLA膜和PLGA 85/15膜表面粘附力比较
Fig 2 Comparison of the adhesive force of THETCs onto PLA with that of THETCs onto PLGA85/15
* and ** represent sutatistically significant differences inside and between groups, respectively (P<0.05) n represents the number of cells tested
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4 讨 论
生物可降解聚合物材料用于构建组织工程化肌腱，植入体内后肌腱细胞分泌胶原的同时，支架材料不断降解，最后被机体同化成为机体的一部分，这一主导思想已越来越多地为组织工程学研究者所共识。肌腱细胞与胞外基质材料的复合取决于种植的细胞数、种植细胞粘附率、贴壁细胞的抗切应力能力。研究肌腱细胞与PLA和PLGA的粘附率和抗切应力能力，是目前应用这类支架材料急需解决的问题之一。肌腱细胞只有牢固地在材料表面粘附，才能进一步伸展、迁移、增殖直至融合，并且随着肌腱细胞和机体的协同作用，作为支架的可吸收材料被吸收，最终被同化成为自体肌腱。人胚腱细胞在体外培养传代到第13代后，细胞的增殖能力变低，不能适应体外构建组织工程化肌腱的需要[5]。通过对人胚肌腱细胞与转化人胚腱细胞(THETC)的形态、功能及生长特性等方面的研究表明，这两种细胞在正常培养条件下生长性状无差异，通过改变培养条件，可以控制THETC的生长，其增殖能力强，可长期连续传代(已传到65代)，且具有正常分泌Ⅰ型胶原的功能[6]。因此，THETC被选为组织工程化肌腱研究的标准细胞。本文采用微管吸吮技术，定量研究THETC在PLA膜和PLGA85/15膜表面的粘附力学特性，结果显示，THETC在PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附率分别为86%和89%，切向粘附力分别为0.98×10-8 N和1.57×10-8 N。用50 μg/ml BSA溶液裱衬材料表面，阻断细胞与材料的非特异性粘附，THETC与PLA和PLGA85/15表面粘附率分别下降到50%和55%，切向粘附力分别降至0.12×10-8 N和0.10×10-8 N，有显著性差异(P<0.05)。表明THETC与聚合物材料表面上的粘附主要为非特异性粘附。采用2 μg/ml PDL溶液裱衬聚合物膜表面，增大THETC与PLA和PLGA表面的粘附容量，粘附率分别增至95%和97%，粘附力分别增至1.50×10-8 N和3.40×10-8 N，显著增加(P<0.05)，表明材料表面对THETC吸附力可通过裱衬PDL进行改善。比较THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附力测定结果表明，PLGA85/15具有更好的细胞吸附性，细胞在材料上的抗切应力能力更强。因此，PLGA85/15更适于肌腱细胞粘附。不仅如此，这种共聚物具有更强的机械性能和良好的柔韧性，弥补了单纯PLA和PGA作支架材料的不足，同时中和了PLA和PGA在体内降解时间的差异[7]，使其在体内的降解速率更易于与肌腱细胞在体内分泌胶原的速率相匹配。
, 百拇医药
我们研究涉及THETC与聚合物材料的非特异性粘附。实际上，在组织工程研究中，细胞的粘附过程涉及分子之间的特异结合[8]，将一些有生理功能的活性物质固定在材料表面，使表面形成一个能与THETC相适应的特异性粘附层，将极大地影响组织与材料的粘附，这方面的研究工作正在进行。
我们测定细胞与材料粘附率时，认为在微小正压(约2 mmH2O)作用下离开材料表面的THETC是未粘附细胞。由于粘附细胞脱附压力通常都在几十毫米水柱以上，因此上述判定方法是合理的。值得说明的问题是，在材料表面上的未粘附细胞，镜下观察时与粘附细胞并无差异，然而，若用其它方法，如染色法、荧光法测细胞粘附率时，可能会误将这种未粘附细胞视为粘附细胞；通过吸出方法去除未粘附细胞，由于难于掌握吸取力度，会吸出部分已粘附的细胞，这两种情况都会造成粘附率失真的问题，显然用本文方法测定细胞粘附率避免了上述问题。实验还发现，细胞与材料的粘附力随种植时间延长而增大(另文发表)，本文结果是研究细胞种植时间在15～90 min内的细胞粘附，因此可以认为是细胞与材料相互作用的初始粘附。我们认为这种粘附是重要的，因为在生物材料体内植入中，直接也是最先与组织细胞相接触的是材料表面的初始粘附。
, 百拇医药
我们计算粘附力时，未考虑微吸管与材料表面的夹角θ，由于θ一般为12～15°，cosθ变化很小，而且由于实验结果仅用于细胞与不同材料表面粘附力的对比，故忽略cosθ的微小变化，几乎不影响实验结果的表达。
致谢：感谢国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室吴泽志、宋关斌、王红兵和黄岂平搏士对本文工作的帮助；同时感谢四川大学纺织学院叶光斗和李守群老师对本文材料制作方面的指导。
注释： 国家自然科学基金重点项目(39830100)、中国博士后科学研究基金资助课题，国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室研究课题(98G01)
参考文献
1 秦廷武，杨志明.组织工程化肌腱研究进展.中国修复重建外科杂志，1998；12(4)∶231
2 张前法，杨志明，彭文珍.免肌腱细胞和成纤维细胞与人工材料体外联合培养的形态学观察.中国修复重建外科杂志，1997；11(2)∶102
, 百拇医药
3 Kim WS, Vacanti JP, Cimer L et al. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994; 94(3)∶233
4 Bowers VM, Fisher LR, Francis GW et al. A micromechanical technique for monitoring cell-substrate adhesiveness:measurements of the strength of red blood cell adhesion to glass and polymer test surfaces. J Biomed Mater Res, 1989;23∶1453
5 项 舟，杨志明，魏大鹏等.类胰岛素生长因子1促腱细胞生长的实验研究.中华手外科杂志，1997；13(3)∶183
6 杨志明，解慧琪，项 舟等.转化人胚肌腱细胞的体外培养及生物学特性研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(2)∶99
7 李鸿凯.最新美容整形材料与用品.北京：中国科技出版社，1996∶92-93
8 秦廷武，杨志明，蔡绍皙等.组织工程中细胞与材料的粘附作用.中国修复重建外科杂志，1999；13(1)∶31
收稿：1999-01-29 修回：1999-04-01, http://www.100md.com
单位：(秦廷武 解慧琪 杨志明)华西医科大学 附属第一医院 骨科，成都 610041(秦 建 蔡绍皙 徐世荣)重庆大学 生物工程学院，重庆 400044
关键词：转化人胚腱细胞；聚乳酸；聚乳酸与羟基乙酸共聚物；粘附
生物医学工程学杂志990208 摘要 为了定量研究转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA 85/15)表面上的粘附特性，我们采用微管吸吮技术测定了单个THETC与PLA膜(平均厚度18.6 μm)和PLGA85/15膜(平均厚度17.3 μm)表面的粘附力学特性。结果显示，THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面的粘附率和粘附力明显大于膜表面裱衬牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)实验组，同时小于膜表面裱衬聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL)实验组，而且PLGA85/15膜更易于THETC粘附。表明BSA能抑制THETC在聚合物膜表面的粘附，而PDL能增强其粘附。提示PLGA85/15预涂PDL是一种新型的THETC贴附基。
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A Study on Adhesive Properties of Transformed Human
Embryonic Tendon Cells to PLA and PLGA
Qin Tingwu Xie Huiqi Yang Zhiming Qin Jian Cai Shaoxi Xu Shirong
Department of Orthopedic Surgery, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
Bioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044
, 百拇医药
Abstract To study the adhesive properties of transformed human embryonic tendon cells (THETCs) to polylactic acid(PLA) and polylactic-co-glycolic acid 85/15 (PLGA 85/15), the adhesive mechanical properties of single THETCs to PLA films (average thickness 18.6 μm) and PLGA 85/15 films (average thickness 17.3 μm) were measured by means of micropipet aspirating technique. The rsults showed that the attachment rate and adhesive force for two polymer groups(PLA precoated with bovine serum albumin (BSA) and PLGA 85/15 precoated with BSA) were significantly lower than those for two control groups(PLA and PLGA 85/15), respectively, while the attachment rate and adhesive force for other two polymer groups (PLA precoated with poly-D-lysine (PDL) and PLGA 85/15 precoated with PDL) were significantly higher than those for two control groups, respectively, and that the adhesive properties of THETCs to PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 films were better than those of THETCs to PLA films. These demonstrate that BSA can inhibit THETCs attachment to polymer, and PDL can promote THETCs attachment to polymer, and suggest that PLGA 85/15 coated with PDL may be used as a new type attachment substrate for THETCs.
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Key words Transformed human embryonic tendon cells Polylactic acid Polylactic-co-glycolic acid Adhesion
1 前 言
肌腱组织工程研究是近年来肌腱损伤修复研究的一个热点。肌腱细胞外基质支架的研究是构建组织工程化肌腱，并最终用于临床的关键[1]。细胞外基质支架研究的重要问题是筛选出适于肌腱细胞锚着，易于肌腱细胞粘附的材料。纵观这一领域，肌腱细胞对材料的粘附性，或称肌腱细胞对材料的选择性的研究[2]已经展示出诱人的前景，但很少作定量的粘附力学特性研究。人工合成的生物可降解高分子聚合物聚乳酸(Polylactic acid, PLA)和聚羟基乙酸(Polyglycolic acid, PGA)是美国食品和药品管理局认可的体内植入材料，目前已广泛用作组织工程化组织的胞外基质支架[3]。但PLA强度较差而PGA柔韧性欠佳，不适于作肌腱细胞外基质支架，因此本文选择了PLA及其与PGA的无规共聚物—聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA85/15)，采用微管吸吮技术(Micropipet aspirating technique)，探讨了转化人胚腱细胞(Transformed human embryonic tendon cells, THETCs)在PLA和PLGA85/15材料表面上的粘附力学特性，试图阐明THETC与PLA和PLGA的表面相容性。
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2 材料与方法
2.1 试剂与器材
丙酮(分析纯，重庆东方试剂厂)。聚赖氨酸(Poly-D-lysine, PDL, Sigma Co.)和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA, BOEHRI-
NGER MANNHEIM Co.)分别制成2 μg/ml和50 μg/ml溶液。聚乳酸(Poly-DL-Lactide, Sigma Co.)、聚乳酸与羟基乙酸共聚物85/15(Poly-DL-Lactide-co-Glycolide 85/15, Sigma Co.)。微管吸吮技术实验系统包括微管拉制器(Sutter Instrument Co.)、显微操作系统(Opton Co.)、数据处理系统(Vidas 21, Kontron Co.)。小腔室(Chamber,自制)，电感测微仪(Tronic TTD60,Switzer Land)等。
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2.2 细胞培养及细胞悬液制备
细胞采用本研究室已经建立的THETCs，这种细胞是采用带有潮霉素(Hygromycin B)筛选标记的SV40温度依赖性质粒ptsA58H，经电穿孔法将其导入肌腱细胞并进行潮霉素B筛选，获得阳性克隆后进行扩增得到。复苏冷冻保存的第41～49代THETCs，用含10%小牛血清(Gibco Co.)的F-12培养基(Sigma Co.)加入青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，制成pH值为7.2的完全培养液，在37℃、5%CO2条件下培养。待细胞长成单层后，用0.25%胰蛋白酶液消化，使细胞悬浮分布均匀，按1∶2分瓶传代培养。取对数生长期的细胞(一般4～6 d)，消化离心，用不含小牛血清的F-12培养基制成1×104/ml细胞悬液，作为接种细胞待用。
2.3 聚合物薄膜的制备及其膜厚测量
分别将PLA和PLGA85/15各0.25 g溶于8 ml丙酮制成聚合物溶液。将载玻片(长76.2 mm，宽25.4 mm，厚1.1 mm)浸酸，洗净，浸于75%乙醇中消毒备用。在载玻片上制作直径约25 mm的小腔室(用20 ml一次性使用注射器外筒割制)。在离心机转头顶部放置小腔室，开动离心机(300 rpm)，在小腔室中心滴入0.3 ml聚合物溶液。溶液因离心作用而在小腔室底部载玻片上均匀铺展，形成聚合物薄膜。待有机溶剂充分挥发后，在紫外线下照射灭菌备用。用分辨率为1 μm的电感测微仪，机座用比长仪作运动导轨，对制作的聚合物薄膜进行膜厚测量。
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2.4 细胞与聚合物薄膜粘附力学测量方法
将细胞悬液接种到小腔室中的聚合物薄膜上，待细胞与材料作用15 min后，将小腔室置于显微镜载物台上。用微管拉制器将玻璃毛细管(直径1.0 mm，国产)拉成管口直径为3～8 μm的微管，充入培养液(无小牛血清)后架于微操纵器上。微管尖端插入细胞培养室中，另一端与压力系统相连。在显微镜下移动微操纵器使微管尖端靠近粘附于材料薄膜上的细胞。通过调节压力使细胞吸附于微管尖端。然后沿水平方向移动微管，开始细胞将发生变形，随着微管的移动，细胞变形增大，施加于细胞与材料接触部的力也增大。当此力等于细胞与材料间粘附力时，细胞从材料表面分开，见图1所示。细胞与材料间的切向粘附力由下式给出[4]：Fa=πR2pΔPsinθpcosθ，式中Rp为微管尖端内径，ΔP为微管内负压，θp为细胞与材料分开瞬间细胞在微管入口处细胞膜的切线方向与微管管口平面的夹角，θ为微管与材料表面的夹角。将实验过程录像并记录下压力值，整个实验过程在90 min内完成，然后通过数据处理系统回放录相带，测定Rp及θp，最后计算出细胞与膜材料的粘附力Fa。细胞粘附率定义为粘附细胞占测量细胞数的百分比，微管尖端靠近细胞时微小正压(约2mmH2O)使细胞脱离时认为此细胞为未粘附细胞。实验分三组进行，第一组实验将细胞接种于PLA膜和PLGA85/15膜上(作为对照组)；第二组实验将细胞接种于裱衬有50 μg/ml BSA的PLA膜和PLGA85/15膜上；第三组实验将细胞接种于裱衬有2 μg/ml PDL的PLA膜和PLGA85/15膜上。统计学处理用t检验。
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图1 实验过程与装置
Fig 1 Schematic diagram of the in vitro experimental process
3 结 果
(1)聚合物薄膜厚度的测定结果显示，PLA膜和PLGA85/15膜的平均厚度分别为18.6 μm和17.4 μm，PLA膜厚最大值和最小值分别为24 μm和9 μm，PLGA85/15膜厚度最大值和最小值分别为29 μm和6 μm。按本文方法获得的聚合物薄膜均匀度较好，在倒置显微镜下具有良好的透光性，便于采用微管实验系统测定细胞与薄膜的粘附特性，同时保证细胞是与材料作用，而不是与其衬底玻璃作用；
(2)THETC在PLA和PLG85/15膜上的粘附力及粘附率测定结果见表1、表2；
(3)THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附力学特性比较的统计结果见图2。
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表1 THETC在PLA薄膜上的粘附特性测定
Table 1 The adhesive properties of THETCs onto PLA films Treatment
n
Adhesive force*
(×10-8N)
Attachment
rate(%)
P
PLA(Control)
52
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0.98±0.42
86%
PLA with BSA
40
0.12±0.06
50%
<0.05
PLA with PDL
28
1.50±0.61
95%
<0.05
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* x±s表2 THETC在PLGA 85/15薄膜上的粘附特性测定
Table 2 The adhesive properties of THETCs onto PLGA 85/15 films Treatment
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Adhesive force*
(×10-8N)
Attachment
rate(%)
P
PLGA85/15(Control)
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1.57±0.61
89%
PLGA85/15 with BSA
36
0.10±0.04
55%
<0.05
PLGA85/15 with PDL
43
3.40±1.24
97%
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<0.05
* ±s
图2 THETC与PLA膜和PLGA 85/15膜表面粘附力比较
Fig 2 Comparison of the adhesive force of THETCs onto PLA with that of THETCs onto PLGA85/15
* and ** represent sutatistically significant differences inside and between groups, respectively (P<0.05) n represents the number of cells tested
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4 讨 论
生物可降解聚合物材料用于构建组织工程化肌腱，植入体内后肌腱细胞分泌胶原的同时，支架材料不断降解，最后被机体同化成为机体的一部分，这一主导思想已越来越多地为组织工程学研究者所共识。肌腱细胞与胞外基质材料的复合取决于种植的细胞数、种植细胞粘附率、贴壁细胞的抗切应力能力。研究肌腱细胞与PLA和PLGA的粘附率和抗切应力能力，是目前应用这类支架材料急需解决的问题之一。肌腱细胞只有牢固地在材料表面粘附，才能进一步伸展、迁移、增殖直至融合，并且随着肌腱细胞和机体的协同作用，作为支架的可吸收材料被吸收，最终被同化成为自体肌腱。人胚腱细胞在体外培养传代到第13代后，细胞的增殖能力变低，不能适应体外构建组织工程化肌腱的需要[5]。通过对人胚肌腱细胞与转化人胚腱细胞(THETC)的形态、功能及生长特性等方面的研究表明，这两种细胞在正常培养条件下生长性状无差异，通过改变培养条件，可以控制THETC的生长，其增殖能力强，可长期连续传代(已传到65代)，且具有正常分泌Ⅰ型胶原的功能[6]。因此，THETC被选为组织工程化肌腱研究的标准细胞。本文采用微管吸吮技术，定量研究THETC在PLA膜和PLGA85/15膜表面的粘附力学特性，结果显示，THETC在PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附率分别为86%和89%，切向粘附力分别为0.98×10-8 N和1.57×10-8 N。用50 μg/ml BSA溶液裱衬材料表面，阻断细胞与材料的非特异性粘附，THETC与PLA和PLGA85/15表面粘附率分别下降到50%和55%，切向粘附力分别降至0.12×10-8 N和0.10×10-8 N，有显著性差异(P<0.05)。表明THETC与聚合物材料表面上的粘附主要为非特异性粘附。采用2 μg/ml PDL溶液裱衬聚合物膜表面，增大THETC与PLA和PLGA表面的粘附容量，粘附率分别增至95%和97%，粘附力分别增至1.50×10-8 N和3.40×10-8 N，显著增加(P<0.05)，表明材料表面对THETC吸附力可通过裱衬PDL进行改善。比较THETC与PLA膜和PLGA85/15膜表面粘附力测定结果表明，PLGA85/15具有更好的细胞吸附性，细胞在材料上的抗切应力能力更强。因此，PLGA85/15更适于肌腱细胞粘附。不仅如此，这种共聚物具有更强的机械性能和良好的柔韧性，弥补了单纯PLA和PGA作支架材料的不足，同时中和了PLA和PGA在体内降解时间的差异[7]，使其在体内的降解速率更易于与肌腱细胞在体内分泌胶原的速率相匹配。
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我们研究涉及THETC与聚合物材料的非特异性粘附。实际上，在组织工程研究中，细胞的粘附过程涉及分子之间的特异结合[8]，将一些有生理功能的活性物质固定在材料表面，使表面形成一个能与THETC相适应的特异性粘附层，将极大地影响组织与材料的粘附，这方面的研究工作正在进行。
我们测定细胞与材料粘附率时，认为在微小正压(约2 mmH2O)作用下离开材料表面的THETC是未粘附细胞。由于粘附细胞脱附压力通常都在几十毫米水柱以上，因此上述判定方法是合理的。值得说明的问题是，在材料表面上的未粘附细胞，镜下观察时与粘附细胞并无差异，然而，若用其它方法，如染色法、荧光法测细胞粘附率时，可能会误将这种未粘附细胞视为粘附细胞；通过吸出方法去除未粘附细胞，由于难于掌握吸取力度，会吸出部分已粘附的细胞，这两种情况都会造成粘附率失真的问题，显然用本文方法测定细胞粘附率避免了上述问题。实验还发现，细胞与材料的粘附力随种植时间延长而增大(另文发表)，本文结果是研究细胞种植时间在15～90 min内的细胞粘附，因此可以认为是细胞与材料相互作用的初始粘附。我们认为这种粘附是重要的，因为在生物材料体内植入中，直接也是最先与组织细胞相接触的是材料表面的初始粘附。
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我们计算粘附力时，未考虑微吸管与材料表面的夹角θ，由于θ一般为12～15°，cosθ变化很小，而且由于实验结果仅用于细胞与不同材料表面粘附力的对比，故忽略cosθ的微小变化，几乎不影响实验结果的表达。
致谢：感谢国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室吴泽志、宋关斌、王红兵和黄岂平搏士对本文工作的帮助；同时感谢四川大学纺织学院叶光斗和李守群老师对本文材料制作方面的指导。
注释： 国家自然科学基金重点项目(39830100)、中国博士后科学研究基金资助课题，国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室研究课题(98G01)
参考文献
1 秦廷武，杨志明.组织工程化肌腱研究进展.中国修复重建外科杂志，1998；12(4)∶231
2 张前法，杨志明，彭文珍.免肌腱细胞和成纤维细胞与人工材料体外联合培养的形态学观察.中国修复重建外科杂志，1997；11(2)∶102
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3 Kim WS, Vacanti JP, Cimer L et al. Cartilage engineered in predetermined shapes employing cell transplantation on synthetic biodegradable polymers. Plast Reconstr Surg, 1994; 94(3)∶233
4 Bowers VM, Fisher LR, Francis GW et al. A micromechanical technique for monitoring cell-substrate adhesiveness:measurements of the strength of red blood cell adhesion to glass and polymer test surfaces. J Biomed Mater Res, 1989;23∶1453
5 项 舟，杨志明，魏大鹏等.类胰岛素生长因子1促腱细胞生长的实验研究.中华手外科杂志，1997；13(3)∶183
6 杨志明，解慧琪，项 舟等.转化人胚肌腱细胞的体外培养及生物学特性研究.中国修复重建外科杂志，1999；13(2)∶99
7 李鸿凯.最新美容整形材料与用品.北京：中国科技出版社，1996∶92-93
8 秦廷武，杨志明，蔡绍皙等.组织工程中细胞与材料的粘附作用.中国修复重建外科杂志，1999；13(1)∶31
收稿：1999-01-29 修回：1999-04-01, http://www.100md.com